國立臺灣大學生物資源暨農學院森林環境暨資源學系 碩士論文
School of Forestry and Resource Conservation College of Bioresources and Agriculture
National Taiwan University Master Thesis
樟屬植物葉子精油之抗發炎活性
Anti-inflammatory Activity of Leaf Essential Oils from Cinnamomum Trew.
羅啟元 Chi-Yuan Luo
指導教授：張上鎮 博士
Advisor: Shang-Tzen Chang, Ph.D.
中華民國 101 年 7 月
July, 2012
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謝誌
感謝天主！我可以寫謝誌了！回顧這段求學過程，有快樂，有辛酸，有瘋狂，
有感動，種種經歷都豐富了我的生命。首先，特別感謝指導教授－張上鎮老師，
老師就像是人生的第二位父親，無論在研究指導、為人處事或生涯規劃上，都費 心聆聽且耐心指導，我會永遠把老師常說的「知福、惜福」及「無患無位，患無 以立」謹記在心。感謝口試委員王升陽老師、張惠婷老師、鄭森松老師及葉汀峰 老師，在百忙之中細心批閱釜正，並於論文口試時給予許多寶貴的意見，使論文 更加完整，在此衷心地表達敬謝之意。
感謝在實驗上給予我許多指導與建議的鈺棠學姐、群雅學長、佩翎學姐、資 正學長、惠菁學姐、文馨學姐、慶餘學姐及品昇學長，未來也以各位學長姐為榜 樣，勉勵自己在人生各個階段都要有積極進取、認真負責的態度。感謝時時給我 協助與鼓勵的奇美阿姨、程阿姨、梁阿姨、富蘭學姐、昆源學長、若鋆學姐、季 玲學姐、克恭學長、閔傑學長、盈如學姐、為君學姐、藍婷學姐、璧庭學姐、煥 祐博士、羅猛博士，以及一起做實驗的好夥伴育涵、信甫、立昇、彥如、子萱、
政喬、乃瑜、秉和、菀蓉、于庭、心慈、懋如、怡秀、仁華、思親、念之、宮民、
棨文、子華、安田、伯誠、嘉紜、譯陽及銀玨等，有你們的陪伴，讓實驗過程充 滿歡樂。謝謝一起在研究所奮鬥的麗雪、雅筠、慧雯、瀅茜、宜穎、韻潔、子婕、
大利、柏亨、泳升、為巽、泓碩、世俊、博陽、偉平、伯峰、旨价、巽安及永信 等好友，謝謝你們總是傾聽我的喜悅與悲傷，常常陪我吃飯、陪我瘋，一定要特 別謝謝情侶檔們，常常讓任性的我當你們家的跟屁蟲或寵物。
感謝可敬的神父們，特別是親愛的賴神父，你們溫暖的關心與祈禱給予我最 大的平安與喜樂；輔祭團及禮儀團的團員們，謝謝你們一直做我最有力的後盾，
讓每個禮儀順利完成；謝謝光啟的夥伴、朝聖之旅結交的好友以及喜樂生活團的 哥哥姐姐們，你們像家人一般，總能讓我安心地分享生活點滴，也謝謝你們時時 給予我最窩心的談話與打氣。親愛的酒肉朋友、動物幫的好友以及可愛的草泥馬
先生，我和你們一見如故，像是認識了一輩子一樣，少了你們就如同魚少了水，
生活將會枯燥乏味。
所謂好酒沉甕底，在最後，我要誠摯地感謝親愛的老爸、老媽、老哥、老狗 多多及老狗皮皮，謝謝你們一直以來的支持與陪伴，特別是我最愛的母大人，隨 著年齡增長，我了解愛要及時，口試完的那晚，我喝醉哭喊的「媽媽，我愛妳！」
絕對是酒後吐真言啦！
羅啟元 謹致 壬辰年夏 于生物材料化學與改質研究室
I
目錄
目錄 ... I 表目錄 ... V 圖目錄 ... VI 摘要 ... XII Abstract ... XIV
壹、前言 ... 1
貳、文獻回顧 ... 3
一、發炎反應... 3
（一）脂多醣 ... 5
（二）巨噬細胞 ... 5
（三）核轉錄因子－NF-κB ... 6
（四）巨噬細胞活化之產物 ... 7
（五）發炎路徑蛋白－iNOS ... 7
（六）發炎路徑蛋白－COX-2 ... 8
（七）第一型血紅素氧化酶－HO-1 ... 8
（七）常見之抗發炎藥物 ... 10
二、植物精油... 11
（一）精油之定義 ... 11
（二）精油之功用 ... 11
三、樟屬植物簡介 ... 13
（一）土肉桂 ... 13
（二）胡氏肉桂 ... 14
（三）錫蘭肉桂 ... 14
II
（四）山肉桂 ... 14
（五）香桂 ... 14
（六）陰香 ... 15
四、常見樟屬植物精油之抗發炎活性 ... 15
（一）土肉桂葉子及枝條之抗發炎活性... 15
（二）山肉桂果實之抗發炎活性 ... 16
参、材料與方法 ... 17
一、試驗材料... 17
（一）樹種 ... 17
（二）藥品 ... 17
（三）細胞株 ... 18
二、試驗方法... 19
（一）精油萃取 ... 19
（二）精油揮發成分分析 ... 19
（三）E-Citral 及 Z-Citral 之分離... 20
（四）精油成分定量 ... 20
（五）以 LPS 誘導巨噬細胞 RAW 264.7 生成 NO ... 20
（六）以 LPS 誘導巨噬細胞 RAW 264.7 生成 PGE2 ... 21
（七）精油及其成分抗發炎活性之協同作用評估 ... 21
（八）蛋白質萃取 ... 22
1. 總蛋白質萃取 ... 22
2. 細胞核及細胞質蛋白萃取 ... 23
（九）蛋白質電泳分析 ... 24
1. 蛋白質濃度定量... 24
III
2. 電泳膠片製作 ... 24
3. 蛋白質電泳 ... 24
4. 蛋白質轉印 ... 25
5. 免疫染色法 ... 25
（九） 統計分析 ... 26
肆、結果與討論 ... 27
一、精油成分分析 ... 27
（一）精油成分及其相對含量 ... 27
（二）E-Citral 及 Z-Citral 於精油及標準品內之混合比例 ... 30
二、精油及其成分之抗發炎活性 ... 30
（一）精油抑制 NO 生成之功效 ... 30
（二）精油對 iNOS 蛋白及 COX-2 蛋白表現之影響 ... 32
（三）精油成分抑制 NO 生成之活性 ... 36
三、胡氏肉桂葉子精油及抗發炎成分之抗發炎機制 ... 44
（一）胡氏肉桂葉子精油抑制發炎反應之機制 ... 44
（二）E-Citral 及 Z-Citral 之抗發炎機制 ... 45
（三）E-Citral 及 Z-Citral 促進 HO-1 蛋白表現之活性 ... 50
（四）E-Citral 及 Z-Citral 抗發炎之協同功效 ... 52
四、肉桂醛型土肉桂及錫蘭肉桂葉子精油混合配方之抗發炎活性 ... 55
（一）葉子精油及其主成分混合配方之抑制 NO 生成活性 ... 55
（二）葉子精油及其主成分混合配方之抑制 PGE2生成活性 ... 57
（三）葉子精油及其主成分混合配方之抗發炎機制 ... 60
（四）葉子精油及其主成分混合配方之抗氧化機制 ... 66
伍、結論 ... 70
IV
陸、參考文獻 ... 72
V
表目錄
表 1 樟屬植物葉子精油之成分及其相對含量（%） ... 28 Table 1 Their relative content (%) and constituents of Cinnamomum leaf essential oils 28 表 1 樟屬植物葉子精油之成分及其相對含量（%）（續） ... 29 Table 1 Their relative content (%) and constituents of Cinnamomum leaf essential oils (Cont.) ... 29 表 2 Citral 異構物以不同比例混合抑制 50%之 NO 生成的組合指數（CI） ... 54 Table 2 Combination index (CI) of different mixing ratios of citral isomers on inhibiting 50% of NO production ... 54
VI
圖目錄
圖 1 生物體受到外來物質刺激所啟動的免疫反應 ... 4
Fig. 1 Immune response initiated by exogenous stimulants in organism ... 4
圖 2 脂多醣之結構 ... 5
Fig. 2 Structure of lipopolysaccharide ... 5
圖 3 NF-κB 活化之發炎機制 ... 7
Fig. 3 Inflammatory mechanism of NF-κB activation ... 7
圖 4 第二階段反應酶之活化機制... 9
Fig. 4 Mechanism of phase II gene activation ... 9
圖 5 Isobologram 分析法 ... 22
Fig. 5 Isobologram analysis ... 22
圖 6 樟屬植物葉子精油於使用濃度為 50 或 20 μg/mL 時對 LPS 誘導 RAW 264.7 生成 NO 之抑制效果（%） ... 31
Fig. 6 Inhibitory effect (%) of Cinnamomum leaf essential oils on nitric oxide production of LPS-induced RAW 264.7 cells at the concentration of 50 or 20 μg/mL. ... 31
圖 7 使用濃度為 50 或 20 μg/mL 之樟屬植物葉子精油對細胞存活率（%）之影響.. ... 32
Fig. 7 Effect of cell viability (%) of Cinnamomum leaf essential oils at the concentration of 50 or 20 μg/mL. ... 32
圖 8 不同使用濃度之肉桂醛型土肉桂葉子精油（CO-Cin）對 LPS 誘導 RAW 264.7 之 iNOS 及 COX-2 蛋白表現之影響 ... 33 Fig. 8 Effects of different concentrations of C. osmophloeum ct. cinnamaldehyde (CO-Cin) leaf essential oil on iNOS and COX-2 expression in LPS-induced RAW
VII
264.7 cells ... 33 圖 9 使用濃度為 50 μg/mL 之樟屬植物葉子精油對 LPS 誘導 RAW 264.7 之 iNOS
及 COX-2 蛋白表現之影響 ... 34 Fig. 9 Effects of 50 μg/mL Cinnamomum leaf essential oils on iNOS and COX-2 expression in LPS-induced RAW 264.7 cells ... 34 圖 10 肉桂醛型土肉桂（CO-Cin）葉子精油（A）及 6 種樟屬植物（B）葉子精油
