One-step synthesis of nitrogen-doped carbon dots of pH-sensitive and broad-response applications for cell imaging and real environmental testing.

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國立臺東大學應用科學系研究所碩士論文

Department of Applied Science National Taitung University

Master Thesis

一步合成 pH 敏感且響應範圍寬廣的氮摻雜碳點應用於細胞成像及真實環境檢驗

One-step synthesis of nitrogen-doped carbon dots of pH- sensitive and broad-response applications for cell

imaging and real environmental testing.

陳威廷 Wei-Ting Chen

指導教授：邱泰嘉博士胡焯淳博士 Advisor：Tai-Chia Chiu, Ph.D.

Cho-Chun Hu, Ph.D.

中華民國 107 年 7 月

July, 2018

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誌謝

隨著畢業季的到來，心裡難免有些悸動，終於可以讓求學的過程告一段落。

每年的臺東熱氣球都有光雕，像盞為了畢業生點亮的平安燈，今年更加璀璨，因為第一次在知本校園舉行，所以難忘；又正好遇上月食，所以更珍貴。如同一次遇上兩位指導教授邱泰嘉老師與胡焯淳老師，給予希望用愛與包容指導我完成碩士生涯與研究論文，在迷茫中指引新方向。也感謝曾韋龍教授借我使用儀器，

更來到知本擔任口試委員，提出許多建議，讓我論文更完善。也很感謝陳以文

老師的教導，令我學習到不少知識與人生道理。

回顧念碩士2 年的歲月中，感謝分析實驗室的至崴、哲輝、裕賢、婷雅、農

檢部同仁及所有的大學部小伴們，在實驗室中增添了許多歡樂。還有提早畢業的忠義與元傑，讓我問東問西不嫌煩；和我一起經歷口試的義聖及尹杰，雖然有時有些爭執，仍在我需要時幫助我完成各種難關，杰哥如果還有機會，下次吃矮子便當我請客嘻嘻。同樣感謝貫廷學長提供的建議與幫助都非常受益，讓粗心的

我有個把關。還有裕軒學長、建盛和中山的俊國學長幫助我拿到重要實驗數據。

最後謝謝我的家人的金援及時時的關心，有你們的支持才是我安穩度過碩士生涯與完成學業的動力，太多的話我不懂說，太多的事我不懂做，但我一直知道你們才是我最珍貴的寶藏，Everglow。

2017 季夏陳威廷於臺東大學應用科學系筆

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中文摘要

結合過去的文獻，水熱合成法由於其簡單，且成本低廉，溫度低和省時的過

程而具有明顯的優勢。而聚合物碳點對於pH 響應更單純且現性範圍寬廣，不需

額外修飾官能基等優點。本研究利用Polyethylenimine, branched (支鏈化聚乙烯亞胺)(MW1,800)與 Ethylenediaminetetraacetic acid (乙二胺四乙酸)(重量比 1:1)經由簡單方便的水熱法合成螢光碳奈米點(carbon dots ,CDs)。所得之碳奈米點平均粒徑大小為4 奈米，並在 350 奈米的激發光下於 450 奈米處放射出藍色螢光。我們藉由紫外光-可見光光譜儀、螢光光譜儀、穿透式電子顯微鏡、傅立葉轉換紅外線

光譜儀與X 射線電子能譜儀等儀器鑑定碳奈米點響應於環境 pH 值的性質變化。

所合成之碳奈米點在環境pH3 與 pH10 來回變化 7 個循環後，碳奈米點的螢光在

相同pH 下無明顯改變，證實我們材料具有良好的 pH 值循環變化穩定性，而這

項能力展示碳奈米點有潛力作為環境pH 感測器。有鑑於本碳奈米點對於金屬離

子以及農藥的穩定性與pH 寬廣的偵測範圍，我們更實質應用於真實環境檢測與

生物成像。

使用此方法檢測得pH 的線性範圍從 pH 3.0 至 pH 10.0，且 R²為0.995。此方法後續也成功應用在檢測湖水與自來水等樣品。更重要的是，我們已經開發了一個使用螢光碳奈米點檢測環境與生物成像的新方法。

