行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
明膠軟骨透明質酸三重聚合物支架進行齒芽組織工程
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC93-2313-B-002-105- 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學獸醫學系暨研究所 計畫主持人： 郭宗甫 計畫參與人員： 陳敏慧、章浩宏、林峰輝、黃安婷、陳香松、羅晞文、莊雅玲、 王月桂 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 94 年 10 月 31 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫
■成果報告 □期中進度報告
明膠軟骨素透明質酸三重聚合物支架進行齒芽組織工程
Gelatin-Chondroitin-Hyaluronan Tri-copolymer Scaffold for
Dental Bud Tissue Engineering
計畫類別： ■個別型計畫 □整合型計畫 計畫編號：NSC 93-2313-B002-105- 執行期間：93 年 8 月 1 日至 94 年 7 月 31 日 計畫主持人：郭宗甫 共同主持人：無 計畫參與人員：陳敏慧、章浩宏、林峰輝、黃安婷、陳香松、羅晞文、莊雅玲、 王月桂 成果報告類型（依經費核定單規定繳交）：□精簡報告 ■ 完整報告 本成果報告包括以下應繳交之附件： □赴國外出差或研習心得報告一份 □赴大陸地區出差或研習心得報告一份 □出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份 □國際合作研究計畫國外研究報告書一份 處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管計畫 及下列情形者外，得立即公開查詢 □涉及專利或其他智慧財產權，□一年□兩年後可公開查詢 執行單位：國立台灣大學獸醫學系暨研究所 中華民國 94 年 10 月 31 日
中文摘要：
牙周疾病、齲齒、撞傷或基因失調而造成牙齒缺損，一直是許多人和動物生 活中極大的困擾，若能發展出生物性的牙齒再生取代缺損的牙齒將是臨床治療的 一種新方法。本研究之目的乃是利用組織工程的方法達成牙齒的再生。取 1.5 個 月齡迷你猪，將未萌發臼齒以外科手術取下，放入 30 m1 含 1.5 % PC/ST (Penicillin /streptomycin)之DMEM (Dulbecco´s modified eagle medium)中於 4℃保存。其後分 離臼齒中的牙胚組織，以 1X PBS（Phosphate buffer saline）液清洗乾淨後切碎成 ＜1 mm3的小片段，於含 1.5 % PC/ST及 20 % FCS之DMEM中 37℃,5 ％ CO 2培 養。培養 3 星期使細胞數達 1×107個。將培養的齒芽細胞種入明膠-軟骨素-透明 質酸三重聚合物支架內培養一週。實驗組將含有細胞/支架埋入同源猪原齒槽骨 內及下顎骨骨質中；兔子則埋入末端肋軟骨之皮下，並取部分細胞/支架以 10 ％ 中性福馬林及 2.5 ％戊二醛固定分別製作組織切片、進行環境掃瞄式電子顯微鏡 掃瞄，可見細胞於支架中的生長情形。植入 24 及 36 週以X光放射線照影評估牙 齒生長情形，並於 36 週犧牲猪隻及兔子以組織切片評估；對照組為取其臼齒後 不種入細胞/支架者 6 隻，及取臼齒組織後僅中入不含細胞的支架之猪隻 3 頭。6 頭植入細胞/支架的猪隻，3 頭在原齒槽骨出現放射不透明區域，而 3 頭在X光放 射線照影則無任何發現。3 頭在原齒槽骨出現放射不透明區域的猪隻，其中一頭 可見約 1×0.5×0.5 ㎝3牙齒萌發於口腔外；一頭則在齒槽骨內可見牙齒鈣化型態； 另一頭則是出現直徑 1 ㎝的放射線不透明區域。萌發的牙齒進行H&E染色可見 Dentin/pulp-like complex之牙齒相關結構出現，而Goldner's及免疫化學等染色則 在進行中。兔子再生猪牙齒試驗上則無任何發現。對照組取牙齒組織相對位置都 無牙齒生長。本研究證實可由組織工程的方法達成牙齒再生，也證實牙齒幹細胞 存於牙髓組織中。 關鍵字：齒芽細胞、支架、組織工程、牙齒再生。 英文摘要：
Tooth lost due to periodontal disease, dental caries, trauma,or varieties of genetic disorders continuing to affect human and animalsadversely at some time in their lives. A biological regenerated tooth could replace lost tooth, the new substituted tooth would provide a vital alter-nativeto currently available clinical treatments. For this purpose, we used a tissue engineering approachto research the tooth regeneration. Using surgical operation to remove 1.5 month-old miniature pig molartooth before eruption and placedinto 30 mL of DMEM (Dulbecco´s modified eagle medium)+1.5 ％ PC /ST (Penicillin/streptomycin) at 4°C.Dental bud tissues were washed by 1X in PBS（Phosphate buffer saline）, minced into < 1mm3 pieces, and then cultured in DMEM +1.5 ％ PC /ST + 20 % FCS at 37℃ with 5 ％ CO2. After 3 weeks cell
Tri-copolymer scaffold. Cultured for one week, dental stem cells were migrated into and attached the scaffold. The cell/scaffold constructs were implanted in both autograft into pig and xenograft into rabbit. In addition, a piece of little cell/scaffold sample was fixed individually with 10 ％ neutral formalin and 2.5 ％ glutaraldehyde, and then growing cells were demonstrated in scaffold by histological section analysis and Environmental Scanning Electron Microscope (ESEM) individually. In experimental groups: 6 pigs were implanted with cells/scaffold (C/S) into original alveolus, rabbits were implanted with C/S into subcutaneous tissue near the end costal cartilage. Aftergrowing in pigs and rabbits for 24 and 36 weeks, There were regenerated growing teeth could found in 3 pigs by X ray examination, especially a recognizable1×0.5×0.5 ㎝3 size tooth formed in swine alveolus bone by evaluated with radiography, but the other 3 pigs were no found. In rabbit we did not saw anything-like tooth in original implanted place. There was a tooth containing dentin/pulp-like complex tooth structure was appeared by hematoxylin and eosin staining in histological analysis. In control groups: removed molar tooth but did not implanted cell/scaffold 6 pigs group and merely implanted scaffold 3 pigs group. Aftergrowing for 24 and 36 weeks in pigs, no any regenerated tooth was grown in original place. Our results demonstrated regeneration of tooth structures could achieved by apply tissue engineering technique and suggestedthat dental stem cells appearance in dental pulp tissues.