影響 LPS 誘導 RAW 264.7 之 iNOS 蛋白表現量 ... 35 Fig. 10 Effects of C. osmophloeum ct. cinnamaldehyde (CO-Cin) (A) and 6 Cinnamomum (B) leaf essential oils on iNOS expression level in LPS-induced RAW 264.7 cells. ... 35 圖 11 肉桂醛型土肉桂（CO-Cin）葉子精油及其主成分抑制 NO 生成之效果 .... 36 Fig. 11 Inhibitory effect (%) of C. osmophloeum ct. cinnamaldehyde (CO-Cin) leaf essential oil and its major constituent on nitric oxide production. ... 36 圖 12 錫蘭肉桂葉子精油及其主成分抑制 NO 生成之效果 ... 38 Fig. 12 Inhibitory effect (%) of C. zeylanicum (CZ) leaf essential oil and its major constituent on NO production ... 38 圖 13 枷羅木醇型土肉桂葉子精油及其主成分抑制 NO 生成之效果 ... 39 Fig. 13 Inhibitory effect (%) of C. osmophloeum ct. linalool (CO-LL) leaf essential oil and its major constituent on nitric oxide production. ... 39 圖 14 陰香葉子精油及其主成分抑制 NO 生成之效果 ... 40 Fig. 14 Inhibitory effect (%) of C. burmanii (CB) leaf essential oil and its major constituents on nitric oxide production. ... 40 圖 15 山肉桂（CI）葉子精油及其主成分抑制 NO 生成之效果 ... 41 Fig. 15 Inhibitory effect (%) of C. insularimontanum (CI) leaf essential oil and its major
VIII
constituents on nitric oxide production ... 41 圖 16 香桂（CS）葉子精油及其主成分抑制 NO 生成之效果 ... 42 Fig. 16 Inhibitory effect (%) of C. subavenium (CS) leaf essential oil and its major constituents on nitric oxide production. ... 42 圖 17 胡氏肉桂（CM）葉子精油及其主成分抑制 NO 生成之活性 ... 43 Fig. 17 Inhibitory effect (%) of C. macrostemon (CM) leaf essential oil and its major constituents on nitric oxide production ... 43 圖 18 胡氏肉桂（CM）葉子精油對 LPS 誘導 RAW 264.7 之 iNOS、COX-2 及 HO-1
蛋白表現之影響 ... 45 Fig. 18 Effects of C. macrostemon (CM) leaf essential oil on iNOS, COX-2 and HO-1 expression in LPS-induced RAW 264.7 cells. ... 45 圖 19 Z-Citral（A）及 E-Citral（B）對 LPS 誘導 RAW 264.7 之 iNOS 及 COX-2 蛋
白表現之影響... 47 Fig. 19 Effects of Z-citral (A) and E-citral (B) on iNOS and COX-2 expression in LPS-induced RAW 264.7 cells ... 47 圖 20 Z-Citral 及 E-Citral 對 LPS 誘導 RAW 264.7 之 iNOS 蛋白表現量 ... 48 Fig. 20 iNOS expression level of Z-citral and E-citral in LPS-induced RAW 264.7 cells...
... 48 圖 21 Z-Citral 及 E-Citral 對 LPS 誘導 RAW 264.7 之 COX-2 蛋白表現量 ... 48 Fig. 21 Effect of Z-citral and E-citral on COX-2 expression level in LPS-induced RAW 264.7 cells.. ... 48 圖 22 E-Citral 對 LPS 誘導 RAW 264.7 細胞核內 NF-κB 次單元 p50 蛋白表現（A）
之影響及蛋白定量結果（B） ... 49 Fig. 22 Effects of E-citral on p50 subunit expression of NF-κB (A) in the nuclear of
IX
LPS-induced RAW 264.7 cells and the results of protein quantification (B) . ... 49
圖 23 Z-Citral（A）及 E-Citral（B）對 LPS 誘導 RAW 264.7 之 HO-1 蛋白表現之 影響 ... 51
Fig. 23 Effects of Z-citral (A) and E-citral (B) on HO-1 expression in LPS-induced RAW 264.7 cells ... 51
圖 24 E-Citral 對 LPS 誘導 RAW 264.7 之 HO-1 蛋白表現之影響 ... 51
Fig. 24 Effects of E-citral on HO-1 expression in LPS-induced RAW 264.7 cells.. ... 51
圖 25 以 Isobologram 分析 Citral 異構物於抑制 NO 生成之功效 ... 53
Fig. 25 Isobologram analysis of inhibitory effects of citral isomers on nitric oxide production. ... 53
圖 26 以 Isobologram 分析肉桂醛型土肉桂（CO-Cin）及錫蘭肉桂（CZ）葉子精 油混合物抑制 NO 生成之功效 ... 56
Fig. 26 Isobologram analysis of inhibitory effect of the mixture of C. osmophloeum ct. Cinnamaldehyde (CO-Cin) and C. zeylanicum (CZ) leaf essential oils on nitric oxide production. ... 56
圖 27 以 Isobologram 分析 trans-Cinnamaldehyde 及 Eugenol 混合物抑制 NO 生成 之功效 ... 57
Fig. 27 Isobologram analysis of inhibitory effect of the mixture of trans-cinnamaldehyde and eugenol on nitric oxide production. ... 57
圖 28 肉桂醛型土肉桂（CO-Cin）、錫蘭肉桂（CZ）葉子精油及其混合物抑制 PGE2 生成之活性 ... 59
Fig. 28 Inhibitory effect (%) of C. osmophloeum ct. cinnamaldehyde (CO-Cin), C. zeylanicum (CZ) leaf essential oils and their mixture on PGE2 production. ... 59 圖 29 trans-Cinnamaldehyde（Cin）、Eugenol（Eug）及其混合物抑制 PGE2生成之
X
活性 ... 59 Fig. 29 Inhibitory effect of trans-cinnamaldehyde (Cin), eugenol (Eug) and their mixture on PGE2 production. ... 59 圖 30 肉桂醛型土肉桂（CO-Cin）、錫蘭肉桂（CZ）葉子精油及其混合物對 LPS
誘導 RAW 264.7 之 iNOS 及 COX-2 蛋白表現之影響 ... 60 Fig. 30 Effects of C. osmophloeum ct. cinnamaldehyde (CO-Cin), C. zeylanicum (CZ) leaf essential oils and their mixture on iNOS and COX-2 expression in LPS-induced RAW 264.7 cells ... 60 圖 31 肉桂醛型土肉桂（CO-Cin）、錫蘭肉桂（CZ）葉子精油及其混合物影響 LPS
誘導 RAW 264.7 之 iNOS（A）及 COX-2 蛋白表現量（B） ... 61 Fig. 31 Effects of C. osmophloeum ct. cinnamaldehyde (CO-Cin), C. zeylanicum (CZ) leaf essential oils and their mixture on iNOS (A) and COX-2 (B) expression level in LPS-induced RAW 264.7 cells. ... 61 圖 32 trans-Cinnamaldehyde（Cin）、Eugenol（Eug）及其混合物對 LPS 誘導 RAW 264.7 之 iNOS 及 COX-2 蛋白表現之影響 ... 62 Fig. 32 Effects of trans-cinnamaldehyde (Cin), eugenol (Eug) and their mixture on iNOS and COX-2 expression in LPS-induced RAW 264.7 cells... 62 圖 33 trans-Cinnamaldehyde（Cin）、Eugenol（Eug）及其混合物（Mix）影響 LPS
誘導 RAW 264.7 之 iNOS（A）及 COX-2 蛋白表現量（B） ... 63 Fig. 33 Effects of trans-cinnamaldehyde (Cin), eugenol (Eug) and their mixture (Mix) on iNOS (A) and COX-2 expression level (B) in LPS-induced RAW 264.7 cells.. 63 圖 34 肉桂醛型土肉桂（CO-Cin）、錫蘭肉桂（CZ）葉子精油及其混合物對 LPS