關鍵字：螢光碳奈米點；支鏈化聚乙烯亞胺；乙二胺四乙酸；pH 感測器；生物顯影。

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ABSTRACT

In the previous literature, Hydrothermal synthesis has obvious advantages due to its simplicity, low cost, low temperature and time-saving process. The polymer carbon dots have the simpler mechanism with a wider range for pH sensing, does not require additional functional groups. A facile and simple hydrothermal treatment was exploited to fabricate fluorescent Ethylenediaminetetraacetic acid -Polyethylenimine, branched carbon dots (EPCDs) by utilizing Polyethylenimine, branched (MW 1,800) and Ethylenediaminetetraacetic acid. The obtained EPCDs had an average size of 4 nm and emitted blue fluorescence centered at 450nm while excited at 350 nm. The optical properties of EPCD in different pH environments were characterized by UV-visible spectroscopy, fluorescence spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), FT- IR spectroscopy, fluorescence lifetime spectrometer and X-ray electron spectroscopy (XPS). Meanwhile, the synthesized EPCDs displayed favorable pH cycling stability after adjusting pH values between 3 and 10 for 7 cycles. This capability shows that carbon dots have potential as environmental pH sensors. In view of EPCD has a wide pH sensing range and stability of metal ions and pesticides, we have actually applied it to real sample detection and Bioimaging.

The result of the proposed method linear range of pH measured were from pH 3.0 to pH 10.0 and R² bellowed 0.995, also successfully used in the subsequent detection of lake water and tap water. More importantly, we had opened up a new direction for fluorescent carbon dots to detect environmental pH and biological imaging without complex procedures.

Key words: fluorescent carbon dots; bPEI; ethylenediaminetetraacetic acid; pH sensor;

bioimaging.

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圖目錄

Figure 3- 1.Fluorescence spectra of CDs synthesized via different methods at different pH . ... 16 Figure 3- 2.FTIR spectra of the different CDs (from (a) to (e) : EPCD240, EPCD150,

EPCD120, PCD, 5EPCD) ... 17 Figure 3- 3.TEM images of the as prepared EPCDs (A), the corresponding size

distributions of the EPCDs (B) . ... 18 Figure 3- 4.FTIR spectra of bPEI (curve a),EDTA (curve b) and the EPCDs (curve c).

... 19 Figure 3- 5.XPS full scan spectrum (A) and high-resolution XPS spectra of O1s (B),

N1s (C), C1s (D) of the EPCDs. ... 20 Figure 3- 6.UV-vis spectrum (black), fluorescence excitation (blue) and emission (red)

spectra of EPCDs (A). Excitation dependent fluorescence spectra of EPCDs.

(B). ... 21 Figure 3- 7.The fluorescent intensity of EPCDs under the irradiation of 365 nm UV

light for 60 min (A), ionic strength stability of EPCDs (B). ... 25 Figure 3- 8.Fluorescent intensity response of EPCDs to various metal ions. ... 26 Figure 3- 9.Fluorescent intensity response of EPCDs to various pesticide (1ppm, from

left to right: Carbendazim, Dimethoate, Trichlorfon, Dichlorvos,

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Chlorothalonil, Prothiofos, Chlorpyrifos, Clothianidin, Glufosinate- ammonium, Methomyl, 2,4-D, Propanil, Glyphosate, Dicofol, Carbaryl, Fenvalerate, Thiodicarb, Acetamiprid, Kresoxim-methyl, Phosphamidon).

... 27 Figure 3- 10.(A) Fluorescence spectra (B) UV–vis absorption of the EPCDs at different

pH . ... 28 Figure 3- 11Dynamic light scattering (DLS) pectra of the EPCDs under pH=3 and

pH=10 . ... 29 Figure 3- 12Fluorescence spectra of the EPCDs and PCDs under pH3 and pH10.

