Journal of Engineering Technology and Education, ISSN 1813-3851
以亞胺基硫烷鹽定量超順磁性奈米粒子表面一級胺基含量
邱勝暉、鍾霈諭、陳樹人* 國立高雄應用科技大學 化學工程與材料工程系 *通訊作者電子郵件：E-mail: biochen@kuas.edu.tw摘 要
為提高磁性材料表面一級胺官能基定量的準確性，本研究簡化了磁性材料表面一級胺官能基含量的試 劑配方，並且探討影響一級胺官能基定量的反應條件。研究發現影響定量磁性奈米粒子表面一級胺含量準 確度的因素有：胺基與亞胺基硫烷鹽（iminothiolane, ITL）的反應時間、反應溶液的工作體積、磁性奈米粒 子分散性、磁性奈米粒子用量等。根據上述發現，最適化的分析流程為：將 12.5 或 25 mg 的胺基修飾磁性 奈米粒子分散於 4 ml ITL 溶液（0.8 Mm），在 22°C 下反應 10 h 後加入 bicinchoninic acid（BCA）進行呈色 反應，呈色反應時間為 1 h，藉由 BCA 定量殘餘的 ITL 濃度，進而推算胺基修飾磁性奈米粒子表面的一級 胺含量。 關鍵詞：一級胺、四氧化三鐵、亞胺基硫烷鹽、二氧化矽、超順磁性1. 前 言
室溫下的超順磁性奈米粒子（superparamagnetic nanoparticles）在無外加磁場下，沒有自發性磁偶極， 不具磁性；在外加磁場的作用下，粒子的磁矩將沿著磁場的方向排列，因而產生磁偶極；所以，經由施加 磁場可以使超順磁性奈米粒子產生磁性而聚集，移除外加磁場後，粒子的磁性消失，又可以再度重新分散。 基於本身特殊的磁性質，超順磁性奈米粒子在生化分離[1]或是藥物傳輸[2]上極具應用潛力。在食品科技的 應用上，超順磁性奈米粒子材料可用胺基（—NH3+）、羥基（—OH）或是羧基（—COO–）等活性官能基進 行表面修飾，使其成為分離純化程序的吸附介質；粒子表面也能夠進一步以共價鍵結合酵素與蛋白質分子， 成為固定化的載體或是親和性吸附介質，應用於酵素與細胞固定化、生物分子之純化、生化與食品檢驗分 析。這些官能基裏，胺基是最常被用於修飾粒子表面的官能基，原因是胺基具有高化學活性，可進一步與 其他官能基進行縮合或偶合反應，使得奈米粒子具有更多元的應用性。 超順磁性奈米粒子表面胺基的多寡將顯著地影響後續材料表面改質的成效，因此，精確地定量奈米粒 子表面胺基含量是材料表面性質分析的重要項目。常用於奈米粒子表面胺基定量的方法有紫外光-可見光光 譜法[3, 4]、螢光光譜法[5]、滴定法[6]、X-射線光電子光譜法[7]、熱重分析法[8]、元素分析法[9, 10]等。熱 重分析與元素分析法屬於總體分析法，只能定量胺基總量，無法辨別胺基類型（一級胺、二級胺、三級胺 等）；X-射線光電子光譜法操作成本高，不適合分析大量樣品；滴定法的誤差較大，精確度不高；紫外光-可見光光譜法以及螢光光譜法原理類似，是目前最常使用的定量胺基方法，其粒子標記及偵測方法可分為 二種：(1)直接標記與偵測：先將材料表面胺基反應成另一種活性基團，再與呈色劑進行呈色反應，藉由顏 色深淺的變化或是螢光強度的變化定量胺基含量；(2)間接標記與偵測：粒子表面的胺基先與呈色劑進行可 逆反應，再分析從粒子表面釋放的標記物，藉以進行間接定量[11]。然而，紫外光－可見光光譜法與螢光法 的分析過程需要經過 2 次非均勻相反應，也需要多次清洗粒子，以便去除過量的反應試劑，對於奈米粒子 而言，多次的清洗步驟將會相當花費時間，且易流失些許粒子[12]。另外，粒子與試劑或有機溶劑的不相容性、粒子團聚現象以及非均勻相反應之效率不高等因素都將導致定量胺基的誤差[11, 12]。
