肝硬化的嚴重度與肝組織間質金屬性蛋白分解酵素的關係

〔國科會計畫執行成果報告〕

肝硬化的嚴重度與肝組織間質金屬性蛋白分解酵素的關係

（92.08.01-93.07.31）

NSC 92-2314-B-002-168

執行單位：台大醫學院醫學系 內科

主持人：楊培銘教授（台大醫學院醫學系內科）

肝臟纖維化及硬化常被認為是不可能回復的，大部分肝硬化的患者會逐漸 有功能代償失調之現象，甚至出現一些併發症，如：食道靜脈曲張、腹水，最後 可能發生肝衰竭。 已有不少的動物實驗及少數的人體報告顯示肝臟纖維化是可回復的。臨床 研究證實，Ｃ型肝炎患者在接受干擾素治療後肝臟纖維化獲得改善。 臨床醫師的經驗常認為早期的硬化是可逆的，然而晚期的硬化則不可逆。 但是此經驗缺乏適當的理由。另外也有研究者認為在纖維化過程中有一個「不回 頭點」，但是此認知亦缺乏適當的描述。 間質金屬性蛋白分解酵素（Matrix metalloproteinase, MMPs）是一群可分解細胞 外間質的酵素，動物實驗顯示它們對肝纖維化的回復具有絕對的重要性，更有研究 顯示在初期的肝傷害導致纖維化時，間質金屬性蛋白分解酵素的合成增加，但是當 纖維化越來越厲害時，其生成則逐漸減少。我們初步的動物研究亦顯示形成時間越 久的肝纖維化越不容易回復，而且此不回復性與間質金屬性蛋白分解酵素的生成減 少成正比。此外，我們也以四氯化碳來造成肝臟的損傷，經過四週到十六週四氯化 碳的注射，MMP-2 和 MMP-9 的表現也逐漸降低，這些結果顯示，間質金屬蛋白分 解酵素的表現降低，亦降低了肝臟纖維化回復的能力。此結果說明在纖維化形成過 程的肝臟中，間質金屬性蛋白分解酵素的表現也許是一個代表此纖維化過程的持久 性及可逆性的良好指標。 本計畫就是要用病人的肝組織來證明這個假說。這個結果將能增加我們對肝纖 維化致病原理更深的了解，並希望能對激發出新的治療方法來促進肝硬化的回復上 有所幫助。

實驗材料及方法 Materials 我們收集了30個因肝細胞癌或轉移性肝癌而開刀的病人之肝組織 （non-tumor part），並立即將其保存在液態氮中，至開始做實驗時才取出。 RT-PCR 取大小約40 mg之肝組織homogenized 後，以Trizol將RNA萃取出來，並進行 1% agarose gel electrophoresis確定RNA品質。接著以合成之primers (table 2)，進 行RT-PCR (invitrogen, SuperScript III one-step RT-PCR kit)，以47℃ for 20 min 、 94℃ for 2 分，1 cycle 以及 94℃ for 45 秒、60℃ for 45” and 72℃ for 90秒的條 件，進行35 cycles。

One-step RT-PCR

1. Take 40 mg liver tissue with Trizol (invitrogen) 1 ml, homogenized. 2. Repetitive pipetting

3. 0.2 ml chloroform (no additive)/1 ml reagent 4. Shake by hand 15”, stand 2-3 min., RT 5. Centrifuge 12,000 rpm 15 min, 4℃ 6. Repeat steps 2-5

7. Transfer aqueous phase (supernatant of up layer) to a new vial 8. 0.5 ml isopropanol/1 ml reagent, stand 10 min., RT

9. Centrifuge 12,000 rpm, 10 min., 4℃ 10. Discard supernatant

11. Add 1 ml 75% EtOH, wash pellet 1X 12. Vortex

13. Centrifuge 7,500 g 5 min., 4℃ 14. Discard EtOH

15. Dry pellet by speed Vac around 10 min.

16. Dissolved RNA with DEPC H2O (take 1 to 50X dil) 17. OD 260

18. Resuspend with TE buffer ( 1 g/l) 19. 1% agarose gel check (1 g RNA)

20. Take 0.5-1 g RNA to perform one-step RT-PCR

Components Volume/50 l Final Concentration

2X Reaction Mix 25l 1X

50 mM MgSO4 --- 1.2 mM

Template RNA

Sense Primer (20M) 1 l 0.4M

Anti-sense Primer (20 M) 1 l 0.4M

RT / Platinum Taq Mix (III) 2 l --- Autoclaved dis. H2O (DEPC H2O)