目錄
中文摘要……….Ⅰ 英文摘要………. Ⅰ-Ⅱ 前言……….1 研究目的………...1 文獻探討……….2 研究方法……….2-6 結果……….6-20 討論與結論……….21-22 參考文獻……….22-25 計畫成果自評……….25-26前言：
牙齒形成起始於口腔上皮來源的牙齒層細胞 (Dental laminas cell)，在牙 齒 層 細 胞 的 初 步 分 子 訊 息 中 包 括 發 育 過 程 中 之 上 皮 (Epithelium) 及 間 葉 (Mesenchyma)組織之間相互訊息傳導 (Jernvall and Thesleff, 2000; Peters and Balling, 1999; Sadler, 2003)。牙齒發育期間，牙齒間葉細胞分化為牙髓 (Dental pulp) ， 而 上 皮 內 層 細 胞 則 形 成 齒 質 (Dentin) 的 成 齒 質 細 胞 (Odontoblast)，上皮外層細胞形成牙釉質母細胞(Ameloblast)進而形成牙釉質 (Enamel)，最後由各種因子的調控成牙齒結構(Peters and Balling, 1999)。數 十年來，學者一直試圖以組織工程方式製造出牙齒，包括在體外以牙胚培育牙齒 的生長 (Glasstone, 1967; Glasstone, 1936) 或是在體內不同的位置使牙齒生 長 (Koyama et al., 2003; Mooney et al., 1996)。組織再生工程的突破與發 展仍需致力於研究細胞的生長過程，但這一方面的研究仍停留在初期階段，要使 之達到成功的境界，仍有賴針對細胞之間的互動加以探討並研發合適的支架 （Scaffold）材料 (Solchaga et al., 2001)。Young等人的生物可解性支架材 料製造方法是根據過去用以製造小腸使用的生物材料設計法 (Choi and Vacanti, 1997; Duailibi et al., 2004)，將牙齒組織取下的細胞放入支架，再將支架植 入動物體內 (Duailibi et al.,2004, Young et al., 2002)，其結果可形成完 整的牙冠組織。
Stem cell (幹細胞)、訊號傳遞 (Singal)及支架為再生醫學的三大要素基 礎 (Iohara et al., 2004)。牙髓包括 Progenitor/stem cell (生成前質/幹細 胞)可增殖且分化形成 Dentin 前之 Odontoblast (Gronthos et al., 2002)。 Morphogens 為細胞外的分泌訊號，管制上皮和間葉組織間牙齒形態的發生
(Nakashima and Reddi, 2003; Thesleff and Sharpe, 1997)。另一方面細胞的
生長也需要細胞外基質的支撐，而在細胞外基質形成前可使用支架來提供細胞生 長及貼附，並在植入動物體內的同時將細胞固定於同一位置。
目前已有學者利用組織工程方法製造齒槽骨及重建修復由腫瘤、蛀牙或牙周 病所造成的口腔病變 (Abukawa et al., 2003; Miller et al., 2000)。另一方 面，也有學者在組織工程突破性的以生物性牙齒成功的在大鼠體內生成完整牙冠 並準確的形成 Enamel、Dentin 及牙齒相關組織 (Duailibi et al., 2004; Young
et al., 2002)。 研究目的： 牙周疾病、蛀牙、撞傷或病變造成牙齒缺損。牙齒缺損可能改變其他牙齒的 活動、咀嚼困難及缺乏個人自信心。現今有幾個方法放回牙齒，包括：使用假牙、 橋接及植入物等，都為非生物技術且沒有一種是安全無憂的。若能發展生物性的 牙齒再生以取代缺損的牙齒，將牙齒永久放回原先位置為一種令人滿意的治療方 式。本實驗之研究目的是利用組織工程達成牙齒再生。
文獻探討：
牙齒形成起始於外胚層衍生的上皮組織及來自神經脊的間葉組織 (Modino and Sharpe, 2005; Nakashima and Reddi , 2003; Ohazama et al., 2004）。 這些過程由增厚的口腔上皮形成牙齒層細胞 (Dental lamina)，深入間葉組織形 成 齒 芽 (Bud) 階 段 ， 其 後 進 一 步 向 下 形 成 齒 帽 (Cap) 及 齒 鐘 (Bell) 階 段
(Nakashima and Reddi ,2003)。圍繞在牙齒上皮的間葉組織形成牙乳突 (Dental
papilla)，向上分化為牙髓及牙本質母細胞 (Odontoblast)。Bell 階段之 Odotoblasts 形成齒質 (Dentin)，而牙釉質母細胞 (Ameloblasts)形成牙釉質 (Enamel)。牙齒周圍間葉細胞可形成牙釉質器官，包括牙濾泡及延伸至周圍的上 皮組織 (Nakashima and Reddi, 2003)。最後牙冠形成完整時牙齒萌發突出口腔
齒齦 (Thesleff and Sharpe, 1997)。生物可解性高分子支架可提供細胞生長、
貼附，並在植入動物體內的同時將細胞固定於同一位置 (Changa et al.,