... 30 Figure 3- 13.Intensity decay traces of EPCDs aqueous dispersion (pH 3.0 and 10.0)

monitored at 450 nm, excitation 390 nm. ... 31 Figure 3- 14.A linear relationship between the fluorescent intensity and pH

(3.0~10.0). ... 35 Figure 3- 15.The reversible pH-response of the fluorescence behavior of EPCDs

between pH 3.0 and 10.0 (Inset: the photographs taken under 365 UV light)

... 36 Figure 3- 16.Cellular imaging of EPCDs at bright field (A), and fluorescence image

(B). ... 37

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表目錄

Table 3- 1. PL decay parameters for EPCDs at different pH. ... 32 Table 3- 2 . Comparison of the performance of the presented method with different

sensors for pH detection. ... 38 Table 3- 3. Measurement of pH in environmental water samples. ... 39

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Chapter 1 螢光碳奈米點的特性

螢光碳奈米點或簡稱碳點(Carbon dots,CDs)通常是經由分子化合物的碳化與聚合

反應所形成之碳奈米材料。根據早期的文獻，經由不同方法所製備的螢光碳奈米

點粒徑通常小於100 奈米尺寸，其螢光特性與半導體量子點相似，因此目前多以

光致發光的機制做解釋。而本篇碳點主要歸納在非共軛聚合物碳點。其為聚合物點（polymer dots, PD）下的兩個子類：共軛聚合物點（conjugated polymer dots , CPD）和非共軛聚合物點（Non-conjugated polymer dots, N-CPDs）。CDs 為常通過產生共軛聚合物以及碳基材料來生產。在這些螢光材料中，碳-碳雙/三鍵或碳

基 π 電子被認為是 PL 中心的主要組成。而 N-CPD 通常由非共軛聚合物或小分子製備。

非共軛聚合物碳點通常通過聚合和交聯，水熱處理，自組裝和物理方法由非共軛聚合物或小分子製備，通常僅擁有亞螢光團(sub-fluorophores)（例如:含雜原子的雙鍵（C = N， C = O，N = O）或單鍵（基於氨基的組鏈 ( R-N-R )，C-O），

而不是典型的共軛螢光團基團，並且通常這些基團存在於線性的主鏈或側鏈中，

因此這些材料應不具有傳統意義上的光致發光（PL）。雖然如此，所有的合成PD

的方法都有一個共同的特點，就是通過它們，固定了具有亞螢光團的自由和鬆散

的聚合物鏈。這些亞螢光團顯示可適當的固定內部結構增加PL 使得非共軛聚合

物碳點可以通過交聯增強發射(crosslink enhanced emission，CEE)效應而產生光致發光性能。

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根據相互作用類型，非共軛聚合物點可以分為三大類。一個是共價交聯的 NCPD 它們在分子結構單元之間具有強的和定向的共價相互作用。另外兩種類型

是非共價NCPD，它們通過非共價相互作用和物理聚集形成。

1.1 不同前驅物合成碳奈米點性質與檢測分析 pH 與其應用

至今，許多合成碳奈米點的方法已被開發出來，包含：自組裝[1, 2]、微波[3]、

水熱[4]、熱分解(鍛燒)[5, 6]、熱溶劑[7, 8]、電化學[9]、和超聲波振盪法[10]等。

其中，水熱合成碳奈米點是簡便、快速又有效率的方法[11]。此方法能簡易合出含氧(如烴基、羧基)或胺基官能化碳點，通常具有良好的生物相容性和穩定性，

而且容易摻雜其他分子來對碳奈米點表面進行修飾，使碳奈米點能夠擁有不同大小、物理和光學性質外，進而能夠利用這些官能基團去感測環境變化(pH、金屬離子、蛋白質等)，並且利用其微小顆粒與獨特特性發展出不同功用。而檢測 pH

非常重要，在廣闊的科學研究中pH 的變化與各種因素有關，使其成為一種因或

果的重要指標，例如:環境 pH 值的變化往往影響植物吸收礦物質的能力[12]，其

也影響根部菌種的比例進而導致植物的健康程度不同，或在生物科學上大多癌細胞pH 表現將異於正常健康細胞[13]，因此追蹤各種環境 pH 是非常重要的。此外

細胞內pH 在調節細胞代謝和許多生物機制中起著重要作用，攸關蛋白質的折疊

[14, 15]，胞內糖酵解和水解速率[16]與酶活性[17, 18]等等影響，因此，pH 感測器是環境科學、生物學和醫學科學中的關鍵工具。

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設計一項兼具微小尺寸，高靈敏性，高量子產率，生物相容且簡單製造的奈