為了避免有機溶劑與粒子的不相容性，Kakabakos 等人以水作為溶劑，利用 bicinchoninic acid（BCA） 與 2-iminothiolane（ITL）定量固態材料表面的一級胺，稱為 ITL/BCA method [13]，此方法是藉由粒子表面 一級胺與 ITL 反應形成硫醇基（—SH）標記物，再與 BCA 於 60°C 下反應 1 h，測其波長 562 nm 下吸收度 即可推算胺基含量。但此方法在 60°C 下反應 1 h 過程中，BCA 易受到粒子干擾，且仍须經過兩步驟的非均 勻相反應，導致定量一級胺的誤差。為了減少粒子與溶液非均勻相反應的影響與簡化定量胺基的程序，Qu 等 人 提 出操 作 步 驟簡 單 且僅 需 一 步驟 非 均 勻相 反 應 的 胺 基 定量 方 法 ，此 方 法稱 為 subtractive ITL/BCA method [12]，其原理如下：在室溫下，ITL 與 BCA 可在短時間內發生呈色反應；因此，加入 ITL 與材料表 面一級胺反應之後，可加入 BCA 與殘留的 ITL 進行呈色反應，測量波長 562 nm 下的吸收度可得知 ITL 的 殘留濃度，與不含奈米粒子的對照組相比較，從波長 562 nm 吸收度的差異即可推算奈米粒子表面的一級胺 含量。奈米粒子表面的一級胺是否完全地與 ITL 反應是決定 subtractive ITL/BCA method 分析準確度的關鍵， 其次，Qu 等人[12]提出的步驟中，需要添加界面活性劑 Triton X-100，然而，Triton X-100 容易使分析樣品 產生泡沫，吸取微量體積時很容易發生誤差。有鑑於此，本研究將探討簡化超順磁性奈米粒子表面胺基分 析步驟的策略，影響一級胺含量準確度的因素，包括：(1)分析試劑成分與穩定性、(2)奈米粒子與 ITL 反應 的時間、(3)BCA 呈色反應時間、(4)奈米粒子與 ITL 反應的攪拌方式、奈米粒子用量以及反應溶液工作體積 等。
2. 實驗材料與方法
2.1 超順磁性 Fe3O4@SiO2奈米粒子之製備首先以共沉澱法製備 Fe3O4奈米粒子，將 FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、油酸與去離子水，在 80°C 環境中
通入 N2，加入氨水（28%）後反應 35 min。反應結束後，加入去離子水配成 Fe3O4奈米粒子懸浮液。取適
量的 Fe3O4奈米粒子懸浮液，聯同 28 %氨水，注入經過 50°C 預熱的正己烷與界面活性劑 CO-520 有機相，
可形成逆微胞反應系統，隨後加入四乙氧基矽烷（tetraethyl orthosilicate, TEOS），在 50°C 下反應 4 h。反應 結束後，以釹鐵硼磁鐵收集產物，並用酒精清洗，即可獲得 Fe3O4@SiO2奈米粒子。本研究合成的 Fe3O4@SiO2
奈米粒子以超導量子干涉磁量儀（SQUID）鑑定，證實為超順磁性奈米粒子[14]。
2.2 胺基修飾之磁性二氧化矽粒子（Fe3O4@SiO2-NH2）之製備
將 Fe3O4@SiO2 分 散 於 乙 醇 溶 液 中 ， 加 入 3- 胺 丙 基 三 乙 氧 基 矽 烷 （ 3-aminopropyl triethoxysilane,
APTES），在超音波環境下進行反應。反應完成後，以乙醇清洗數次，去除氨水以及殘留的 APTES，即可收 集 Fe3O4@SiO2-NH2奈米粒子。