2003)。本實驗所使用的支架材料由明膠 (Gelatin)、軟骨素 (Chondroitin)、 透明質酸 (Hyaluronan)三重聚合物所組成。明膠有助於細胞的生長、貼附及維 持細胞活性；軟骨素促進細胞分泌 Proteoglycan 和 Type Ⅱ collagen；透明質 酸有助於細胞遷移作用並使細胞在支架中均勻分布 (Changa et al., 2003)。 組織工程涉及各種領域，經由植入體外生長的細胞/組織或刺激細胞生長產 生細胞外基質來研究組織的再生作用及恢復器官的功能 (Nakashima et al., 2005)。在可見的未來組織工程為一強大的方法來修復組織或器官 (Zhang et al., 2005)。學者在牙齒組織工程突破性的以生物性牙齒成功的在大鼠體內生成完整 牙冠並準確的形成 Enamel、Dentin 及牙齒相關組織 (Duailibi et al.,2004; Young et al., 2002, 2005)。 研究方法： (一)牙胚細胞培養：外科手術由下顎骨為萌發的臼齒取出的牙胚組織切碎成小於 1 ㎜3
，培養於Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) (BIO T 043，進偕 ®，USA)+1.5 ％ Penicillin/streptomycin 100 100X (PC /ST) (BIO A 2213， 進偕®，USA)+ 20 % Fetal calf serum (FCS) (BII 04-001-1A，進偕®，USA) 約三週，使細胞量達 1×106 ； (二)細胞種入支架：將培養的牙胚細胞種入支架內 約一週，使細胞生長並均勻分布於支架中；(三)植入動物方式：將含有細胞的支 架埋入同源猪的口腔原齒槽內及咬肌面骨質中；兔子則植入末端肋軟骨皮下；(四) 術後評估：植入 24 及 36 週以放射線照影評估牙齒生長情形，一年後犧牲以組織 切片評估牙齒發育情形。牙齒組織進行組織染色，包括：H&E及Goldner's染色等。 而 牙 釉 質 特 有 的 Amelogenin 及 齒 質 特 有 的 Bone sialoprotein 亦 將 利 用 Vectnstain ABC kit進行免疫組織化學分析。
一. 實驗動物分組 1.猪隻分組：
胞/支架自體植入已清除整個未萌發臼齒達四週之齒槽及咬肌面骨質中，第二組 猪隻有 3 頭，只在原先已清除整個未萌發臼齒之槽直接植入支架（不種牙胚細胞 之支架），第三組之猪有 6 頭，由下顎齒槽取出未萌發臼齒的牙齒組織之後，就 不再種入牙胚細胞或支架。第二及第三組作為對照組。 2.兔子分組： 所使用之兔子為 14 頭。分為 6 組，每組分別異體異種植入 6 頭猪隻之牙胚細胞/ 支架於末端肋骨之皮下（劍狀軟骨向上約 0.5-1 ㎝位置之左側或右側）。 二. 明膠軟骨素透明質酸三重聚合物支架大小 明膠軟骨素透明質酸三重聚合物支架的大小為 1×1×1.5 ㎝之長方體。將此支架切 成大小接近相等的三個部分，分別植入猪隻原齒槽骨、原齒槽骨下方之下顎骨咬 肌面骨質中及兩隻兔子末端肋軟骨之皮下（劍狀軟骨上方約 0.5-1 ㎝位置之左 側或右側）。種入細胞的支架植入原猪隻佔的的比例為 2/3，而每隻兔子的比例 則為 1/6。 三. 手術及麻醉 1.猪隻手術及麻醉：
猪隻先禁食約 8-12 小時後，以Atropine (Atropine sulfate®
,Tai yu, Taiwan) 0.07-0.09 mg/Kg i.m.抑制唾液腺分泌及嘔吐現像，避免麻醉過程造成吸入性 肺炎。麻醉前給藥注射Tiletamine 和Zolezepm 1：1 之混合液 (Zoletil®
，維克 法蘭斯股份有限公司，法國)0.55-0.8 mg/Kg i.m.，使猪隻鎮靜並達淺層麻醉 狀態。猪達鎮靜後慢慢給於Thiamylal (Citosol® ，杏林新生製藥股份有限公司， 中華民國) 1.11-1.66 mg/kg i.v.達深層麻醉。術後給予抗生素Cephalosorin (Cephazolin，信東生技股份有限公司，中華民國) 3 mg/Kg i.m.預防二次性細 菌感染。 分為三個時期進行
A.約 1.5 月齡迷你猪先禁食約 8-12 小時後，以Atropine sulfate®
0.07-0.09 mg/Kg i.m.抑制唾液腺分泌及嘔吐現像，避免麻醉過程造成吸入性肺炎及窒息 死亡。麻醉前給藥注射Zoletil® 0.55-0.8 mg/Kg i.m.，使猪隻鎮靜並達淺層 麻醉狀態。猪隻麻醉後以左側或右側躺位置並將下顎向上抬高傾斜約 30 度角 以 0.06 sec、46~50 kv、150 mA進行X光放射線照影，確認未萌發臼齒相對位 置。其後給於Thiamylal 1.11-1.66 mg/kg i.v.達深層麻醉。在猪隻麻醉後， 於手術部位的下顎咬肌面（由嘴角後緣至耳朵基部，上至下眼窩下至頸部）進 行剃毛、刷洗，再以優點消毒術部。手術部位舖上洞巾，並在術部給予局部麻 醉劑Lidocaine (ORA®