米感pH 測器是我們努力追求的，因此挑選碳奈米點作為主體來發展。一般碳奈

米點可以由結構特徵大略分為碳基奈米點(石墨烯量子點，碳奈米點)與聚合物碳點(共軛，非共軛)兩種種類，後者與一般聚合物點的差異為擁有大量碳原子存在

於其結構中。

1.1.1 碳基奈米點(石墨烯量子點，碳奈米點)

此類奈米點通常分為有結晶性的石墨烯量子點與碳奈米點，前者擁有石墨烯的特徵例如:在於拉曼特徵 1350cm^-1的sp³邊緣Defect band (D band)與 1590 cm^-1

的sp²邊緣Graphite band (G band)。製作方法較多樣，常搭配其他螢光 pH 敏感染劑達到感測效果，但也可藉由本身表面官能基特性而有不同策略。

2017 年 Yun Lu 團隊利用檸檬酸，L-絲胺酸和單乙醇胺為前體與有機溶

劑N，N-二甲基甲醯胺以熱溶劑法製備出 pH 敏感感測器，同時替換有機溶劑為

離子水所製備的碳點與DMF-CDs 特性的比較，發現不同的反應體系使得製備的

N-CD 具有的不同表面狀態，因此表現出各異的光致發光特徵，其原因為在溶劑

熱過程中，部分DMF 可能分解成二甲胺，可通過與反應中芳香結構表面產生的

環氧基發生親核開環反應，將其摻入 sp²碳域，從而導致sp²-碳結構從碳核剝離

並用氮原子取代碳原子。而且這種特殊的摻雜使得DMF-CDS 中的共軛核心結構

膨脹，從而引起螢光發射峰值紅移。所製備的DMF-CDS 在 pH 1.4 到 pH 7.5 環境下R = 0.996，在高 pH 下螢光發射峰的紅移表明，DMF-CDS 上羧基的去質子

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4 化可能形成帶隙較低的新表面態[19]

2018 年 Xuwei Chen 與 Jianhua Wang 團隊以以氧化石墨烯（GO）和葉酸(FA)

為原料，一鍋微波鹼切割法製備了葉酸（FA）包裹的石墨烯量子點（FA-GQD）。

形成尺寸為33.6 nm 的穩定均勻的碳點。所製備的 FA-GQDs 具有多激發和發射位點的熒光行為，在激發光280 nm 時同時有 360 nm，450 nm 雙放射波長，並且利用放射 450 nm 於低 pH 環境下引起氨基的質子化使得它們提供給 GQD 電子的能力提高，從而導致在450 nm 處藍色發射增加。而 360 nm 處螢光較穩定的特性，以比較螢光強度360 nm/450 nm 以偵測在 pH 3~9 的範圍內的 pH 變化，使其成為細胞中和環境水樣本pH 敏感的螢光探針[20]。

2017 年 Sharmistha Dutta Choudhury 團隊使用水熱檸檬汁後的碳點研究

對pH 的影響，利用吸收光譜與螢光光譜的紅位移與 FTIR 分辨影響碳點螢光基

團為表面苯酚的去質子化為主要因子而非羧酸基團。再利用碳點在pH 2.7 與 pH 8.9 下對於 Hg²⁺擁有不同的反應，解讀表面官能基團的影響，也加入GSH 抓取 Hg²⁺使螢光回升，而作者也在最後提供了邏輯閘的應用[21]。

2017 年 Shulin Zhao 與 Liangliang Zhang 團隊用檸檬酸(CA)和多巴胺(DA)作

為起始勿製造出 pH 敏感碳點 PCDs，嘗試比較以不同比例 CA 與 DA 所製作的碳點，發現DA 主導 525 nm 處放光。同時也利用 DMPA 替換 DA 為原料，證明 DA 也決定碳點的 pH 偵測能力，因為 DA 在鹼性下將被氧化為奎寧。也使用 PCDs 在 pH 不同螢光的變化製造出邏輯門，成功應用在細胞內成像[22]。