2.3 材料鑑定與分析
材料形貌與粒徑大小以 TEM 鑑定（JEOL JEM-1400）；材料表面官能基以 FTIR 鑑定（PerkiinElmer- Spectrum one）。材料表面電位以 zeta potential analyzer 分析（90 Plus Particle Size Analyzer）。
2.4 材料表面一級胺官能基含量分析
根據 subtractive ITL/BCA method [12]的原理，並簡化其流程。首先在小離心管（eppendorf tube）內放 入適量的 Fe3O4@SiO2-NH2 奈米粒子，先後以酒精與去離子水清洗 3 次，再加入 pH 7.96、0.1 M 磷酸緩衝
溶液。以超音波震盪分散粒子後，加入 ITL 溶液，以磁石攪拌子進行攪拌反應（溫度為 22°C）。反應 10 h 後，以離心沉降粒子並取出上清液，將上清液與等量的 BCA 進行呈色反應，呈色反應進行 1 h，溶液的顏 色由綠色變為紫色，在波長 562 nm 下量測吸收度，即可換算出溶液中 ITL 的濃度。不含奈米粒子的控制組
實驗亦以上述步驟進行，比較實驗組與控制組吸收度的差異，即可推算奈米粒子表面的一級胺官能基含量。
3. 結果與討論
3.1 胺基修飾磁性二氧化矽奈米粒子之特性分析
超順磁性奈米粒子之形貌顯示於 Fig. 1，Fe3O4@SiO2粒子的粒徑約為 33 nm，經過不同的胺基修飾條件
製備得到的 Fe3O4@SiO2-NH2粒子，粒徑並沒有顯著地增加，粒子也沒有發生團聚現象，顯示本研究的修飾
反應條件可以避免偶合劑修飾之後，二氧化矽殼層或粒子表面厚度大幅增加的困擾，並能保持磁性二氧化 矽粒子的單分散性。此外，從圖 1(f) FTIR 光譜圖可以發現 Fe3O4@SiO2波數 1200-1000 cm-1有 SiO2的特徵
吸收峰，波數 805 cm-1為 Si-O-Si 的對稱性振動，在 1638 cm-1 為 O-H 與 H
2O 所造成；而接枝 APTES 後所
形成的 Fe3O4@SiO2-NH2出現在波數 2945 及 2985 cm-1的特徵吸收峰，為 APTES 中胺丙基所產生的-CH2伸
縮振動所致。
圖 1 Fe3O4@SiO2與不同反應條件合成的 Fe3O4@SiO2-NH2粒子之特性鑑定：(a) Fe3O4@SiO2之 TEM 影像；
(b) Fe3O4@SiO2-NH2（35°C & 1 h）之 TEM 影像；(c) Fe3O4@SiO2-NH2（50°C & 1 h）之 TEM 影像；(d)
Fe3O4@SiO2-NH2（50°C & 2 h）之 TEM 影像；(e) Fe3O4@SiO2-NH2（50°C & 4 h）之 TEM 影像；(f) 粒子
之 FTIR 光譜圖。
為確認粒子表面完成胺基改質，不同修飾條件的磁性粒子再以表面電位儀分析 zeta potential，從 zeta potential 分析圖（圖 2）可以發現：與 Fe3O4@SiO2相較之下，粒子在經由胺基修飾後，其表面電位有趨向
正 電 荷 的 趨 勢 ， 這 是 因 為 表 面 胺 基 帶 有 正 電 荷 。 其 中 又 以 反 應 溫 度 50°Ｃ、反應時間 4 h 所製備出 Fe3O4@SiO2-NH2之正電荷增加最為明顯。由以上數據可確認胺基成功修飾於粒子表面，最適化條件為反應
溫度 50°Ｃ、反應時間 4 h。
圖 2 Fe3O4@SiO2與不同反應條件之 Fe3O4@SiO2-NH2粒子的表面電位比較。
3.2 分析試劑組成與穩定性