誘導 RAW 264.7 細胞核內 NF-κB 次單元 p50 蛋白表現（A）之影響及定量結 果（B）... 65
XI
Fig. 34 Effects of C. osmophloeum ct. Cinnamaldehyde (CO-Cin), C. zeylanicum (CZ) leaf essential oils and their mixture on p50 expression subunit of NF-κB (A) in the nuclear of LPS-induced RAW 264.7 cells and the results of protein quantification (B)... 65 圖 35 trans-Cinnamaldehyde（Cin）及 Eugenol（Eug）及其混合物對 LPS 誘導 RAW 264.7 細胞核內 NF-κB 次單元 p50 蛋白表現（A）之影響及定量結果（B） 66 Fig. 35 Effects of trans-cinnamaldehyde (Cin), eugenol (Eug) and their mixture on p50 subunit expression of NF-κB (A) in the nuclear of LPS-induced RAW 264.7 cells and the results of protein quantification (B). ... 66 圖 36 肉桂醛型土肉桂（CO-Cin）、錫蘭肉桂（CZ）葉子精油及其混合物對 LPS
誘導 RAW 264.7 之 HO-1 蛋白表現（A）之影響及蛋白定量結果（B） ... 67 Fig. 36 Effects of C. osmophloeum ct. cinnamaldehyde (CO-Cin), C. zeylanicum (CZ) leaf essential oils and their mixture on HO-1 expression (A) and the results of protein quantification (B) in LPS-induced RAW 264.7 cells. ... 67 圖 37 trans-Cinnamaldehyde（Cin）及 Eugenol（Eug）及其混合物對 LPS 誘導 RAW 264.7 之 HO-1 蛋白表現（A）之影響及蛋白定量結果（B） ... 69 Fig. 37 Effects of trans-cinnamaldehyde (Cin), eugenol (Eug) and their mixture on HO-1 expression (A) and the results of protein quantification (B) in LPS-induced RAW 264.7 cells. ... 69
XII
摘要
過度的發炎反應（Inflammation）會破壞細胞及組織，亦與許多慢性疾病的病 程發展有關，樟屬（Cinnamomum Trew.）植物富含特殊芳香成分及生物活性，其 抗發炎之功效非常值得深入探究，因此，本研究藉由 LPS 誘導巨噬細胞 RAW 264.7 產生一氧化氮（Nitric oxide, NO）之發炎模式，評估肉桂醛型土肉桂（Cinnamomum osmophloeum ct. cinnamaldehyde, CO-Cin）、山肉桂（Cinnamomum insularimontanum, CI）、胡氏肉桂（Cinnamomum macrostemon, CM）、香桂（Cinnamomum subavenium, CS）、錫蘭肉桂（Cinnamomum zeylanicum, CZ）、陰香（Cinnamomum burmanii, CB）
及枷羅木醇型土肉桂（C. osmophloeum ct. linalool, CO-LL）葉子精油的抗發炎活 性；同時，為了解 7 種樟屬植物葉子精油之抗發炎機制，以西方墨點法（Western blot）
分析葉子精油對 iNOS 與 COX-2 發炎蛋白表現的影響，同時亦探討其是否會影響 HO-1 抗氧化蛋白表現。
本研究結果得知，肉桂醛型土肉桂、胡氏肉桂、山肉桂及香桂葉子精油可顯 著降低 iNOS 蛋白表現，進而抑制 NO 生成，其抑制 NO 生成之 IC50值分別為 13.1、
35.1、40.2 及 41.8 μg/mL，具有良好的抗發炎活性；其中，胡氏肉桂葉子精油之抗 發炎活性源自於主成分－E-Citral 及 Z-Citral 兩異構物，其抑制 NO 生成之 IC50值 分別為 15.9 及 19.9 μg/mL，兩者皆能降低 iNOS 蛋白表現及促進 HO-1 蛋白表現，
具抗發炎及抗氧化活性，其中，E-Citral 能調控 NF-κB 之 Translocation，使 NF-κB 無法進入細胞核內，進而抑制 iNOS 表現；此外，Z-Citral 及 E-Citral 於精油內之混 合比值為 0.59，其抑制 NO 生成之活性亦被証實具有協同作用。
本研究亦證實肉桂醛型土肉桂及錫蘭肉桂葉子精油混合配方之抗發炎活性能 產生協同作用。肉桂醛型土肉桂及錫蘭肉桂葉子精油混合後能減少 NF-κB 蛋白表 現量，且更有效減少 iNOS 蛋白表現量，且能提升 HO-1 蛋白表現，產生抗氧化之
XIII
功效，進而更能抑制 NO 之生成，產生更有效的抗發炎作用。
【關鍵詞】樟屬植物、抗發炎、土肉桂、胡氏肉桂、檸檬醛、一氧化氮、誘發性 一氧化氮合成酶、協同作用
XIV
Abstract
Excessive inflammation will destroy the cells and tissues, and also has close relations with the developing progresses of chronic diseases. Previous studies indicated that Cinnamomum Trew. were abundant in aroma compounds and had specific bioactivities. The anti-inflammatory effect of Cinnamomum Trew. is very worthy of investigating.
In this study, the LPS-induced macrophage RAW 264.7 producing nitric oxide was used as an inflammatory model for evaluating the anti-inflammatory activities of Cinnamomum osmophloeum ct. cinnamaldehyde (CO-Cin), Cinnamomum macrostemon (CM), Cinnamomum insularimontanum (CI) and Cinnamomum subavenium (CS), Cinnamomum zeylanicum (CZ), Cinnamomum burmanii (CB) and C. osmophloeum ct.
linalool (CO-LL) leaf essential oils. The anti-inflammatory mechanisms of leaf essential oils from 7 Cinnamomum plants were examined according to the expressions of two inflammatory proteins, iNOS and COX-2, and the anti-oxidant protein, HO-1 by western blotting.
It was demonstrated that C. osmophloeum ct. cinnamaldehyde, C. macrostemon, C.
insularimontanum, and C. subavenium leaf essential oils could significantly suppress the iNOS expression and inhibited the production of NO, with the IC50 values of 13.1, 35.1, 40.2 and 41.8 μg/mL, respectively. It was proven that the C. macrostemon leaf essential oil had anti-inflammatory and anti-oxidant activities which resulted from the major constituents- E-citral and Z-citral, the two isomers which suppressed the iNOS expression and induced the HO-1 expression and their IC50 values of NO inhibition were 15.9 and 19.9 μg/mL, respectively. The mechanism of E-citral to inhibit the
XV
expression of iNOS was to suppress the NF-κB to translocate into the nuclear. Moreover, the mixture of E-citral and Z-citral with the ratio of 0.59, as they are in the essential oil of C. macrostemon leaf, was demonstrated to have a synergistic effect on inhibiting the NO production.
This result obtained in this study revealed that a synergistic anti-inflammatory effect was observed by combining C. osmophloeum ct. cinnamaldehyde and C.
zeylanicum essential oils. The essential oil mixture has a synergistic effect on NO inhibition for the reason that it was effective on suppressing NF-κB expression, and more effective than used alone on suppressing iNOS expression and inducing HO-1 expression.