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5

2017 年 Hao Li, Hui Huang, Yang Liu 和 Zhenhui Kang 團隊以 C3N3S3與

乙二胺合成具有量子產率30.4%的 N，S 摻雜碳點，並利用其溫度升高，非輻射

通道將被激活，更多的激發電子通過非輻射過程返回到基態而導致螢光強度降低，

偵測範圍在 20^oC 到 80^oC 區間。另藉由四環素上的-OH 會與此碳點表面基團形成氫鍵，因此藉此偵測四環素，其偵測極限 3×10^-10M 線性範圍 1.39×10^-5M 到 1.39×10^-9M，R²=0.998[23]。

2014 年 Minjie Li 團隊以 CHCl3與DEA 一步回流法製造出不同螢光性

質的碳點，利用管柱成功分離出F-C(全色域碳點)與 B-C(藍色域碳點)兩種碳點，

發現F-C 含有更多的 C=N 與 C=O 表面官能基將造成新的能階，使的碳點能展現範圍於全可見光的螢光性質。利用 NaBH4還原 F-C 表面基團，證明此一現象。

而後用此種碳點於pH 3.0~10.0 穩定作為範圍，將碳點與 Fluorescein isothiocyanate (FITC)合成 FITC-C，利用比例螢光 524 nm 與 470/565 nm 得以判斷環境 pH 範

圍。使用LysoTracker@Red DND-99 溶酶體紅色螢光染料，證明本篇 F-C 碳點染色對象為細胞中的溶酶體[24]。

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1.1.2 聚合物碳點

pH 值不僅使表面官能基變化也會影響聚合物碳點的剛性程度，進一步影響 PL 強度，故通常此類碳奈米點 PL 強度隨環境 pH 越低而螢光上升。

2018 年 Guojie Wang 團隊利用 PEI 與 FYD 合成 DASA-PEI 聚合物點，具有 2.1%量子產率。本篇由可見光照射後，聚和物點吸收 522 nm 處的吸收帶減小，

表明表面的三烯基團異構化為環戊烯酮，同樣的將環境調至pH 8 時吸收 522 nm

處吸收帶也減小，證實 pH 也使表面三烯基團異構化為環戊烯酮。藉由 TEM 輔

助，此異構化將誘導奈米顆粒解離並減小顆粒尺寸。利用此奈米點可同時與Cu²⁺， Fe³⁺產生聚合，用以偵測Cu²⁺與Fe³⁺濃度最低偵測極限為10.1 nM 與 1.3 nM，R²

分別為0.99503 與 0.99634[25]。

2018 年 Nian Bing Li 與 Hong Qun Luo 將聚乙烯亞胺和水楊醛和在 25^oC 水

相中自組裝，通過超支化聚乙烯亞胺和水楊醛合成了一類具有自發螢光的非共軛聚合物碳點。粒徑6 nm 最佳激發於 290 nm 與 370 nm 分別擁有 415 nm 與 495 nm 最佳放射，聚合物碳點的螢光和吸收顯示出對 pH 的敏感且可逆的響應。說

明聚合物點表面上存在兩個質子響應性官能團（酚羥基和胺基）是至關重要。pH

依賴性螢光歸因於電子轉移，其受胺基質子化程度的控制，而pH 依賴性吸收則

由酚羥基的離子化所引起。基於pH 的光學性質，開發了比色螢光雙信號 pH 傳

感器和邏輯門[26]。

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2017 年 Ya-Qin Wang 團隊成功藉由鋅離子增強聚乙烯亞胺/檸檬酸雙碳化點

之螢光並用於在生理pH 值環境快速及選擇性檢測鈷與其在細胞內成像。碳點本

身激發為362 nm；放射位在 448 nm，量子產率為 45%，粒徑範圍落在 2~6 nm。

碳點的表面電位為+6.5mV，pH 值在 4.2 時螢光達到最強，原因可能為碳點表面上含有大量的胺基團及少量的羧酸基團所導致。其中碳點再與鋅離子(10 μM)或鎘離子(10 μM)反應後螢光增強近 80%，機制可能為碳點表面的胺基團在接收到激發光時會產生光誘導電子轉移效應(Photoinduced electron transfer，PET)，使得能量的釋放途徑為不放光或放出較弱的螢光。當金屬離子與胺基團錯和時，PET

效應將會消失而使碳點的螢光強度大幅提升；再加入鈷離子進入系統時，會再與胺基團錯和形成鈷胺錯合物(cobaltous amine)，從吸收光譜也可以發現 2 根新的