根據 subtractive ITL/BCA method 的流程，分析試劑必須添加非離子型界面活性劑 Triton X-100。然而， 本團隊發現 Triton X-100 會導致分析試劑產生泡沫，微量取樣過程中易遭受泡沫干擾而產生取樣體積的誤 差。一般而言，添加界面活性劑的目的在於提高油水兩相的混合均勻度，然而，subtractive ITL/BCA method 不含油相物質，本團隊認為分析試劑應該不需添加 Triton X-100。由圖 3 的 ITL 溶液檢量線可以發現，分析 試劑不含 Triton X-100 時，檢量線仍維持良好的線性關係，因此，利用 subtractive ITL/BCA method 定量胺 基時，並不需要添加 Triton X-100。
其次，ITL 於水溶液中會有水解反應，為了解 ITL 溶液的有效保存期限，本研究將配製完成的 ITL 溶 液分別置於 4°C 冷藏與–20°C 冷凍庫保存，觀察 ITL 溶液冷藏與解凍之後的穩定性。圖 4 顯示在 4°C 與–20°C 下保存 3 day 之後解凍，ITL 與 BCA 反應後的產物吸收度皆略為下降，ITL 降解程度分別為為 13.0%以及 7.0%；經過 7 day 後，ITL 在 4°C 下降解了 24.7%，保存於–20°C 的條件降解了 18.3%。由此可知，分析試 劑 ITL 溶液以新鮮配製為宜，雖然 ITL 在短期(72 h 以內)冷凍保存下，能維持 90%以上不被降解，但研究 數據顯示 ITL 不宜長期保存。 圖 4 ITL 於冷藏與冷凍環境下保存的穩定性 3.3 一級胺官能基與 ITL 反應時間之決定 一級胺官能基必須完全與 ITL 反應，才能正確地定量材料表面的一級胺含量。為了掌握一級胺官能基 與 ITL 反應所需要的時間，本研究將 100 mg 的胺基修飾奈米粒子分散於 5 ml (0.5 mM)的 ITL 溶液，並以迴 轉式震盪機進行攪拌，隨反應時間增加進行取樣分析 ITL 的殘留濃度，實驗結果顯示於圖 6。可以很清楚地 看出，需要歷經 10 h，ITL 的殘留濃度才能保持不變，也就是說奈米粒子表面的一級胺需要 10 h 才能完全 地與 ITL 反應。而磁石攪拌能提供更理想的攪拌均勻度，確保奈米粒子表面的一級胺在 10 h 內能完全地與 ITL 反應。根據此結果，後續的分析條件均將奈米粒子與 ITL 的反應時間訂為 10 h。
圖 6 不同的奈米粒子與 ITL 反應時間下的 ITL 殘留量。
3.4 ITL 與 BCA 的呈色反應時間之決定
根據 subtractive ITL/BCA method 的原理，ITL 先與一級胺官能基反應，殘留的 ITL 與 BCA 進行呈色反 應，藉以定量 ITL 的殘留濃度。因此，理解 BCA 呈色反應的機制以及反應條件是精確定量 ITL 的關鍵。基 本上，BCA 的呈色機制可分兩大類型：(1)2 個 BCA 分子與 1 個亞銅離子(Cu+
)螯合，產物呈現紫色；(2)BCA 分子與半胱胺酸（cysteine）、胱胺酸（cystine）、色胺酸（tryptophan）、酪胺酸（tyrosine）等 4 種胺基酸或 是蛋白質進行反應，產物在 562 nm 有最大的吸收度。事實上，BCA 的呈色反應無法達到真正終點，所以， 進行呈色反應時，必須同時進行對照組實驗，才能正確地計算實驗組與對照組兩者之間吸收度的差異值； 此外，決定適當的呈色反應時間，也是分析流程標準化的必要工作。觀察 ITL 濃度的檢量線（圖 5(a)），呈 色反應時間對檢量線線性度的影響並不顯著，但是反應時間達到 1 h 以上，檢量線的再現性才趨於一致（圖 5(b)），實驗流程才能標準化。根據實驗結果，後續的實驗，ITL 與 BCA 的呈色反應時間皆設定為 1 h。