Final Volume 50 l

21. 35 cycles

MMPs and TIMPs 之Primers sequences

Sense Anti-Sense Amplicon

MMP-1 5’-CAAAATCCTGTCCAGCCCATCG-3’ 5’-CGGCAAATTCGTAAGCAGCTTC-3’ 216 bp

MMP-2 5’-CTCTCCTGACATTGACCTTGGCAC-3’ 5’-GTATTCATTCCCTGCAAAGAACAC-3’ 279 bp

MMP-9 5’-GGCATCCGGCACCTCTATGGTCC-3’ 5’-GCCACTTGTCGGCGATAAGGAAGG-3’ 369 bp

TIMP-1 5’-CTGTTGGCTGTGAGGAATGCACAG-3’ 5’-TTCAGAGCCTTGGAGGAGCTGGTC-3’ 106 bp

TIMP-2 5’-ATGAGATCAAGCAGATAAAGATG-3’ 5’-GGTCCTCGATGTCGAGAAACTC-3’ 446 bp

GAPDH 5’-TTCACCACCATGGAGAAGGCTG-3’ 5’-CTTCCACGATACCAAAGTTGTC-3’ 226 bp

Quantitative real-time PCR

將total RNA以AMV-RT (Avian Myeloblastosis Virus reverse transcriptase) 在 45℃反應60分鐘轉成cDNA，利用mutiplex quantitative real-time PCR的方法，以 合成之probe 和primers（TIB MOLBIOL, Germany）進行MMP-1, 2, 9 and TIMP-1 , TIMP-2 mRNA之定量（Roche Lightcycler，Taqman）[21]。

1. Take 1 g tRNA, add Oligo(dT) 1 l and add H2O to 17 l 2. 65℃, 15 min. then place it in RT 15 min.

3. Add RT buffer, 5 l, AMV RT, 1 l and dNTP 2 l 4. Add H2O to 25 l

5. 45℃, 60 min., then 95℃, 5 min., keep in - 20℃ till to use. 6. Performed real-time PCR. Follows below:

Materials volume Final concentration Template (cDNA : 40 ng/) 1 2 ng/ Primer sense ( 5 M/ ) Anti-sense ( 5 M/ ) 1  1 0.25 M/ 0.25 M/ Taqman probe ( 4 M/ 0.5 0.1 M/ MgCl2 (25 mM/l) 1 1.25 mM/ Master Mix

(take 1b 60 into 1a) 1

H2O 14.5

Total volume

20 l

950C, 10 sec. 600C, 30 sec., 50 cycles

Primer and Probe (TM)

Sense Anti-sense MMP1 gATATCTTTTgTCAggggAgATC TCTCTgAAATTgTTggTCCAC A MMP1 TM TTCATCAAAATgAgCATCCCCTCCA q MMP2 CAgggCggCggTCACA gTATCgAAggCAgTggAgAggA MMP2 TM AATCCgACTggCTAggCTgCTgAgC q MMP9 gCTggCAgAggAATACCTgTAC CAgggACAgTTgCTTCTggA MMP9 TM 6FAM- CACTCgggTggCAgAgATgCgT q

TIMP1 gTTATgAgATCAAgATgACCAAgAT TgTgggACCTgTggAAgTA

TIMP1

TM CAAgCCTTAggggATgCCgCTgAC q

TIMP-2 gCCCTgggACACCCTgAg AgTCCATCCAgAggCACTCg

TIMP2 TM F-CTgAACCACAggTACCAgATgggCT

GAPDH gAAggTgAAggTCggAgTC gAAgATggTgATgggATTTC

GAPDH TM 6FAM-CAAgCTTCCCgTTCTCAgCCT q

Histochemistry

以 10% formalin固定，切成 5m 之大小，再以Weigert's Iron Hematoxylin solution、Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin、Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid、 Aniline Blue and 1% Acetic Acid 做組織染色，根據 Metavir 分類系統，依組織 纖維化的程度分為F0-F4。

Masson stain

1. Section with 10% formalin (5m)

2. Mordant in Bouin’s solution (for fix), microwave 1 min, stand 15 min. 3. Wash in running tap water to remove the picric acid, 5 min

4. Weigert’s working hematoxylin, 10 min 5. Biebrich scarlet for 5 min

6. Rinse in distilled water.

7. Phosphotungstic/phosphomolybdic acid for 5 min, discard solution 8. Transfer directly into Light green for 5 min.

9. Rinse in distilled water.

10. 1% Acetic acid for 1 min, discard solution. 11. Rinse in distilled water.