吸收峰位在285 nm 及 450~600 nm (鈷胺的吸收峰)，與碳點的激發與放射峰有部分重疊，說明鈷離子造成的螢光淬滅為內濾鏡效應 (inner filter effect，IFT)。偵

測鈷離子線性範圍落在0.012~12 μM，R 值大於 0.99，LOD 為 8 nM。材料在最後也成功應用於真實水樣品及細胞成像，真實水樣品中定量回收率介在 95.8~107.4%，偵測鈷離子(5 μM，n = 5)的相對標準偏差 (RSD) 為 5.7%[27]。

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1.1.3 現有方法之比較

在文獻回顧中，我們得知可將碳點表面修飾對於 pH 敏感基團或是染料例

如:Fluorescein isothiocyanate (FITC)、5-(furan-2-ylmethylene)-2, 2-dimethyl-1, 3- dioxane-4, 6-dione (FYD) 將有機染料共價連接到構成基於螢光共振能量轉移

（FRET）的比率測量 pH 傳感器的 CD 表面上，CD 充當供體，有機染料充當受

體來達pH 感測之目的，但表面修飾容易影響碳點基本性質，且牽涉多步驟合成。

然而雖然也有單獨利用碳點本身對於pH 的響應作為的感測器，不過尚由於有效

感測範圍不夠寬廣，或是容易受到環境因子影響等原因，所以開發一項簡單、穩

定且準確的pH 感測器是非常重要的。由單一方法合成聚合物之碳點較為優勢的

方法。

1.2 研究動機

1.2.1 螢光碳奈米點之合成前驅物選擇

在先前的文獻回顧中水熱碳化方法由於其簡單，成本低，溫度低和省時的過程而具有明顯的優勢，並且已被廣泛開發作為用於簡便的合成碳奈米點。而碳奈米點會依據所選擇前驅物不同而有不一樣的光學性質，修飾的螢光染料可能經歷

光漂白而失去其螢光性質，故本篇採取一步合成pH 奈米點感測器。；聚合物碳

點對於pH 響應更單純且現性範圍寬廣，不需而外修飾官能基等優點，本研究選

擇將 Polyethylenimine, branched (MW 1,800) (bPEI) 作為碳與氮的主要來源與 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 作為與 bPEI 形成共價鍵與擔任部分表面

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修飾作用，據我們所知，如果單獨使用水熱法水熱EDTA 無法形成碳點，且 EDTA

中心鏈具有兩個三級胺，預期其羧酸基與 bPEI 上的一級胺形成醯胺化產物後將

與bPEI 主鏈相似，所以將 EDTA 當作交聯以及表面修飾劑，是一個有趣的方法，

以研究羧酸及氧化基團對碳點影響的材料。利用這兩項前驅物，以水熱法合成出的乙二胺四乙酸- 支鏈化聚乙烯亞胺碳點 (Ethylenediaminetetraacetic acid–

Polyethylenimine, branched carbon dots, EPCDs) 作後續研究。

1.2.2 環境 pH 值的測定

對環境因素（pH 值，溫度，重金屬等）敏感的功能材料引起了人們的極大興趣。在這些因素中，pH 值是食品，化學工業，污水處理和生物系統中擔任重

要角色，更影響植物和動物的生長和繁殖。因此，準確測量pH 值在理論和實踐

中都是非常重要的。

除此之外由於環境中充斥著各類容易影響碳奈米點準確偵測的因素例如:大

多數表面含有胺或羧酸基團的奈米點容易與金屬離子產生聚集而導致淬滅，又或者對於環境農藥有著不一的反應性，尚有種種因素使得碳奈米點使用上的限制需

要被突破，使得研究碳點的pH 敏感性質及其刺激物影響 pH 值是非常重要的。

因此我們開發一種簡單、快速製造且對環境穩定的碳奈米點，並加以剖析其機理。

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Chapter 2 實驗方法

2.1 化學試劑

Branched Polyethylenimine (Mw ~1,800, bPEI) 購自台灣 Polysciences Inc.公

司 ; 乙二胺四乙酸 (Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) ，亞甲藍

（methylthioninium chloride）皆購自比利時 Acros Organics 公司，金屬鹽類、其他農藥標準品皆購自美國 Sigma-Aldrich 公司，磷酸（H3PO4）、磷酸二氫鈉