3.5 一級胺定量最適化分析條件之探討 圖 7 顯示 Fe3O4@SiO2以及 4 種不同條件合成的胺基修飾磁性粒子，表面胺基含量的鑑定結果，分析條 件為：ITL 分析試劑工作體積 0.8 ml、粒子添加量 20 mg、一級胺反應步驟以迴轉式震盪機進行攪拌，殘留 的 ITL 呈色反應時間 1 h。從先前 FTIR 鑑定以及表面電位的分析結果得知，4 種不同條件合成的胺基修飾 磁性粒子表面胺基含量並不相同，推測影響分析結果的關鍵因素在於攪拌均勻度不佳，粒子表面的胺基無 法完全與 ITL 反應。影響攪拌均勻度的原因包括：攪拌方式、粒子添加濃度、工作體積等，此結果亦顯示 分析條件需要進一步修正，才能獲得最適化條件。 圖 7 不同的胺基改質條件對於奈米粒子表面胺基含量之影響 以相同的 Fe3O4@SiO2-NH2奈米粒子作為分析對象，粒子與 ITL 反應的操作條件為工作體積 0.8 ml、使 用迴轉式震盪進行攪拌，粒子添加量分別為 5、10、15、20 mg 等之分析結果呈現於圖 8。理論上，粒子相 同但用量不同之下，得到的 ITL 殘留量雖有不同，但是經過計算後，單位質量的粒子表面胺基含量應該十 分接近。然而，圖 8 的數據卻顯示，材料表面胺基含量隨著粒子用量增加而降低；顯然地，這些數據違背 常理，推究其原因仍是攪拌均勻度不夠所致，需要使用更劇烈的攪拌方式，才能減少質傳阻力。 圖 8 Fe3O4@SiO2-NH2粒子的添加量對於胺基含量分析之影響 （ITL 總體積為 0.8 mL，攪拌方式為迴轉式震盪）。
影響攪拌均勻度的因素除了攪拌方式之外，反應容器的形狀體積以及反應溶液的工作體積也會改變擾 流模式因而影響攪拌效果。圖 9 的數據顯示，當工作體積為 0.8 ml 時，即使攪拌方式改為磁石攪拌，粒子 用量的多寡仍然會影響奈米粒子表面胺基含量分析的準確性，此結果顯示，使用樣本瓶為反應容器，工作 體積為 0.8 ml，仍無法得到可信度高的分析結果，原因在於工作體積小、粒子用量太少，容易導致誤差放大。 因此，本團隊將工作體積提高為 4 ml，實驗結果如圖 10 所示，當粒子用量為 12.5 或是 25 mg，亦即濃度為 3.125 或 6.25 mg/ml 時，奈米粒子表面胺基含量的誤差可降低至 10%以下。 圖 9 Fe3O4@SiO2-NH2粒子的添加量對於胺基含量分析之影響 （ITL 總體積為 0.8 mL，攪拌方式為磁石攪拌）。 圖 10 Fe3O4@SiO2-NH2粒子的添加量對於胺基含量分析之影響 （ITL 總體積為 4 mL，攪拌方式為磁石攪拌）。
4. 結 論
奈米粒子表面官能基的定性鑑定可以仰賴紅外線吸收光譜、核磁共振光譜、元素分析等儀器；但是， 直接定量分析官能基含量的方法並不多。根據 subtractive ITL/BCA method 的原理，先將 ITL 與奈米粒子表 面一級胺進行反應，再以 BCA 定量殘留的 ITL 濃度，可以反推得到一級胺的莫耳數，進一步獲得粒子表面 一級胺的含量。本研究簡化了 subtractive ITL/BCA method 分析試劑的組成，釐清分析步驟中每一項細節對 於分析結果準確度的效應，最後建立標準化的分析流程。本文提出的操作流程與注意事項，將可應用於定量各種材料表面一級胺官能基的含量。
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