,Showa yakuhin kako co.,Ltd., Japan)2.0 mg/kg減輕 疼痛。由未萌發臼齒相對位置之下顎咬肌面前緣至後緣以手術刀劃開皮膚及肌 肉。向下翻開咬肌露出下顎骨，以骨鑿子在未萌發臼齒齒槽外側方挖洞。移除 骨組織後可見牙胚組織，將牙胚組織取下放入含 1.5 ％ PC/ST之DMEM中。其 後將相對位置之肌肉及皮膚進行縫合即可。
，並在齒槽骨下方之咬肌面骨組織鑿一個洞也將種入牙胚細胞/支架植入此處。 C.牙胚細胞/支架植入猪隻後，經 24 及 36 週各以 0.06 sec、60~70 kv、150 mA 進行X光放射線照影評估牙齒生長情形。其後以Citosol® 給予過量進行安樂 死。猪隻安樂死後，取下整個下顎骨再進行一次X光放射線照影確定牙齒是否 有生長。生長的牙齒組織以 10 ％中性福馬林進行固定，其後以組織學方法評 估之。 2.兔子手術及麻醉： 約一月齡之紐西蘭白兔禁食約 8-12 小時後，麻醉前須先以Atropine sulfate® 0.2-1 mg/kg i.m.，抑制唾液分泌及嘔吐現像，避免麻醉過程造成吸入性肺炎 及窒息死亡。。其後依美國實驗動物學會推薦之 ketamine (Ketalar® ， 派德 股 份 有 限 公 司 ， 中 華 民 國 )35 mg/kg 及 Xylazine(Chanzine® , Chanelle pharmaceuticals manufacturing Ltd., USA)混合後 5 mg/kg i.m.進行麻醉。 兔子手術過程： 分為兩個時期進行 A. 紐西蘭白兔如上進行麻醉後，先以電剪在胸部左右兩側進行剃毛，其後進行 刷洗再以優點消毒術部。覆蓋上洞巾，確定劍狀軟骨相對位置，向上約 0.5 -1.0 cm 處開約 1 ㎝大小傷口。傷口向下進行鈍剝，將肋間肌剝開後以止血 鉗撐開植入猪牙胚細胞/支架。其後縫合皮下及皮膚即可。 B.牙胚細胞/支架異體異種植入紐西蘭白兔體內，經 24 及 36 週各以 0.06 sec、 44~45 kv、150 mA 進行 X 光放射線照影確定牙齒是否有生長。其後以 ketamine 35 mg/kg 混合 Xylazine 5 mg/kg i.m給於過量進行安樂死。兔子安樂死後， 取下整個胸部肌肉以 10 ％中性福馬林進行固定，其後以組織學方法評估之。 四.材料與方法 1.牙胚細胞培養液之配製： 使用的培養基為DMEM，將DMEM粉末以二次蒸餾水依比例混合配置後，在每公升 DMEM中加入 3.7 g NaHCO3，之後再以PH儀將PH值調製 7.2-7.4。配置完成後於 無菌操作台內以 0.22μm過濾膜接上真空幫浦進行過濾，其後加入 20％ FCS 及 1.5％ PC/ST。
2.Phosphate Buffered Saline (PBS)溶液之配製：
一公升的二次蒸餾水中加入Na2HPO4 10.9 g、NaH2PO4 3.2 g及NaCl 90 g混合均 勻後將PH值以PH儀調至 7.2，此PBS為 10 倍濃度。使用時以二次蒸餾水 1:10 稀釋並且將PH值調至 7.2。10 或 1 倍的PBS經滅菌後儲存於 4℃即可。 3.2 mM Ethylene Diamietetraacetic Acid (EDTA) 之 PBS 溶液配製：
一公升一倍之 PBS 中加入 0.5 g 之 EDTA，充分混合後經滅菌儲存於 4℃即可。 4.從猪隻體下顎齒槽骨分離牙齒組織：
1.5 個月（體重約 10 kg）之迷你猪，進行麻醉後以放射線照影確認未萌發臼 齒相對位置，以外科手術取下。分離的臼齒組織放入約 20 ml 含 1.5 ％ PC/ST 之 DMEM 中，先存放於 4℃。
5.牙胚組織之分離：
所有程序及用具以 70~75 %酒精消毒，器械或瓶口使用前先於酒精燈上過火， 所有過程皆於無菌狀態下進行。將裝有牙齒組織之DMEM倒入無菌Dish中，並將 培養液以Section接上無菌玻璃吸管吸乾。其後Pipet-aid裝上 1 ml Pipete吸 取 1 倍回溫 (約 37℃) PBS溶液來沖洗牙齒組織上的血塊和血跡。之後再將 Phosphate Buffered Saline (PBS)溶液以Section吸乾，重複數次直到牙齒組 織沒有殘留血液。之後一手持攝子另一手使用無菌手術刀於Dish上將牙胚組織 及鈣化的牙齒組織分離。鈣化組織丟棄，並將牙胚組織以鑷子夾入新的dish 中。並將牙胚組織分成適當大小於不同Culture dish內。其後將牙胚組織切碎 成小於 1 mm3 的小片段，並加入 10 ml已回溫（約 37℃）1.5 ％ PC/ST和 20 ％ FCS之DMEM，充分混合後置於 37℃，5 ％ CO2培養箱中培養。經 3-4 天更換培 養液一次，經數週使細胞數量達 1×106 -107 個。 6.牙胚細胞的獲得及細胞計數：