（NaH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）與磷酸三鈉（Na3PO4）購自美國 JT Baker，實驗所用超純水皆由 Millipore 系統製作，其電阻值 ≧ 18.25 MΩ/cm。

實驗所使用的藥品皆為分析級，且使用前無再經過任何處理。

2.2 EPCDs 之合成

首先將 1g polyethylenimine, branched (MW 1,800) 與 Ethylenediaminetetraacetic acid 與 50 mL dd. H2O 混合，取 15 mL 分置於兩個鐵氟

龍杯，接著將蓋子蓋上後放入不銹鋼高壓釜，鎖緊螺絲後轉送至高溫爐，溫度設定在180^oC；加熱時間設定為 12 小時。反應完成後待其溫度冷卻至室溫，接著取出懸浮液並以離心 12000 rpm 持續 2 分鐘分離較大顆粒，接著使用透析膜 (3500 DA) 透析 6 小時並每 3 小時更換超純水，將所得 EPCDs 放入 4^oC 冰箱保存。

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2.3 儀器分析與鑑定

紫外光-可見光吸收光譜儀 (日本 Hitachi 公司，型號為 U-2900)。CDs 之影像是利用穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscopy，TEM；日本 Hitachi 公司，型號為 H-7100) 所得。CDs 的鍵結能是由 X 射線光電子能譜 (X- ray photoelectron spectroscopy，XPS；美國 Thermo 公司，型號為 K-Alpha) 所測

得，而製備樣品皆是將材料直接真空乾燥成粉末後偵測。傅利葉轉換紅外線光譜儀 (Fourier transform infrared spectrometer, FTIR；美國 Perkin Elmer 公司)。表面水合半徑檢測是利用動態光散色儀 (dynamic light-scattering, DLS；英國 Malvern

公司，型號為 Zetasizer Nano-ZS90) 。螢光生命週期儀 (Fluorescent lifetime spectroscopy;德國 AST Instrument 公司，型號為 TimeHarp 200 )

2.4 pH 響應鑑定方法

首先將17 mL 的超純水、1 mL 的 EPCDs 溶液混合，各取 900 μL 分裝於 1 mL 離心管中，隨後依序加入 100 μL 1M 各樣 pH 的磷酸鹽緩衝溶液，接著搖晃 5 分鐘進行均勻混合。原始螢光 F0則是透過將步驟中的100 μL 磷酸鹽緩衝溶液

以100 μL 的超純水取代，所測得之螢光。

2.5 pH3-10 酸鹼循環穩定性

將首先將19 mL 的超純水、1 mL 的 EPCDs 溶液混合使用 HCl (2 M) 或 NaOH (2 M)將 pH 調整至 3.0 與 10.0 為一循環，每完成一次便從中取出 1 mL 放入離心管中依序標示為1 到 7 循環。

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2.6 碳點的金屬離子穩定性

調查一些常見17 種陽離子的影響，包括 K⁺, Na⁺, Ba²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Al³⁺, ZnCl²⁺, Co²⁺, Li⁺, Mn²⁺, Cu²⁺, Pb²⁺, Ni^{2 +}, Hg²⁺, Ag⁺, Fe³⁺, Fe²⁺ ,對螢光的影響，

加入l00μL 10^-3M 金屬溶液，隨後加入 900μL 稀釋 20 倍的 EPCDs，然後研究混合物的螢光光譜。

2.7 湖水中檢測 pH

湖水樣品取樣自國立台東大學校園中的鏡心湖，在實驗前皆通過12000 rpm

離心10 分鐘，並以 0.22 μm 的過濾膜過濾。將 100 mL 處理後真實水樣與 900 mL EPCDs 混和 3 min 測量其螢光強度 ( FR ) 並與在磷酸鹽緩衝溶液 pH 10.0 下的螢光( F10 ) 作對比取得比值 ( FR/ F10 )，比較對應數值獲得真環境實 pH 值，並與 pH meter 比較準確性。