【Keywords】Cinnamomum Trew., Anti-inflammation, Cinnamomum osmophloeum, Cinnamomum macrostemon, Citral, Nitric oxide (NO), Inducible nitric oxide synthase, Synergistic effect
1
壹、前言
人體面對病原攻擊時，會產生免疫反應以消滅病原，此時常伴隨著紅腫、灼 熱及疼痛等症狀。細菌所釋放的脂多醣（Lipopolysaccharide, LPS）會誘使體內產 生 Interlukin-1（IL-1）、Interferon-γ（IFN-γ）及 Tumor necrosis factor-α（TNF-α）
等細胞激素，促使體內的誘導性一氧化氮合成酶（Inducible NO synthase, iNOS）
及環氧酵素酶（Cyclooxygenase-2, COX-2）催化生成一氧化氮（Nitric oxide, NO）
及前列腺素（Prostaglandin E2, PGE2）等，此時的 NO 若與氧氣反應，易產生亞硝 基（N-nitroso group）化合物之致癌物，或對生物體內的 DNA 造成氧化、去胺基 化（Deamination）或斷裂等傷害，因此，抑制 NO 的生合成已成為當前用來治療 發炎症狀的策略之一（Tsai et al., 1999）。
以 LPS 活化巨噬細胞時所生成的發炎介質物可分為 3 類，第一類為蛋白質，
通常為細胞激素（Cytokine）及蛋白酶（Protease），其中 IL-1β、IL-6 與 TNF-α 為 常見促發炎細胞激素（Pro-inflammatory cytokine），引起血管擴張、紅、腫、熱及 痛等症狀，在發炎反應中扮演重要的角色；第二類為高反應性含氧分子如 NO，NO 為體內 iNOS 催化而成，通常與巨噬細胞抑菌與消滅微生物的機制有關；第三類為 脂質衍生物如前列腺素 PGE2的生成，當生物體受刺激時產生的 NO 與 COX-2 結 合，造成 COX-2 構型改變以合成 PGE2（Liang et al., 1999）。
早期常使用類固醇（Steroid）來減緩發炎現象，但類固醇易在人體累積而產生 許多副作用，因此，非類固醇抗發炎藥物（Non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID）便因應而生（黃智生，2008；Salvemini et al., 1996）。自古以來，人們為 了延緩老化、預防疾病及養生保健而食用各種草藥，這些民間用藥中具抗發炎活 性的成分便成為醫藥開發的要點（Ling et al., 1995）。
2
臺灣位處亞熱帶與熱帶交界，溫暖潮濕，地理型態豐富而孕育多種植物，其 中，樟屬（Cinnamomum）植物在臺灣分布廣泛，且多具有特殊的芳香成分與生物 活性，在民間常作為止痛、防蟲、退燒、發汗等藥用，目前亦有研究報告證實臺 灣原生樟屬肉桂節植物（Sect. Cinnamonum）如土肉桂（Cinnamomum osmophloeum Kanehira）枝條與山肉桂（Cinnamomum insularimontanum Hayata）果實精油確實 具有很好的抗發炎活性，極具開發為抗發炎藥物之潛力（Tung et al., 2008；Lin et al., 2008），若能使用這些舉手可得且具再生性的葉子精油做為抗發炎藥物，將更具 便利與推廣性。
為得知樟屬肉桂節植物葉子精油之抗發炎活性，本研究將藉由 LPS 誘導小鼠 巨噬細胞 RAW 264.7 生成 NO 之發炎模式，評估 7 種樟屬肉桂節植物葉子精油之 抗發炎活性，並進一步以西方墨點法（Western blot）分析精油對於發炎路徑相關 蛋白的抑制效果，期能了解不同樟屬肉桂節植物葉子精油之抗發炎機制；此外，
亦可藉由混合不同精油，評估是否能增強其抗發炎活性，以利未來樟屬植物之開 發與應用。
3
貳、文獻回顧
一、發炎反應
發炎（Inflammation）為人體受傷或抵禦外來微生物時之重要免疫反應之一。
一般而言，皮膚是防止細菌入侵的第一道防線，然而，當體表的溫度、酸鹼值及 分泌物皆無法阻止細菌侵入時，體內特定具吞噬作用（Phagocytosis）之細胞便進 行吞噬作用將外來微生物消滅，同時釋放促發炎細胞激素誘導發炎反應（Edris, 2007）。
發炎介質物適度地分泌時，可有效調節免疫反應，保護體內免受刺激物攻擊；
然而，若這些發炎介質物大量分泌時，往往造成負面的發炎症狀如紅、腫、熱、
痛等，甚至近年來亦有多項研究顯示發炎反應與許多慢性疾病，如心血管疾病、
慢性肝炎、過敏疾病及癌症的病程發展具高度相關性。血管壁的慢性發炎容易促 成心肌梗塞與腦中風，其發生原因為血液中的低密度脂蛋白膽固醇被血管內壁的 內皮細胞氧化後，進入血管內膜，會被認作侵略者而引發免疫反應，此時，單核 球便穿越血管內膜，分化成巨噬細胞並分泌促細胞激素產生發炎反應，使血管內 膜的平滑肌產生纖維斑，再次被認作是侵入者，使體內持續發炎反應，纖維斑逐 漸堆積成纖維帽，若纖維帽破裂，血液凝固因子便在破裂處凝血造成血栓而造成 心肌梗塞，若發生在腦部則導致中風（黃智生，2008；Vane and Botting, 2003）。
部分癌症亦與發炎反應有關，這是由於生物體遭受病原攻擊時，會誘使體內 的巨噬細胞產生急性發炎反應，產生大量的活性氧分子以消除病原，然而，過多 的活性氧分子亦會攻擊正常組織或細胞，使細胞內遺傳物質 DNA 遭到損壞，發生 突變而使細胞的分化與生長不正常，若重要的基因突變，則有可能形成惡性腫瘤
（Wattenberg, 1992；黃智生，2008）；此外，阿茲海默症亦與腦部發炎相關，人 類老化後，其 Amyloid 之前驅蛋白被酵素切割成 β-Amyloid，過量 β-Amyloid 經聚
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集沉澱造成腦內的斑塊，吸引免疫細胞攻擊，損傷腦細胞，但在臨床研究發現，
常服用抗發炎藥物的人較不易得到阿茲海默症，也間接證實發炎反應於阿茲海默 症中扮演著重要的角色，因此，抑制過度的發炎反應便成了醫藥發展之首要目標
（黃智生，2008）。
發炎反應機制整理如圖 1 所示，當細菌侵入人體時，細菌外膜的脂多醣 LPS 會誘導巨噬細胞（Macrophage）活化，並藉由抗原呈現細胞（Antigen presenting cell, APC）捕捉細菌的部份蛋白抗原（Antigen）提供給 T 細胞辨認，使其轉型為輔助 型 T 細胞（Helper T-cell）以釋放細胞激素與趨化激素（Chemokine），吸引更多 的巨噬細胞至感染處，此時，巨噬細胞會釋放 IL-1、IL-6 及 TNF-α 等促發炎細胞 激素，活化 iNOS 及 COX-2 後，便釋放出 NO 及 PGE2，引起紅、腫、熱、痛的發 炎反應（Salvemini et al., 1996；Kwon et al., 1998）。
NO
PGE2 LPS
Helper T cell
Macro- phage
Pro-inflammatory cytokines (IL-1, IL-6, TNF-α)
Cytokines and Chemokines
iNOS
COX-2
(Swelling , redness , heat, pain) Inflammatory
response Bacteria
APC
圖 1 生物體受到外來物質刺激所啟動的免疫反應
Fig. 1 Immune response initiated by exogenous stimulants in organism (Salvemini et al., 1996; Kwon et al., 1998)
以下將簡單介紹發炎反應相關的誘導物、免疫細胞、核轉錄因子、發炎蛋白 及抗發炎蛋白。
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（一）脂多醣
細菌（Bacteria）細胞壁的脂多醣屬於細菌內毒素（Endotoxin）之一，其結構 主要可分為親水性的聚多醣（Polysaccharide）及疏水性的 Lipid A（圖 2）（Guha and Machman, 2001；Miller et al., 2005），而 Glauser 等人（1994）發現無論天然或人工 合成的 Lipid A，皆可使宿主誘導發炎反應，但移除 Lipid A 後，LPS 隨即失去毒 性，由此得知 LPS 毒性的來源為 Lipid A，其構型影響巨噬細胞對於 LPS 的辨識
（Sedeyl, 2000）。
圖 2 脂多醣之結構
Fig. 2 Structure of lipopolysaccharide (LPS) (Guha and Machman, 2001)
（二）巨噬細胞
血液中的單核球（Monocyte）一旦進入受感染的組織部位便分化成巨噬細胞，
可產生 TNF-α 及 IL-1，以繁複的機制吸引白血球到感染部位；此外，巨噬細胞表 面覆有不同的 TLR（Toll-like receptor）而能辨識外來分子，藉由 TLR 與其外來分 子的 Ligand 結合而活化巨噬細胞，產生先天免疫反應（Innate immunity），進而提
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升巨噬細胞吞噬、毒殺、分泌發炎介質及活化 T 細胞等能力，不同的 TLR 對不同 微生物的產物與組成具有專一性，如巨噬細胞上的 TLR2 可辨識多種細菌的酯聚醣
（Lipoglycan），TLR4 與 LPS 形成專一性的結合。TLR 辨識外來病原後，便會進 一步產生訊息，活化核轉錄因子 NF-κB（Nuclear factor-κB），促使細胞激素、酵素
（Enzyme）及發炎蛋白的活化。
（三）核轉錄因子－NF-κB
NF-κB 在發炎反應中扮演著關鍵角色，為不同次單元體（Subunits）所構成，
包含 p50、p52、p65（RelA）、RelB 及 c-Rel，這些次單元體可兩兩組合成二聚體
（Dimer），其中，含有 p65（RelA）、RelB 或 c-Rel 等次單元體者，因具有活化區 段（Activation domain），可與 DNA 的結合區段（Binding domain）鍵結以活化目 標基因；而 p50 或 p52 的同二聚體（Homodimer）或異二聚體（Heterodimer）因不 具活化區段，無法活化目標基因，可做為轉錄抑制酶（Transcriptional repressor）
之用（Karin and Greten, 2005）。
如圖 3 所示，NF-κB 平時存在細胞質中，受負調控蛋白 IκB（Inhibitor of NF-κB）