細胞培養約 3 週，將 Culture dish 內的培養液於無菌操作台內以 Section 吸 乾，加入 1-2 ml 回溫（約 37℃）含有 2mM EDTA 之 PBS 於培養牙胚細胞 Dish 內，均勻震盪，使該溶液充分佈滿整個 dish。由於 EDTA 會至換細胞中的鈣離 子，而使牙胚細胞在缺乏鈣離子情況下由 Dish coating 膜上被沖洗下來。經 過約 1-2 分鐘後在 Dish 中加入含 1.5 ％ PC/ST 和 20 ％ FCS 之 DMEM 反覆潤 洗，之後再將全部液體收集於離心管中。離心管中的細胞液以吸管懸浮後，取 約 100μl 和相等體積之 0.5 ％ Trypan blue 混合後滴於血球計數盤上於顯微 鏡下進行計數。其他細胞液則以 1500 r.p.m.、4℃離心 5 分鐘將細胞離心下 來，其後將上層液體吸乾加入新的培養液，至於 4℃備用。 7.製備明膠軟骨素透明質酸三重聚合物支架：
將0.5g Gelatin (102K0059, Sigama Co.,USA)powder、0.1g Chondroitin-6- sulfate (C6S) (C4384-5G, Sigama, USA)powder 和0.5 mg Sodium hyaluronate (HA) (WA18181， Fluka，USA)加入7 mL 的二次蒸餾水隔水加熱 (溫度約35-40℃)攪拌，以2 mL 1% 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDAC,PH 5-6)溶液加入該液中進行交聯。然後將溶液冰於 -20℃,1小時，再移至-70℃,一小時，之後進行冷凍乾燥72小時。將乾燥之支 架浸泡於10 mL 0.2％ EDAC (PH 5-6)溶液中，24小時進行第二次交聯。再將 支架進行冷凍乾燥72小時，即完成支架之製備。明膠軟骨素透明質酸三重聚合 物支架使用前泡於70~75 ％酒精滅菌，至少三小時。種入細胞前先以PBS清洗 至少5次將酒精至換出來，種入細胞前先將PBS吸乾，即可種入細胞。 8.牙胚細胞種入明膠軟骨素透明質酸三重聚合物支架： 離心後的細胞將上層的培養液吸出，再加入少於要種入支架體積之培養液，並 懸浮細胞於培養液中。懸浮的細胞以 26 G針頭接針筒抽出後直接均勻打入支 架中。種入細胞的支架靜置約 15 分鐘，小心放入血清瓶底端具有攪拌磁棒之 含 1.5 ％ PC/ST和 20 ％FCS之DMEM之Spinner flasks中，37℃，5 ％ CO2培
養箱中培養。將攪拌磁棒轉速調為 70 r.p.m.，藉磁棒攪拌使培養液均勻分佈 於支架中。隔天，將轉速調為 50 r.p.m，細胞種入支架中培養約 5 天。 9 組織學分析：
將發育的牙齒組織以 10％中性福馬林固定至少六小時以上，其後以 22.5% v/v Formic acid (A0208003001, Acros, USA)和 10% w/vSodium citrate(6274H, MP biomedicals, Inc.,Taiwan)脫鈣，經例行性的脫水後再以石臘包埋。包埋 之組織切成小於 4 µm製作成切片。將切片置於 56℃烘箱中處裡 4 小時以上， 進行以下組織分析包括：Hematoxylin and eosin (H&E；Stevens et al., 1990); 和Goldner's染色(Stevens et al., 1990)。藉由H&E染色了解牙齒組織形態； 而Goldner's染色法則可將Dentin染成藍色，新形成的Enamel基質染成紅色， 而成熟的Enamel則染成灰色 (Duailibi et al, 2004)。
10.免疫組織化學分析：
免疫化學分析採用商品化 Vectastain ABC kit (兔抗猪的 Amelogenin poly clonal antibody)來檢測生物工程形成之牙齒成分，檢測其 Enamel 內的 Amelogenin 是 否 有 表 現 ； 另 一 方 面 則 是 檢 測 Dentin( 兔 抗 猪 的 Dentin sialoportein protein polyclonal antibody)中特有的 Bone sialoportein protein 是否也有表現 (Young et al., 2002)。 結果： 一. 牙胚細胞培養情形 1.牙胚細胞培養之數量及存活率：牙胚細胞生長的型態為紡垂形，如圖一。 將培養的細胞洗下，以 0.5 ％ Trypan blue染色進行細胞計數，其培養的細 胞數目平均值約 1×107 個左右，而細胞的存活率平均值在 85 ％左右，如表一 所示。 圖一.牙胚細胞形態 (400X)。
表一.猪隻牙胚細胞培養數目及細胞存活率 Ear number
of swine
cell numbers Cell viability P129-2♂ 4.1 ×105 cell/ml 89.9 ％ P132-3♂ 2.1 ×107 cell/ml 92.3 ％ P132-7♀ 1.3 ×107 cell/ml 90.9 ％ P133-1♂ 1.0 ×107 cell/ml 89.6 ％ P137-3♂ 9.5 ×106 cell/ml 83.5 ％ P139-1♀ 1.0 ×107 cell/ml 90.1 ％ P153-2♂ 1.1 ×107 cell/ml 80.0 ％ P161-1♂ 5.2 ×107 cell/ml 80.6 ％ P153-2♂ 4.9 ×107 cell/ml 90.0 ％ 2.細胞在支架中生長情形 A.細胞種入支架進行 H&E 染色：細胞種入支架後於培養液中培養約一週後 ，將部分支架以 10 ％中性福馬林進行固定。其後以石蠟包埋切成切片後 進行 H&E 染色。由圖二，可見細胞攀附於支架上的情形。 圖二. 細胞種入支架進行 H&E 染色 (400X)。 B.細胞種入支架以環境掃瞄式電子顯微鏡掃瞄：細胞種入支架後於培養液中 培養約一週後，將部分支架以 2.5 ％戊二醛進行固定。其後以 freeze fracture 的方式將支架裂解，其後以環境掃瞄式電子顯微鏡進行支架表面 掃瞄。如圖三，可觀察細胞攀附於支架上的情形。並且由圖中推算牙胚細 胞的直徑約為 5 μm。