12. Dehydrate, clear, and coverslip

HydroxyProline

取大小約200 mg之肝組織，homogenized後，加入2 ml 6N HCl (1mg liver tissue/10 l HCl)，120 ℃，overnight (over 16 hr)，調整pH值至7.0 (4-9)，以DAB 呈色，ELISA reader 540 nm 判讀結果。

1. Take 200 mg liver tissue

2. Add 2 ml 6N HCl (1mg liver tissue/10l HCl) then homogenized 3. 120 ℃，overnight (over 16 hr)

4. Cool down then centrifuge 12,000 rpm for 10 min 5. Take 150 l sup. to new eppendorff

6. Add 6N NaOH 150 l , neutralization. 7. Adjust PH to 7.0 (4-9)

8. Take pre-treat sample or standard 40 l 9. Add B solution 25 l

10. Add D solution 150l 11. ELISA reader, 540 nm。

A solution : Add 35 mg Chloromine T into 500l H2O

B solution : Take A solution 100 l into acetate/citrate buffer 400 l (1:4)

C solution : Take DAB 0.33 g into 500 l 60% HClO4

D solution : Take C solution 500 l into 1.5 ml isopropanol (1:3 diluent)

Statistics

我們以SAS 統計軟體分析real-time PCR, hydroxyproline, fibrotic index and 組織 切片染色之結果，並以student’s t-test比較差異。

實驗結果

我們收集的30個開刀病人中，Ｂ型肝炎的患者有17個, Ｃ型肝炎的患者有7

個，因轉移性肝癌而 開刀的患者有6個, 其中依METAVIR score （F0 : no fibrosis，F1 : portal fibrosis without septa，F2 : few fibrotic septa，F3 : numerous septa without cirrhosis，F4 : cirrhosis）又分F0 = 4, F1 = 5, F2 = 5, F3 = 8, F4 = 8。

MMP-9與肝臟纖維化指數（F0-F1與F2-F4）顯示統計上的意義（p = 0.02）, Hydroxyproline 與F.I (Fibrotic Index)亦有統計上的意義（p < 0.05）。MMP-1, -2, TIMP-1, -2則在各組中皆無明顯統計上的意義。 在MMP-1, -2, -9, TIMP-1, -2, colleagen之相關性上，TIMP-2與MMP-2（p = 0.03） 和GOT （p = 0.02）具有統計上的意義。 討論 有許多文獻報告在肝纖維化演變成肝硬化的過程中， MMP-1, -2, -9, TIMP-1 and TIMP-2在血清中其濃度皆會持續上升，但亦有研究發現，在肝硬化末期，血 清中之MMP-9開始降低。肝臟發炎會誘發 cytokine、chemokine 的增加及改變了

matrix metalloproteinases（MMPs）和tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) 之間的平衡，進而促使肝臟纖維化的進行。 本研究從肝臟組織中探討MMPs與TIMPs之間在肝臟纖維化中，對細胞外間 質的影響及其在肝臟發炎中間 質金屬 蛋白 分解酵素之表現。在 MMP-1, -2, TIMP-1和TIMP-2的mRNA的表現與肝纖維化並無明顯差異，但MMP-9 mRNA的 表現在肝纖維化指數F0-F1(n= 12)與F2-F4 (n=15)卻有顯著的差異（p = 0.02）。 在細胞外間質中，hydroxylproline的含量與在各分組中有明顯統計上的差異（p < 0.05），這表示隨著肝纖維化嚴重程度，肝組織中hydroxylproline的含量亦增加。 我們在先前的動物研究顯示越持久的肝纖維化越不容易回復，而且此不回復性 與間質金屬性蛋白分解酵素的生成減少成正比。但我們從人體肝臟組織中卻發現了 除了MMP-9外，其餘之間質金屬蛋白分解醏素的生成並沒有因肝臟纖維化的嚴重程 度而有明顯增加或減少。文獻中曾指出，在肝臟發炎期間，MMPs之生成會增加，其 TIMPs之生成亦會隨之增加。在我們所收集的30個患者之肝臟組織中卻發現肝臟組織 中MMP-1, -2, TIMP-1及TIMP-2與F.I並無顯著差異，這30個患者血清中之肝功能指數 （GOT）並未明顯上升，顯示肝臟無明顯的發炎現象，或許這就是在我們實驗中， MMPs 與TIMPs在肝臟纖維化的過程中，與F.I並無明顯差異的原因之一。MMP-9屬 於gelatinase B，會活化latent TGF-，而TGF-與Fibrogenesis有密切的關係，因此， MMP-9 mRNA expression 與F.I有明顯差異。MMP-2屬於gelatinase A，我們發現，其 mRNA expression與TIMP-2之expression有相關係，可能是因為TIMP-2的生成增加 了，抑制了MMP-2的生成，因為GOT與TIMP-2在統計上有明顯的差異。