牽制而呈現失活狀態（Inactivation），一旦受到細胞激素、細菌毒素、病毒代謝產 物 及 紫 外 光 等 內 生 或 外 來 因 子 的 刺 激 時 ，IκB 便 被 IKK-α 磷 酸 化 而 降 解
（Ubiquitination），NF-κB 釋放到核內與發炎相關基因的啟動子（Promoter）結合，
驅動該基因的表現（Albert, 2001）。藉由 NF-κB 的活化可調控細胞激素、趨化激素 及細胞黏附分子（Adhesion molecules）的表現，進而影響細胞的凋亡（Apoptosis）、
移動（Migration）、分化（Differentiation）及生長週期（Cell cycle）（Joyce et al. 2001）。
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I κ B p50 p65 P
I κB p50 p65 P
Ub Ub Ub
I κ B P
Ub
Ub Ub
p50 p65
p50 p65 NF-κB
α P α P
IKK-α
LPS
I κ B p50 p65
圖 3 NF-κB 活化之發炎機制
Fig. 3 Inflammatory mechanism of NF-κB activation (Albert, 2001)
（四）巨噬細胞活化之產物
巨噬細胞受到 LPS 刺激所生成的發炎介質物可分為 3 類，第一類為蛋白質，
通常為細胞激素及蛋白酶，其中 IL-1、IL-6 與 TNF-α 為常見促發炎細胞激素，可 促使發炎蛋白如 iNOS 與 COX-2 表現，並循環至下視丘，刺激促腎上腺素
（Adernocorticotropic hormone）分泌及產生發燒症狀，抑制病原菌生長，在發炎反 應中扮演重要的角色；第二類為高反應性含氧分子如 NO，通常與巨噬細胞抑菌與 消滅微生物的機制有關；第三類為脂質衍生物如前列腺素 PGE2的生成（Liang et al., 1999）。
（五）發炎路徑蛋白－iNOS
生物體有三種形式的一氧化氮合成酶（Nitric oxide synthase, NOS），分別為 eNOS（Endothelial NOS）、nNOS（Neuronal NOS）及 iNOS，其中，eNOS 與 nNOS
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不需誘導即自然表現，而 iNOS 在正常生理情況下不常表現，多存在血管平滑肌及 巨噬細胞，一旦受到 LPS 及細胞激素的活化，便將 L-Arginine 催化成 L-Citrulline 及大量高反應性氧分子 NO，以消滅外來侵入者，此外，NO 亦可與 COX-2 結合，
有助於改變 COX-2 的構型以大量生產 PGE2。一般而言，iNOS 功能為協調免疫系 統對癌細胞、外來細菌或病原體產生毒殺作用，故對生物體具有某種程度的保護 效果，然而當 iNOS 過度活化時，則會造成細胞毒性及敗血性休克的嚴重後果
（Vinegar et al., 1969）。
（六）發炎路徑蛋白－COX-2
與發炎反應相關的重要蛋白酶除 iNOS 外，尚有環氧酵素酶 COX-2，此種蛋 白酶的活化與造成紅、腫、熱及痛的前列腺素之生合成息息相關。目前已知可生 成 PGE2的 COX 蛋白酶有 2 種異構酶，分別為 COX-1 及 COX-2，COX-1 屬於體 內常在型的（Constitutive）酵素，廣泛存在於胃、腎、平滑肌及血小板等器官與組 織 ，負 責 調節一 般正常 生理功 能 ，分泌 保 護 黏膜的 黏液； COX-2 為誘發型
（Inducible）酵素，當組織受傷或受到內毒素、荷爾蒙及絲裂原（Mitogens）等刺 激時則被誘導而大量表現，並催化花生四烯酸（Arachidonic acid）轉變成為前列腺 素（Prostaglandin），此時所生成的前列腺素主要為 PGE
2，可擴張血管及調節血小 板凝集等作用（Xie et al., 1991；Smith and Langenbach, 2001）。
（七）第一型血紅素氧化酶－HO-1
血紅素氧化酶（Heme oxygenase, HO）可分為第一型血紅素氧化酶（HO-1）
及第二型血紅素氧化酶（HO-2），其中，HO-2 在體內常態性地存在與表現；而 HO-1 屬於第二階段反應酶（Phase II enzyme），在受氧化壓力時會大量表現，亦能調控 發炎反應，保護 DNA 免於受到體內過多自由基的傷害，其作用機制如圖 4 所示，
當體內產生過多的氧化壓力時，核轉錄因子 Nrf2（Nuclear factor E-2 related factor 2）
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被磷酸化（Phosphorelation）而脫離伴侶蛋白 Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1），此時，Nrf2 具有活性，隨即進入核內與 Maf 蛋白（Mosculoaponeurotic fibrosacroma）結合成二聚體，並與抗氧化基因起始區 ARE（Antioxidant response element ）結合，接著，進一步轉錄及活化第二階段反應酶 NQO1（NAD(P)H dehydrogenase, Quinone1）、GST（Glutathione S-transferase）及 HO-1 等，使細胞能 清除自由基（Giudice and Montella, 2006；Sporn and Liby, 2005；Cheung et al., 2009）。
Keap1
ROS electrophiles
Nrf2 P
Nrf2 P
Nrf2 Maf P
ARE Nrf2
P
Maf
Nuclear Transcription of
Phase II gene Phase II enzyme
(NQO-1、GST、HO-1)
Plasma
圖 4 第二階段反應酶之活化機制
Fig. 4 Mechanism of phase II gene activation (Giudice and Montella, 2006; Sporn and Liby, 2005)
根據 Cheung 等人（2009）之研究結果顯示，當小鼠巨噬細胞 RAW 264.7 受到 LPS 刺激時，發炎蛋白 COX-2 與 iNOS 會產生大量發炎物質及自由基，造成體內
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的氧化壓力而促使 HO-1 大量表現以調控發炎反應。Cheung 等人（2009）的研究 結果發現，Nrf2 基因產生缺陷的基因轉殖（Transient transfection）細胞無法正常調 控 HO-1 的表現，此時，以 LPS 刺激此細胞，其 HO-1 表現量減少，無法減緩氧化 壓力，進而造成 iNOS 及 COX-2 表現量增加。由上述結果得知，細胞可藉由核轉 錄因子 Nrf2 的調控，使 HO-1 抵抗體內的氧化壓力，進而降低發炎蛋白 iNOS 及 COX-2 的表現，減緩發炎反應。
（七）常見之抗發炎藥物
目前市售常見的抗發炎藥物可分為類固醇與 NSAID，早期，類固醇抗發炎藥 物廣為大眾所使用，又稱為＂美國仙丹＂，然而不良的使用習慣產生許多輕重不 同 的 副作 用， 嚴重 時可 引起 高血 壓、 消 化性 胃 潰瘍 與月 亮臉 等庫 氏症 候 群
（Cushing’s syndrome），因此，NSAID 便因應而生（黃智生，2008；Salvemini et al., 1996；Vane and Botting, 2003）。
一般在醫療上常使用 NSAID 如 Aspirin 來抑制 COX-2 酵素的作用，以阻斷生 成前列腺素，進而抑制發炎反應，舒緩紅、腫、熱及痛等症狀，然而，由於這些 非類固醇藥物往往也抑制 COX-1 的正常生理功能，非選擇性地抑制前列腺素生 成，而使胃酸分泌增加、黏膜血流量減少、細胞修復力的下降等，造成腸胃潰瘍 等傷害（Vane and Botting, 2003）。自古以來，人們為了延緩老化、預防疾病及養 生保健而食用各種草藥，而近年來，於日常生活中攝食具有保健機能的民間草藥 成為獨門養生之道，因而興起開發天然藥用植物的風潮。這些天然藥用植物所含 具療效的天然化合物亦被分離與純化，以供大眾需求，其中較不具副作用之抗發 炎活性成分更成為醫藥開發的重點（Ling et al., 1995）。
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二、植物精油
（一）精油之定義
森林中的樹木除可供生物棲息、調節環境溫濕度與降低溫室效應外，其生理 代謝過程中常釋放出具特殊氣味的揮發性化學物質，這化學物質多存在於植物的 腺體或油囊中，可以水蒸氣蒸餾法取得，因其具有殺菌、殺蟲、提神、穩定情緒 及醫療等功效，故為植物之精華，而此類化學物質自植物體分離後，比重較小而 以油狀懸浮於水面，故稱之為精油（張上鎮、王升陽，1998）。
精油組成以分子量較小且易揮發的萜類化合物（Terpenoids）為主，其基本骨 架為異戊二烯（Isoprene）的單元分子所構成。自然界最基本的萜類化合物由 2 個 異戊二烯連結而成者，稱作單萜類（Monoterpenoids）化合物，及其衍生的醇類
（Alcohols）、醛類（Aldehydes）及酮類（Ketones）等化合物，其他萜類尚有倍半 萜類（Sesquiterpene）及雙萜類（Diterpene）等，此外，精油亦含有酚類化合物
（Phenol）、脂肪酸（Fatty acid）或是少數含硫及氮的化合物，使其具有其他生物 活性，增添其利用性。
（二）精油之功用
自然界中，精油為植物二級代謝產物（Secondary metabolites），可抵禦細菌、
真菌及病毒的攻擊，具特殊氣味的化學物質可驅逐害蟲或攝食者，使植物體免於 損傷；某些精油成分亦可吸引傳媒採食花蜜與果實，使植物體得以受粉與播種；
此外，植物生長環境的氣溫過高及大氣紫外線過量時，可釋放出大量的精油萜類 成分於空氣中，幫助植物體降溫。
古埃及人已知精油具有殺菌、消毒、止痛及止血等生物活性且具有特殊氣味，
而常使用於木乃伊的屍體防腐與保存食物，也做為抗菌、解痙攣及局部麻醉等藥
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用；直到今日，精油的生理活性多與古文記載相符，而被廣泛地應用於醫療、美 容、食品、保養等領域，且由於科學技術的進步，使人們得以瞭解精油生物活性 的作用機制，甚至探索到更多的生物活性可應用在生活中（Edris, 2007；Mann et al., 2000）。精油的多種生物活性中，其抗細菌活性最廣為人知，如菌桂（Cinnamomum cassia Presel）樹皮、臺灣杉（Taiwania cryptomerioides Hayata）心材、百里香（Thymus vulgaris Linne ） 葉 子 及 肉 桂 醛 型 土 肉 桂 （ C. osmophloeum Kanehira ct.