圖三. 環境掃瞄式電子顯微鏡下之細胞 於支架中生長情形 (1200X)。 二. 猪隻取牙齒組織前、後進行 X 光放射線照影，將未萌發的臼齒牙齒組織以外 科手術從猪隻下顎骨第一至三臼齒間取出。牙齒組織分離後進行牙胚細胞培 養約三週，再將細胞種入支架一週後植入實驗動物(牙胚細胞/支架自體移植 原猪隻齒槽骨和咬肌面骨質中、異體植入不同猪隻之胸部位置；異體異種植 入猪的牙胚細胞/支架於兔子末端肋軟骨之皮下)經過 24 及 36 週以 X 光放射 線照影評估牙齒生長情形。 1.牙齒再生實驗於猪隻： A.對照組：a.猪隻取出牙齒組織後不再種入細胞或支架的猪隻有六隻。如 圖四～二十一，可見耳號為 129-3♀、129-4 ♀、P132-1♂、 P132-4♀、P139-2♂、P139-3♀，取出牙齒組織後經過 36 週，取牙齒相對位置無牙齒生長情形。 b.三頭猪隻取出牙齒組織後僅種入不含細胞之支架，此部分未 評估。
129-3♀ 圖四.取牙齒組織前之 X 光放射線照影。 圖五.取牙齒組織後之 X 光放射線照 圖 隻犧牲進行 X 光放射線照影。 影。 六.取牙齒組織後達 36 週將猪
129-4 ♀ 七.取牙齒組織前之 X 光放射線照影。 圖八.取牙齒組織後之 X 光放射線照 圖九.取牙齒組織後達 36 週將猪 隻犧牲進行 X 光放射線照影。 圖十.取牙齒組織前之 X 光放射線照影。 圖十一.取牙齒組織後之 X 光放射線照 影。 圖 影。 P132-1♂
圖十二.取牙齒組織後達 36 週將猪 隻犧牲進行 X 光放射線照影。 P132-4 ♀ 圖十三.取牙齒組織前之 X 光放射線照影。 圖十四.取牙齒組織後之 X 光放射 線照影。
圖十五.取牙齒組織達 36 週將猪隻犧牲進 行 X 光放射線照影。 P139-2♂ 圖十六.取牙齒組織前之 X 光放射線 圖十七.取牙齒組織後之 X 光放射線照 照影。 影。 圖十八.取牙齒組織後達 36 週將猪隻犧牲 進行 X 光放射線照影。
P132-3 ♀ 圖十九.取牙齒組織前之 X 光放射線 圖二十.取牙齒組織後之 X 光放射線照 照影。 影。 隻犧牲 進行 X 光放射線照影。 P132-7♀、P139-1♀則在 X 光放射線下無任何發現。 圖二十一.取牙齒組織後達 36 週將猪 b.實驗組：(1)猪隻取出牙齒組織後，牙胚細胞培養三週後種入支架培養 一週自體移植原猪隻的齒槽骨及咬肌面骨質中，其猪隻耳 號為 P137-3♀、P133-1♂、P132-7♀、P139-1♀、P132-3♂ 、P129-2♂。如圖二十二～四十六，可見猪隻取牙齒組織 前、後之 X 光放射線照影，及 36 週將猪隻犧牲進行 X 光 放射線照影評估牙齒生長情形。其中可見 P132-3♂、 P129-2♂在原齒槽位置有牙齒鈣化型態出現，而 P137-3 ♂則在齒槽骨出現放射線不透明區域。其餘 P133-1♂、
P137-3♂ 之 X 光放射 線照影。 線照影。 圖-=二十 之放射 線照影。 線不透明區域。 圖二十六.取牙齒組織前之 X 光放射線 圖二十七.取牙齒組織後之 X 光放射 照影。 線照影。 圖二十二.取牙齒組織前之 X 光放射 圖二十三.取牙齒組織後 四.植入牙胚細胞/支架達 36 圖二十五.左側圖放高倍，可見齒槽 週將猪隻犧牲進行 X 光放射 骨出現直徑約 1 ㎝ P133-1♂
圖二十八.植入牙胚細胞/支架達 36 週 將猪隻犧牲進行 X 光放射線 照影，於原齒槽骨無任何發 現。 P132-7♀ 圖二十九.取牙齒組織前之 X 光放射線 圖三十.取牙齒組織後之 X 光放射線 照影。 照影。
圖三十一. 植入牙胚細胞/支架達 36 週 將猪隻犧牲進行 X 光放射線 照影，於原齒槽骨無任何發 現。 P139-1♀ 圖三十二.取牙齒組織前之 X 光放射線 圖三十三.取牙齒組織後之 X 光放射 照影。 線照影。
圖三十四. 植入牙胚細胞/支架達 36 週 將猪隻犧牲進行 X 光放射線 照影，於原齒槽骨無任何發 現。 P132-3♂ 圖三十五.取牙齒組織前之 X 光放射線 圖三十六.取牙齒組織後之 X 光放射 照影 。 線照影。
圖三十七.植入牙胚細胞/支架達 圖三十八.左側圖放高倍，可見齒 36 週將猪隻犧牲進行 槽骨內有牙齒鈣化型 X 光放射線照影。 態出現。 P129-2 ♂ 圖三十九.取牙齒組織前之 X 光放射 圖四十.取牙齒組織後之 X 光放射線照 線照影。 影。