就如先前的研究發現，在肝臟纖維化的發生過程中，會因肝臟的發炎而誘發 cytokine, chemokine及活化一些signal transduction protein (如：MAPK, AkT, NFB)，這 些因子也會影響MMPs與肝臟纖維化的關係，亦有研究發現，在ECM中有一些醣蛋 白分子與Fibrogensis有關，這也是我們接下來要探討在肝臟之ECM內，是否會因這些 glycoproteins而使得ECM中一些components（如MMPs）失衡或改變了fibrogenesis pathway。

表一、t-TEST FI N Mean STD Range p 0-2 2 2.77 1.85 (1.46-4.07) 3-4 8 5.04 7.84 (0.63-23.87) 0.71 0-1 4 1.95 1.43 (1.01-4.07) 2-4 6 6.35 8.83 (0.63-23.87) 0.28 0-3 7 5.42 8.24 (1.01-23.87) MMP-1 4 3 2.65 3.08 (0.63-6.19) 0.60 0-2 14 0.58 0.51 (0.16-2.17) 3-4 16 0.67 0.50 (0.23-2.13) 0.61 0-1 9 0.14 0.62 (0.23-2.17) MMP-2 2-4 21 0.43 0.45 (0.16-2.13) 0.95 0-2 7 1.22 0.87 (0.47-3.05) 3-4 20 2.01 1.68 (0.25-6.85) 0.21 0-1 12 1.16 0.72 (0.47-3.05) 2-4 15 2.42 1.81 (0.25-6.85) 0.02 0-3 19 1.43 0.88 (0.47-3.28) MMP-9 4 8 2.88 2.23 (0.25-6.85) 0.12 0-2 14 0.98 0.61 (0.28-2.20) 3-4 16 1.68 1.43 (0.47-5.29) 0.09 0-1 9 0.97 0.59 (0.28-2.14) 2-4 21 1.52 1.31 (0.40-5.29) 0.13 0-3 22 1.27 1.08 (0.28-5.29) TIMP-1 4 8 1.57 1.42 (0.64-4.96) 0.54 0-2 14 0.74 0.62 (0.08-2.46) 3-4 16 0.92 0.79 (0.31-3.76) 0.49 0-1 9 0.63 0.39 (0.21-1.38) TIMP-2 2-4 21 0.93 0.80 (0.08-3.76) 0.18 0-2 14 4.29 1.27 (2.39-6.09) 3-4 16 5.82 2.60 (2.74-13.67) 0.0479 0-3 22 4.39 1.36 (2.39-6.79) 4 8 7.08 2.89 (4.85-13.67) 0.0346 0-1 9 4.15 1.20 (2.39-6.09) HyP. conc. 2-4 21 5.52 2.41 (2.74-13.67) 0.0483 0-2 14 48.2 51.2 (12-211) 3-4 15 58.7 60.3 (23-247) 0.58 0-1 9 59.89 60.96 (15-211) GOT (AST) 2-4 20 51.70 54.15 (12-247) 0.72 0-2 14 47.9 36.2 (13-141) 3-4 15 69.8 101.6 (23-438) 0.44 0-1 8 56.88 40.97 (17-141) GPT (ALT) 2-4 20 61.80 91.92 (13-438) 0.85

表二、correlation of MMPs and HyP

MMP-1 MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2 GOT GPT MMP-1 MMP-2 r = -0.04 p = 0.91 MMP-9 r = 0.56 p = 0.10 r = -0.22 p = 0.24 TIMP-1 r = -0.26 p = 0.43 r = 0.15 p = 0.42 r = 0.14 p = 0.49 TIMP-2 r = -0.18 p = 0.58 r = 0.39 p = 0.03 r = -0.02 p = 0.93 r = 0.27 p = 0.15 GOT r = -0.23 p = 0.49 r = 0.31 p = 0.09 r = -0.19 p = 0.42 r = 0.01 p = 0.96 r = 0.42 p = 0.02 GPT r = -0.21 p = 0.53 r = 0.18 p = 0.36 r = -0.18 p = 0.36 r = -0.08 p = 0.66 r = 0.18 p = 0.36 r = 0.87 p < 0.0001 HyP r = -0.35 p = 0.30 r = 0.31 p = 0.09 r = 0.25 p = 0.20 r = 0.15 p = 0.43 r = 0.09 p = 0.62 r = 0.03 p = 0.87

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