cinnamaldehyde）葉子精油皆具有抑制細菌生長的效果（Tzakou et al., 1998；張上 鎮等，2000）。而 Mann 等人（2000）提出親脂性（Lipophilic）化合物如精油萜 類成分可與細胞壁的脂質結合，進而穿透細菌細胞壁而進入細菌體內達到破壞其 酵素活性，革蘭氏陰性菌的細胞壁含有約 25%的脂質，革蘭氏陽性菌細胞壁的脂 質較少，含量約為 0 至 2.5%，使精油成分較容易進入細菌體內，進而抑制其生長。
精油亦可做為日常保健食品使用，如土肉桂葉子精油可藉由抑制促發炎細胞 激素 IL-6 之生成（Chao et al., 2005），進而提升免疫力；錫蘭肉桂（Cinnamomum zeylanicum）葉子精油具有捕捉自由基能力而可抗氧化，防止體內因過多的氧化壓 力而造成 DNA 損傷、老化及癌症等疾病的發生（Naderi et al., 2004）。而多種疾病 的生成與體內發炎反應息息相關，自古以來，人們便常利用植物精油舒緩這些發 炎症狀，薰衣草（Lavandula angustifolia）及茶樹（Melaleuca alternifolia）等多種 精油便被用於治療發炎相關疾病，無論以口服、呼吸道吸入或皮膚吸收，都可有 效紓緩發炎症狀發生（Calcabrini et al., 2004；Edris, 2007）。
自古以來，中西藥典記載多種複方藥（Combination drugs）的使用，而芳香療 法亦常採用複方精油進行療程，由於精油中的活性成分在體內調控目標的機制複 雜，互相牽絆，因此，少量複方精油精混合後可藉由不同成分針對不同作用目標 進行調控，其治療疾病及舒緩疼痛的協同效果（Synergistic effect）往往較單獨使 用單方精油來得顯著，且達到一定療效的同時，可減少精油使用量，並降低其對
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人體代謝所造成的負擔，亦能減少抗藥性的發生。
三、樟屬植物簡介
樟屬植物為具有芳香油腺的常綠喬木或灌木，其葉子與樹皮多含有特殊氣味 的精油，本屬植物在全世界超過 300 種，分布廣泛，自熱帶到亞熱帶地區皆有，
而臺灣氣候溫暖潮濕且地理型態豐富，因此，孕育了不少樟屬植物，其中包含多 種肉桂類（Cinnamon）植物，因其具有特殊的芳香成分與生物活性，自古以來，
常做為發汗、退熱及止痛等臺灣民間藥用，此外，肉桂在中世紀時被視為最有價 值的香料之一，至今仍常使用肉桂植物的內層樹皮捲條或磨粉添加於食物中，以 增添其風味（應紹舜，1999）。
（一）土肉桂
土肉桂也叫假肉桂，為臺灣原生之常綠樹種，分布於海拔 400 至 1500 m。而 根據土肉桂葉子精油組成分，可分為 6 個化學品系（李漢中等，2003），其中，肉 桂醛型土肉桂葉子精油的化學組成與菌桂樹皮精油極為相似，因而成為明星樹 種，除供藥用和香料之外，可作為肉桂的代用品，受到多人矚目並添加於食品中
（Chang et al., 2001）。
目前已有許多報告指出土肉桂葉子精油及抽出成分具有多種生物活性，其中 包含抗病媒蚊（Cheng et al., 2004；2009）、抗白蟻活性（Chang and Cheng, 2002）、
抗紅火蟻（Cheng et al., 2008）、抗細菌（Chang et al., 2001）、抗退伍軍人菌
（Legionnella pneumophila）（Chang et al., 2008）、抗真菌（Cheng et al., 2006）、
抗黴菌（陳品方和張上鎮，2002）、抗植物病原菌（Lee et al., 2005）、抗天狗巢病 源菌（Aciculosporium take）（劉如芸等，2006）、抗氧化（吳季玲等，2007）、
抑制黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase）（Wang et al., 2008）、抗腫瘤（Huang et al., 2007）及抗發炎（Tung et al., 2010）活性。
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（二）胡氏肉桂
胡氏肉桂（Cinnamomum macrostemon）為常綠喬木，分布於中、低海拔森林，
目前已列為世界自然保育組織（International Union for Conservation of Nature, IUCN）物種保育等級評估為易受害（Vulnerable）之稀有植物，代表胡氏肉桂屬於 小而持續下降的族群，能繁殖之成熟個體少於10000株，隔離之能繁殖或成熟個體 少於1000株，而需受到保護與繁殖（呂勝由等，1999）。
（三）錫蘭肉桂
錫蘭肉桂原產於印度及錫蘭，於 1901 年引進臺灣栽植，多栽植於庭園內（應 紹 舜 ， 1999 ） ， 常 取 其 樹 皮 內 層 作 為 香 辛 料 使 用 ， 且 其 精 油 含 有 trans-Cinnamaldehyde，而多使用於冰淇淋、烘焙食品、口香糖、肉類製品及化妝 品等產品，並可作為醫療使用；其葉子含有精油，主成分為 Eugenol，其含量為 70%
以上，常用於香水調配、食品及醫藥殺菌使用（謝瑞忠，1997；Senanayake et al., 1978）。
（四）山肉桂
山肉桂原生於臺灣，具有特殊的香氣，為常綠喬木，長久以來被使用於臺灣 的傳統醫學用藥。Lin 等人（2003）研究顯示，山肉桂水萃物具有抗病毒活性；且 從其根部分離出的 Actinodaphnine 對於 Mel-5 黑色素細胞、HL-60 血癌細胞以及 Hepatoma Mahlavu 肝炎細胞皆具有效的毒殺作用（Hsieh et al., 2006）；此外，山 肉桂果實精油具有良好的抗發炎活性，能有效抑制 Croton oil 誘導小鼠之耳發炎反 應及 LPS 誘導 RAW 264.7 產生之發炎反應（Lin et al., 2008）。
（五）香桂
香桂（Cinnamomum subavenium）又稱巒大香桂、細葉子香桂、細葉子月桂及 香樹皮，廣泛分布於中國大陸東南部、印度、緬甸、越南、馬來西亞、印尼及臺
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灣（應紹舜，1999）。Su等人（2008）研究結果得知香桂葉子精油組成具有地理 品 系 之分 ，福山 植物園 採集之 香桂，其 葉 子 精油組 成分為 為 Methyl eugenol
（75.9%）、Linalool（7.3%）及Eugenol（6.6%），具有良好的捕捉DPPH自由基 之抗氧化能力，並且能有效抑制常見的8種細菌之生長；而蓮華池植物園之香桂葉 子精油組成分則為p-Cymene（21.6%）、1,8-Cineole（16.5%）及Linalool（11.9%），
其抗氧化能力雖不及福山植物園所採集之香桂，然而其抑菌能力較佳。
（六）陰香
陰香（Cinnamomum burmanii）引自於中國大陸，因生長快速且樹型筆直圓整，
而受到景觀業的歡迎，近年來多於環境綠美化及行道樹使用，由於陰香葉子生長 型態與土肉桂相似，而常混淆，故常被稱為假桂樹（尹華文等，2007；曾彥學，
2008），而陰香莖部甲醇抽出物具有顯著細胞毒性，具潛力抗癌，此外，其具有 不錯的 DPPH 捕捉能力及高總酚含量，而具有良好的抗氧化活性（Choi and Hwan, 2005）。
四、常見樟屬植物精油之抗發炎活性
近年來，許多研究報告進一步針對數種常見樟屬植物如土肉桂葉子與山肉桂 果實精油之生物活性進行研究與探討（劉如芸等，2006；Lee et al., 1999；Chen et al., 1995；Chang et al., 2001；2006；2008；Chang and Cheng, 2002；Cheng et al., 2004；
2006；2008；2009；Jayaprakasha et al., 2000；Mau et al., 2001；Wu et al., 1994；
Tung et al., 2008；Lin et al., 2008），由於其具有特殊抗發炎活性，因而使得樟屬 肉桂節植物抽出成分之抗發炎活性受到矚目。
（一）土肉桂葉子及枝條之抗發炎活性
Chao 等人（2005）指出 60 μg/mL 土肉桂葉子精油可有效抑制 LPS 誘導的發
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炎反應，隨著土肉桂葉子精油濃度上升，可逐步抑制 J774A.1 巨噬細胞的 proIL-1 蛋白質表現，同時可減少 IL-1β 及 IL-6 生成量達 50%，而 Chao 等人（2008）亦證 實土肉桂葉子精油的抗發炎活性源自其主成分 Cinnamaldehyde。
此外，Tung 等人（2008）之研究結果指出土肉桂枝條精油可有效抑制 NO 生 成，其 IC50為 11.2 μg/mL；進一步分析土肉桂枝條精油組成分，得知其主成分中 Cinnamaldehyde 及 Caryophyllene oxide 抑制 NO 生成的效果較優，使用濃度為 10 μg/mL 時，其抑制率分別為 59.9%及 54.0%，此時，土肉桂枝條精油對於 NO 生成 之抑制率僅為 43.3%，顯示精油抑制 NO 生成的活性源自 Cinnamaldehyde 及 Caryophyllene oxide。此外，當誘導發炎的細胞被施以 10 μg/mL 土肉桂枝條精油 時，其抑制 PGE2 生成量接近 65%，但精油主成分中如 Caryophyllene oxide 及 L-Bornyl acetate 即使在使用濃度 25 μg/mL 時，抑制 PGE2生成的效果僅為 18%與 28%，顯示土肉桂枝條精油抑制 PGE2生成可能是源於其微量成分，或主成分間的 協同作用。
（二）山肉桂果實之抗發炎活性
山肉桂果實精油及其主成分 Citral 可有效抑制發炎反應的 NO 生成，其 IC50 值分別為 18.7 與 13.2 μg/mL，且隨著 Citral 濃度增加，亦可抑制 TNF-α 生成，顯 示 Citral 為山肉桂果實精油主要的抗發炎成分；進一步藉由西方墨點法（Western blot）分析 Citral 之抗發炎機制，蛋白表現結果顯示當 Citral 濃度越高，NF-κB 蛋 白表現漸弱，IκBα 仍保有一定的活性，因而推知 Citral 可有效阻止 iNOS 蛋白轉錄 因子 NF-κB 的活化，進而達到抑制 iNOS 表現，得以產生抗發炎活性；並利用 Croton oil 誘導小鼠耳栓發炎之動物模式，評估山肉桂果實精油與 Citral 的抗發炎活性，
其結果顯示精油與 Citral 之濃度愈大，愈能抑制發炎反應（Lin et al., 2008）。
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参、材料與方法
一、試驗材料
（一）樹種
本 試 驗 採 用 試 材 為 胡 氏 肉 桂 （ C. macrostemon, CM ）、 山 肉 桂 （ C.
insularimontanum Hayata, CI）、香桂（C. subavenium, CS）、肉桂醛型土肉桂（C.
osmophloeum Kanehira ct. cinnamaldehyde, CO-Cin ）、 枷 羅 木 醇 型 土 肉 桂 （ C.