圖四十一.植入牙胚細胞/支架達 圖四十二. 植入牙胚細胞/支架 36 週將隻犧牲之下顎照 達 36 週將猪隻犧牲 ，可見牙齒萌發於口腔外 進行 X 光射線照影， 。 可見牙齒生長。 圖四十三.將牙齒生長相對位置剖開 圖四十四.將該組織製作 ，可見生長約 1 ㎝之牙齒。 成切片，進行 H&E 染色。
圖四十五. )組 (2) 24 週時在其中一個位置發現放射線 不透明區域出現。 P174-4♂ 射線不透 部皮下 。 明區域出現。 發現脂肪組織比 植入的位置有增多情形其他則無任何發現。 製作成切片，在顯微鏡下可見 圖四十六.左圖放高倍， 牙髓(a)及 Dentin 組織(b) 可見牙髓(a)、 (100X)。 Odontoblast(b) 及 Dentin(c 織(400X)。 三頭猪取出牙齒組織後，其牙胚細胞培養三週後分別種入支 架培養一週植入異體猪隻的胸部皮下三個位置，如圖。如圖 四十七～四十八，在
a
b
c
b
a
圖四十七.將不同猪的牙胚細胞/ 圖四十八.種入達 24 週時，在其中 支架種入同一隻猪的胸 一個位置可見放 2.牙齒再生實驗於兔子： 為了瞭解異體異種移植的情形，將猪隻牙胚細胞/支架種入兔子末端肋軟 骨之皮下。經過 24 及 36 週分別以 X 光放射線照影進行評估。所有兔子植 入位置無任何鈣化情形出現，剖解時除了在開刀相對位置 另一側未討論與結論：
成人幹細胞 (Adult stem cells)為多潛能功用且具有高度的可塑性 (Zhang
et al., 2005)。這些細胞包括牙齒牙髓幹細胞 (Dental pulp stem cells；DPSCs) 和骨髓基質細胞 (Bone marrow stromal cells；BMSCs)都可被導入進行生牙作 用，參與牙齒的形成 (Gronthos et al., 2000,; Masako et al., 2003; Zhang
et al., 2005)。成年動物牙本質的修復主要來自於位於牙髓組織中的前驅細胞 集團活化 Odontoblasts 而修復 (Duailibu et al.,2004; Young et al, 2002; Zhang et al., 2005)。Gronthos 等人證實可分離具有 BMSCs clonogenic 特徵 及具有增生能力的 DPSCs (Gronthos et al., 2000)。維持這些 DPSCs 的高增殖 速度甚至繼代多次，在初代培養可產生 Stromal-like cell 且在免疫缺陷鼠背部 再生 Dentin/pulp-like complex (Batouli et al.,2003; Gronthos et al., 2000; Masako et al., 2003; Zhang et al., 2005)。由本實驗的結果也證實可由 DPSCs 的 培 養 再 種 入 可 生 物 降 解 支 架 ， 自 體 植 入 原 猪 隻 的 齒 槽 骨 可 形 成 Dentin/pulp-like complex。DPSCs 具有自行更新、分化成不同後裔及形成群落 (Clonogenic)的能力 (Zhang et al., 2005)，再次被證實。 生物可解性高分子支架可提供細胞生長、貼附，並在植入動物體內的同時 將細胞固定於同一位置 (Changa et al.,2003)。本實驗所使用的支架材料由明 膠 (Gelatin)、軟骨素 (Chondroitin)、透明質酸 (Hyaluronan)三重聚合物所 組成。明膠的功能有助於細胞的生長、貼附及維持細胞活性；軟骨素則促進細胞 分泌Proteoglycan和Type Ⅱ collagen；透明質酸有助於細胞遷移作用使細胞可 在支架中均勻分布 (Changa et al., 2003)。明膠軟骨素透明質酸三重聚合物支 架使用於軟骨細胞的培養，且以Spinner flask方式培養效果較佳 (Changa et al., 2003)。本實驗使用該支架種入牙胚細胞後也以Spinner flask方式培養。 植入牙胚細胞/支架的猪隻，六頭中有三頭在原齒槽骨出現放射不透明區域，而 三頭在X光放射線照影則無任何發現。三頭在原齒槽骨出現放射不透明區域的猪 隻，其中一頭可見牙齒萌發於口腔外；一頭則在齒槽骨內可見牙齒型態；另一頭 則是出現圓形的放射線不透明區域。證據顯示牙胚細胞可貼附於支架上，但值得 一提的是該支架是否適合牙胚細胞生長並遷移而均勻分散於支架中仍須進一步 探討。由牙胚細胞/支架的組織切片我們發現細胞的遷移作用在培養一週時的效 果不佳，應增長培養的時間。但為了避免Spinner flask方式培養可能造成細胞 由支架上掉落的風險，建議培養後的細胞種入支架後直接植入動物體內。這樣不 但可以確保細胞種入支架中的實際數目，還可探討牙胚細胞數目的多寡是否決定 牙齒生長的速度及大小。牙齒形成起始於口腔上皮來源的牙齒層細胞 (Dental laminas cell) ， 在 牙 齒 層 細 胞 的 初 步 分 子 訊 息 中 包 括 發 育 過 程 中 之 上 皮 (Epithelium) 及 間 葉 (Mesenchyma) 組 織 之 間 相 互 訊 息 傳 導 (Jernvall and Thesleff ,2000; Peters and Balling,1999; Sadler ,2003)，進而發展成牙齒 結構 (Nakashima and Reddi, 2003)。在許多器官的發育中皆是以此種作用模式 形成，例如：毛髮、乳腺、唾液腺、胰島腺等，而其中牙齒的發育是最典型的例