osmophloeum Kanehira ct. linalool, CO-LL）、陰香（C. burmanii, CB）及錫蘭肉桂（C.
zeylanicum, CZ），共 7 種樟屬肉桂節植物葉子。肉桂醛型土肉桂於 2008 年 1 月採 集自宜蘭福山植物園，證據標本（Voucher specimen）之編號為 CO - 11401，山肉 桂於 2009 年 2 月採於新店信賢苗圃，編號為 CI - 0401，其餘所有試材均於 2007 年 8 月初單株採集，胡氏肉桂於採集自文化大學華林林場，編號為 CM - 0501，香 桂採集自新店信賢苗圃，編號為 CS - 0201，枷羅木醇型土肉桂採集自埔里蓮華池 營養系園，編號為 CO - 0615，陰香採集自政治大學後山，編號為 CB - 0201，而錫 蘭肉桂採集自埔里民宅，編號為 CZ - 0301。採集之葉子由林業試驗所呂勝由先生 及許原瑞先生鑑定，均於常溫環境下氣乾及保存於生物材料化學與改質研究室，
以供後續試驗進行。
（二）藥品
本 試 驗 所 用 之 標 準 品 包 括 trans-Anethole 及 Camphene 購 自 ICN ， Benzaldehyde、L-Bornyl acetate、trans-Cinnamyl acetate、Caryophyllene oxide、
1,8-Cineol、Citral、p-Cymene、Eugenol、(+)-Limonene、(-)-Limonene、Linalool、
α-Pinene 、 β-Pinene 、 3-Phenylpropionaldehyde 及 α-Terpineol 購 自 Acros ， trans-Cinnamaldehyde 購自 Alfa Aesar，trans-β-Caryophyllene 及 n-Tetradecane 購自
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TCI，(-)-α-Copaene 購自 Fluka，Ethyl acetate 購自 ECHO Chemical CO. Ltd。所有 標準品皆以乙酸乙酯（Ethyl acetate）為溶劑，稀釋至 50 ppm 以利精油成分分析。
細胞試驗所用培養基為 DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）購自 Sigma 與胎牛血清 FBS（Fetal bovine serum）購自 Gibco。細胞試驗所用之樣品溶劑為 DMSO（Dimethyl sulfoxide）購自 Sigma，誘導細胞產生發炎之細菌毒素為 LPS
（ Lipopolysaccharide ） 購 自 Sigma 。 細 胞 毒 性 試 驗 反 應 所 用 之 藥 品 為 MTT
（3-(4,5-Dimethyldiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）購自 Sigma。
蛋白質電泳分析所用之藥品為 40% Acrylamide/bis（37.5/1）購自 Bio Basis；
Ammonium persulfate、Boric acid、Sample buffer loading dye、TEMED 購自 JT Baker，Bovine fetal serum albumin、BSA reagent、Celytic M、EDTA、Sodium chloride、
Protease inhibitor 購自 Sigma，Chemiluminescent HRP substrate kit 購自 Millipore，
Glycine 、Methanol、Sodium dodecyl sulfate 購自 Merck，Protein marker 購自 Fermentas，Tris、Polyvinylidene difluoride 購自 Bio-Rad；免疫分析所使用之一級抗 體為 COX-2 polyclonal antibody-affinity purified 購自 Cayman，Anti-iNOS/NOSII 及 Anti-Histone H3 購自 Millipore，HO-1 購自 Enzo life Science，Polyclonal NF-κB 購 自 abcam，Anti-β-actin 購自 Sigma；二級抗體為 Peroxidase-conjugated affinipure goat anti-rabbit IgG 及 Peroxidase-conjugated affinipure goat anti-rabbit IgG 購自 Jakson。
（三）細胞株
本試驗所採用之細胞株 RAW 264.7 為一發展自 BALB/c 小鼠單核細胞的巨噬 細 胞 株 BCRC 60001 ， 購 自 食 品 工 業 發 展 研 究 － 生 物 資 源 保 存 及 研 究 中 心
（Bioresource collection and research center）。此細胞株培養於含 10%FBS 的 DMEM 培養基，置於 37℃且 CO2含量為 5%之培養箱培養。
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二、試驗方法
（一）精油萃取
樟屬植物葉子利用水蒸餾法（Hydrodistillation，HD）萃取精油。萃取方法是 將約 200 g 葉子加入 1000 mL 的蒸餾水，萃取 6 h 後收集精油並計算收率（w/w, %）。
（二）精油揮發成分分析
精 油 以 乙 酸 乙 酯 稀 釋 成 50 ppm 後 ， 注 入 氣 相 層 析 質 譜 儀 （ Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）進行成分鑑定。所使用之氣相層析儀 為 Polaris Q GC/MS System（Thermo），採 DB-5ms 分離管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），以 1 mL/min 氦氣作為載送氣體，注射口（Injection port）溫度 270℃，離子 源溫度 230℃，質譜掃描範圍 50-400 a.m.u.，升溫條件為起始溫度 60℃，持溫 1 min，
第一段升溫以 4℃/min 升溫至 220℃後，持溫 2 min，第二段升溫以 20℃/min 升至 250℃後，持溫 3 min。以 10:1 之分流比（Splitting ratio）導入層析儀，最後再送入 質譜儀（Polaris Q MSD）中，精油各成分含量由氣相層析圖之波峰面積計算，鑑 定則與 National Institute of Standards and Technology（NIST）V. 2.0 和 Wiley 7.0 資 料庫的質譜比對，並以標準品進行共注射（Co-injection）作確定，亦使用 Kovats indices（KI）進行比對（Adams, 2007），其 KI 值的計算公式如下所示：
t'R(N)和 t'R(N+n)：為碳數 N 及 N + n 之同質系的 n-Alkanes 修正留滯時間，但未知化
合物 X 之留滯時間必須介於碳數 N 及 N + n 之 n-Alkanes 之留滯時間。
t'R(x)：為未知化合物 X 之修正留滯時間。
KI = 100N + 100n
Log t'R(x)－Log t'R(N)
Log t'R(N+n)－Log t'R(N)
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（三）E-Citral 及 Z-Citral 之分離
為獲得組成 Citral 之兩異構物，供成分定量及試驗使用，首先利用矽膠薄層層 析（Thin layer chromatography, TLC，Silica gel, 60RP-18 F254，Merck Co.），以不 同比例之正己烷與乙酸乙酯為展開溶液，尋求 E-Citral 及 Z-Citral 最佳之分離條件；
進一步利用高效能液相層析（High performance liquid chromatography, HPLC）進行 分離與純化得到 E-Citral 及 Z-Citral，供後續試驗使用。HPLC 採用之高壓幫浦為 Hitachi L-7150，並使用折射率檢測器（Hitachi L-7490），分離管柱採 Phnomenenex○R Luna silica RP-18（250 mm × 10 mm, 5 μm），移動相（Mobile phase）為正己烷/
乙酸乙酯 = 88/12，流速為 4 mL/min。
（四）精油成分定量
將標準品混合後經乙酸乙酯稀釋成 50、25、10、5 及 1 μg/mL，而不同精油則 分別配置成 50 μg/mL，並另外配置 100 μg/mL 的內標品（Internal standard）
n-Tridecane。取 1000 μL 標準品及精油分別與 100 μL 內標品均勻混合，從中取 1 μL 注入 GC-MS，將其分析所得標準品及精油成分面積分別與內標品面積相除，並製 作檢量線定量精油主成分。
（五）以 LPS 誘導巨噬細胞 RAW 264.7 生成 NO
96 孔 ELISA 微量盤種入繼代數為 5 至 10 代之間的 RAW 264.7（2 × 105 cells/well），待細胞貼附 4 h 後，加入含不同濃度樣品之 DMEM 於細胞中，於培養 箱培養 1 h 後再加入 LPS（1 μg/mL）刺激巨噬細胞，經 24 h 培養後分別進行 NO 與細胞毒性檢測。NO 測定採 Griess 法（Kim et al., 1999）：取 100 μL 上述反應之 細 胞 上 清 液 ， 加 入 等 量 Griess reagent （ 1% 的 Sulfanilamide 及 0.1% 的 N-1-Napthylethylenediamine dihydrochloride），反應 10 min 後，以免疫酵素分析儀
（Elisa reader）（Spectra Max 190, Molecular Device Corporation）測位於波長 540 nm
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之吸光值。細胞毒性檢測則以 MTT 法進行（Moosman, 1983）：將上述 96 孔 ELISA 微量盤中的小鼠巨噬細胞上清液完全移去，加入100 μL 含 MTT（0.8 mg/mL）的 新鮮 DMEM，置於培養箱 30 min，移去所有上清液，並添加 100 μL 之 DMSO 溶 解紫色 MTT 結晶，以免疫酵素分析儀測其波長 570 nm 的吸光值。
（六）以 LPS 誘導巨噬細胞 RAW 264.7 生成 PGE2
96 孔 ELISA 微量盤種入繼代數為 5 至 10 代之間的 RAW 264.7（2 × 10５ cells/well），待細胞貼附 4 hr 後，加入含不同濃度樣品之 DMEM 於細胞中，於培 養箱經 1 hr 培養後再施加 LPS（1 μg/mL）刺激巨噬細胞，經 18 hr 培養後分別進 行 PGE2與細胞毒性檢測。PGE2 生成量之測定以 PGE2酵素免疫分析套件進行試 驗。細胞毒性檢測則以 MTT 法進行（Moosman, 1983）：將上述 96 孔 ELISA 微量 盤中的小鼠巨噬細胞上清液完全移去，加入100 μL 含 MTT（0.8 mg/mL）的新鮮 DMEM，置於培養箱 30 min，移去所有上清液，並添加 100 μL 之 DMSO 溶解紫 色 MTT 結晶，以免疫酵素分析儀測其波長 570 nm 的吸光值。
（七）精油及其成分抗發炎活性之協同作用評估
目前已有多種評估複方藥協同作用之方法（Chou, 2006），其中，組合指數及 Isobologram較被廣為使用，因此，本研究採用此二法評估不同精油及其成分混合 後之協同效果。
Isobologram之判讀以圖 5為例，虛線為判斷樣品混合後是否具有協同作用的 標準，其與X軸及Y軸之交點代表兩樣品分別為Drug 1及Drug 2的IC50值，分別為 X0及Y0；（X, Y）則代表當Drug 1及Drug 2混合使用時，個別藥物使用之IC50值轉化 成的座標，若（X, Y）坐落在虛線上，代表兩藥物混合等同兩藥效相加，具加乘效 果（Additive effect）；若（X, Y）坐落在虛線左方，代表兩藥物混合後優於兩藥效 相加的效果，具協同效果；若（X, Y）坐落在虛線右方，代表兩藥物混合不及兩藥
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相加，具拮抗效果（Antagonist effect），且若（X, Y）離虛線越遠，則代表其拮抗 或協同效果越顯著。
Concentration of Drug 1 at the 50% of inhibition rate
( X , Y )
( X0, 0 ) ( 0 , Y0)
Synerigistic
Antagonistic
Additive
Concentration of Drug 2at the 50% of inhibition rate
圖 5 Isobologram 分析法
Fig. 5 Isobologram analysis (Chou, 2006)
組合指數（Combination index, CI）評估表示如下：
Combination index（CI）= X X0
Y Y0 +
當組合指數等於 1 時，代表兩樣品混合使用具加成作用；大於 1 則代表兩樣 品混合使用具拮抗作用，其數值越大顯示結抗效果越顯著；小於 1 則代表兩樣品 混合使用具協同作用，其數值越小顯示協同效果越顯著。
（八）蛋白質萃取 1. 總蛋白質萃取
取 7.5 × 106個繼代數為 5 至 10 代之間的 RAW 264.7 細胞培養於 6 cm 培養皿，
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經 2 h 待細胞貼附，即加入不同濃度試樣於細胞，經培養 1 h 後加入 LPS（1 μg/mL）
誘導細胞發炎。細胞經 LPS 刺激 18 h 後，將其培養液移除並使用冰冷的 PBS 清洗 細胞，再以刮刀取下細胞後存於 2 mL 之微量離心管，於 4℃以 500g 離心 5 min，
離心完成後立即除去上清液，並加入150 μL Cell lysis buffer（Celytic M, Sigma）及 1%的蛋白酶抑制劑（Protease inhibitor, Sigma），經均勻振盪後於 4℃以 14000g 離 心 10 min，當離心結束後，立即將上清液移至乾淨的 2 mL 微量離心管，即可進行 實驗或保存於-80℃環境待後續試驗使用。
2. 細胞核及細胞質蛋白萃取
取 7.5 × 106個繼代數為 5 至 10 代之間的 RAW 264.7 細胞培養於 6 cm 培養皿，
經 2 h 待細胞貼附，即加入不同濃度試樣於細胞，經培養 1 h 後加入 LPS（1 μg/mL）
誘導細胞發炎。細胞經 LPS 刺激 1 h 後，將其培養液移除並使用冰冷的 PBS 清洗 細胞，再以刮刀取下細胞後存於 2 mL 之微量離心管，於 4℃以 500g 離心 5 min，
離心完成後立即除去上清液，並加入冰冷的 100 μL 的 CERI 及 1%的蛋白酶抑制 劑（Thermo），以最高速率振盪微量離心管約 15 sec 後，靜置於冰上，待 10 min 後於微量離心管加入冰冷的 CERII，並以最高速率振盪 5 sec，靜置於冰上，待 1 min 後以 16000g 之速率離心 10 min，離心結束後迅速取出其上清液置於預冷的微量離 心管中，此上清液即為細胞質蛋白，可進行試驗或置放於-80℃待後續使用貯存。
微量離心管內含有剩餘的細胞核沉澱物，此時，加入冰冷之 NER 於微量離心 管，並以最高速率振盪 15 sec 後靜置於冰上，每隔 10 min，以最高速率振盪微量 離心管 15 sec，執行 40 min 後，以 16000g 之速率離心 10 min，離心結束後迅速取 出其上清液置於預冷的微量離心管中，此上清液即為細胞核蛋白，可進行試驗或 置放於-80℃待後續使用貯存。
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（九）蛋白質電泳分析
1. 蛋白質濃度定量
本實驗採用 Bradford assay 進行蛋白濃度定量。首先取牛血清蛋白 BSA（Bovine fetal serum albumin）以去離子水稀釋成 0.1 μg/mL，並取其以不同體積與 200 μL 之 蛋白質呈色劑（BSA reagent）混合，並添加去離子水至 1000 μL，使其最終濃度為 0、1、2.5、5 及 7.5 μg/mL，在 595 nm 波長下以酵素免疫分析儀偵測吸光值，製 作蛋白標準曲線。接著取 1 μL 待測試樣，加入去離子水至 800 μL 並與 200 μL 蛋 白質呈色劑均勻混合後，測定其波長 595 nm 的吸光值，並以回歸方式取得各個細 胞試驗的蛋白質濃度。
2. 電泳膠片製作
以鑄膠器製備 10%Separating gel，取 2418 μL 去離子水、1250 μL 之 Acrylamide
（Acrylamide : bis = 37.5 : 1，40%）、1250 μL pH 8.8 之 1.5 M Tris-HCl、50 μL SDS
（10%）、30 μL APS（10%）與 2.5 μL TEMED 均勻混合後，於室溫下聚合反應 1 h，
待完全聚合；再加入 5% Stacking gel，取 1510 μL 去離子水、312.5 μL 之 Acrylamide
（Acrylamide : bis = 37.5 : 1，40%）、625 μL pH 6.8 之 0.5 M Tris-HCl、25 μL SDS
（10%）、25 μL APS（10%）與 2.5 μL TEMED 均勻混合後，於其上方插上齒梳，
室溫下聚合反應 30 min，待完全聚合後即可除去齒梳。製好的電泳膠片裝置在電 泳槽後加入待測試樣即可進行電泳。
3. 蛋白質電泳
將電泳膠片裝置在電泳槽上，並填滿電泳緩衝液（Running buffer，內含 90 mM 且 pH 8.4 之 Tris，80 mM Boric acid，2.5 mM EDTA．2 Na，1% SDS），取一定量 的蛋白質混合 Sample buffer loading dye（Protein：Sample buffer loading dye = 4：1），
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於 95℃加熱 5 min 使蛋白質變性，並將變性後的蛋白質試樣與 3 μL Protein marker 分別注入電泳膠片中的各個溝槽（Well）中。首先以電壓 80 V 進行電泳，直至蛋 白質試樣位於 Separating gel 與 Stacking gel 交界處，再將電壓升高至 100 V，待其 蛋白分離至適當距離後即可停止電泳，並進行蛋白質轉印。
4. 蛋白質轉印
轉印前，先將 PVDF（Polyvinylidene difluoride）膜以甲醇浸濕 1 min，待其正 電基團活化後，將蛋白質轉印所需的濾紙、海綿片、PVDF 膜與完成電泳之膠片一 同浸泡於 Transfer buffer（48 mM Tris，39 mM Glycine，0.037% SDS，20% Methanol）
中。轉印裝置重疊依序為平鋪海綿片、濾紙、PVDF 膜、完成電泳之膠片、濾紙及 海綿片，最後蓋上負極電極板，最後將裝置放入轉印槽中，以 350 mA 轉印 60 min，
待轉印完成後便可取出 PVDF 膜，進行免疫分析。
5. 免疫染色法
以 TBST（pH 7.5 之 50 mM Tris，150 mM NaCl，0.05% Tween 20）配製成的 10%脫脂牛奶溶液（安佳脫脂奶粉）作為非特定性抗原（Non-specific antigen）阻 斷劑（Blocking buffer），以阻斷劑完全覆蓋轉印後的 PVDF 膜，在室溫下以振盪混 合器均勻搖晃 1 h，倒掉阻斷劑並以 TBST 沖洗 3 次，每次 5 min，即完成非特定 性抗原的阻斷。接著加入預先與脫脂牛奶混合的一級抗體 iNOS（1：2000）、COX-2
（1：2000）、NF-κB（1：2000）、HO-1（1：1000）與 β-actin（1：3000），於室溫 下均勻搖晃 2 h，使抗體與特定蛋白質結合，再以 TBST 沖洗 3 次，每次 5 min。
最後加入預先與脫脂牛奶溶液混合的二級抗體 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG
（1：10000）與 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG（1：10000），在室溫下均勻搖 晃 1 hr 後，再以 TBST 沖洗 3 次，每次 5 min，即可在避光條件下，添加適量的市 售冷光試劑組（Chemiluminescent HRP substrate kit）於 PVDF 膜上，經呈色 5 min
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後，以影像系統（G: Box Chemi XL, Syngene）顯影，另以影像分析軟體（Gene Tools, Syngene）數值化蛋白表現。
（九） 統計分析
統計分析採 SPSS 軟體系統（Version 17; SPSS Inc., Chicago, IL, USA）中單因 子變異數分析法（One-way ANOVA）及 Scheffe 統計方法，檢驗各組間是否具顯著 差異，分析時所使用之信賴區間為 95%。