子 (Kollar 1972, Lumsden 1988, Slavkin 1972, 1974, 1988, 1992, 1997, Slarkin et al 1977, 1984, 1994)。許多生長因子及轉錄因子已被鑑定出來， 而 且 在 不 同 牙 齒 發 育 的 階 段 中 已 被 確 認 ( 參 考 ： http://bite-it.helsinki.fi/)。發育過程中的細胞及分子生物變化皆有許多的 研究 (Linde and Goldberg, 1993; Zeichner-David et al., 1995; Robey, 1996; Wu et al., 1996; Bartlett and Simmer, 1999; Grzesik etal., 2000; Jernvall and Thesleff, 2000; Saygin et al., 2000;Diekwisch, 2001; Saito et al., 2001) ， 部 分 詳 細 的 分 子 訊 息 網 已 被 建 立 ， 其 中 最 重 要 的 訊 息 家 族 為 Bone morphogenetic proteins (BMPs)、Fibroblast growth factors (FGFs)、Hedgehog proteins (Hhs)和Wingless- and int-related proteins (Wnts) (Jernvall and Thesleff, 2000；Nakashima and Reddi, 2003)。因此，在牙胚細胞培養時或將 細胞種入支架植入動物體內添加生長因子是否有助於細胞的分化進而形成相關 的牙齒組織是值得探討的範疇。Nakashima和Reddi等人指出材質的形狀和大小控 制修復Dentin的大小和形狀(Naakashima and Reddi, 2003)，因此是否將支架的
不同週數進行犧牲或以藥物破壞其免 組織工程方式，再加上來自環境可能的訊號轉移因子 齒相關組織。
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cartilage tissue engineering. 形狀切成相關的牙齒形狀有助於萌發成相對應的牙齒仍須進一步證實。 本實驗中將猪牙胚細胞/支架異體植入另一頭猪隻胸部位置，可見放射線不 透明區域出現。由本實驗異體移植的雛形得到初步的證實。猪隻牙胚細胞/支架 在兔子異體異種移植方面由於免疫排斥上的問題能需克服才能進一步的進行探 討牙齒組織生長與否。其中可能要改變兔子植入猪隻牙胚細胞/支架的評估時 間，例如：縮短拍攝 X 光放射線照影及分為 疫系統再進行本實驗較具有實際意義。 我們的結果指出使用 可再生牙 參考文獻：
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Zhang YD, Chen Z, Song YQ, Liu C, Chen YP. Making a tooth: growth factors, tr 畫成果自評： 由於猪隻取牙齒組織進行牙胚細胞培養為初起步階段，因此造成部分計畫 上的延後。計畫中猪隻取牙齒組織進行牙胚細胞培養、牙胚細胞/支架植入實驗 動物體內、實驗動物進行 X 光放射線照影評估及犧牲等都已完成。但我們目前組 織僅進行 H&E 染色，後序將進行 Goldner's 染色及免疫組織化學染色分 關成分。由實驗結果指出利用組織工程方式可再生牙齒相關組織。 評估牙齒生長情我們除了進行 X 光放射線照影外，也以核磁共振的方式確認 牙齒生長情形。因此在 X 光放射線照影下植入牙胚/細胞的相對位置未看見牙齒 相關形態，我們也將陸續進行組織學分析了解是否有相關牙齒組織或成份出現。 牙齒生長的形狀方面我們實驗結果和原先臼齒的形狀差異甚大，討論其原 因，其中最重要的是取下的組織為 Bell 階段的牙齒組織，而調控牙齒生長形態 的 Enamel knot 則是在 Bell 階段短暫出現調控牙齒形態，而在 Bell 階段後期經 由細胞凋亡現象而消失。除了取下牙齒組織的發育階段為何相關外和細胞種入支 架後在體外進行培養細胞數量的變異、植入猪隻體內發育的時間太短等都有關。 本實驗中將猪牙胚細胞/支架異體植入另一頭猪隻胸部位置，可見放射線不 透明區域出現。由本實驗異體移植的雛形得到初步的證實。猪隻牙胚細胞/支架 在兔子異體異種移植方面由於免疫排斥上的問題能需克服才能進一步的進行探 討牙齒組織生長與否。其中可能要改變兔子植入猪隻牙胚細胞/支架的評估時
間，例如：縮短拍攝 X 光放射線照影及分為不同週數進行犧牲或以藥物破壞其免 組織工程方式，再加上來自環境可能的訊號轉移因子 再生牙齒相關組織。 疫系統再進行本實驗較具有實際意義。 我們的結果指出使用 可