2.8 細胞成像

取樣前先以自來水漱口一次簡易清潔口腔，之後使用軟性塑膠滴管於口腔內

以順時針方向旋轉一圈以刮取口腔上皮組織，後浸入事先準備好的 EPCDs 溶液

(0.5 ml，0.5%) 且保存於 1.5 ml 小形離心管中分散成混合液，以上步驟重複 2 次。

經過1 h 取 10 ml 混合液滴於載玻片上，後以蓋玻片蓋上，以顯微鏡觀測之。

(24)

13

Chapter 3 結果與討論

3.1 EPCDs 的合成與鑑定

合成 EPCDs 主要是通過在高溫高壓下 bPEI 的胺基與 EDTA 上的羧酸基反應，接著再通過分解、碳化、聚合反應成EPCDs。過去在使用檸檬酸與 PEI 合成

的碳奈米文獻中報導擁有pH 響應性。是由於低 pH 值下碳點通過非共價分子相

互作用下聚集，減少了通過非輻射弛豫的能量損失，使得螢光上升[28]。但卻也

有報導指出以PEI 修飾的奈米粒子在酸性條件下反而使得粒徑較小，借著 HCl 的

加入，PEI 的質子化程度增加，也提高了親水性，進一步破壞了奈米囊泡的結構。

[29]。雖 PEI 的於 pH 中的角色眾說紛紜，然而都將顯示了有趣的 pH 響應性。

本篇透過改變主要成分，分別為支鏈化 PEI 與相較於檸檬酸更大的分子

EDTA，將使碳點結構剛性強化，且於表面修飾羧酸基團，改良 pH 響應性能，並

加以分析其性質。

在Figure 3- 1 中可以觀察到當 bPEI 與鄰 EDTA 重量百分比為 1:1 時有最佳

的 pH 響應線性，明顯對於 pH 變化螢光變化最大，且現性良好；此外當改變

EPCDs 的合成溫度 120~240℃ (EPCD120、EPCD150、EPCD180、EPCD240)時，

處理溫度較高下 EPCDs 螢光雖然會有所提升，但其對於 pH 的響應能力卻不如

180℃所製的 EPCDs。此現象可能是因為可進行反應的前驅物在 180℃下 EDTA

與 bPEI 產生恰好的表面狀態，而隨著反應溫度的提升至 240℃時，碳點碳化程

度更高導致表面官能基的損失 [30, 31]，使得對於酸鹼環境靈敏性降低，而低溫

(25)

14

影響碳點成核反應，使其對於偵測pH 變化之螢光強度表現較不明顯。因此我們

選擇180℃作為合成碳奈米點 EPCDs 的反應溫度，值得注意的是，在未加入 EDTA 反應溫度180℃的碳點(PCD)也出現了 pH 響應性，但相較所制備 EPCD180 線性

差，且偵測範圍較窄，歸因於缺乏EDTA 交聯結所致。而相似的現象與響應狀態

也出現在其他以 PEI 作為原料的奈米點之文獻上[32, 33]。另外加入 5 倍 EDTA 的碳點 (5EPCD) 由圖中可以發現與 EDTA240 同在 pH 3.0 時螢光下降，其可能

由於較高比例的 EDTA 使得在碳點於水熱過程中產生不同的碳化程度，而使其

螢光對 pH 響應性較弱。綜合上敘結果，我們使用 EPCD180 (文內稱為 EPCDs) 作為後續研究。而以上FTIR 光譜於 Figure 3- 2，另外本文特別將 EPCDs 之 FTIT 光譜放在Figure 3- 4 加以詳細分析。

如圖 Figure 3- 3 在 TEM 分析結果中，EPCDs 的 TEM 影像由圖 Figure 3- 3(A)顯示 EPCDs 為一種球形且分散性良好的碳點。圖 Figure 3- 3 (B)，粒徑分布

在3.5~4.5 nm 之間，平均粒徑大小約為 4 nm；為了確認所合成 EPCDs 表面狀態，

我們分別利用FTIR 及 XPS 進行分析。在 Figure 3- 4 的 FTIR 譜中發現 EPCDs 表面在1680 cm^-1有-C=O 官能基存在相較於大多文獻較低波數(~1700 cm^-1)這是由於PEI 的其餘胺基團的存在，因而峰值轉移到較低的波數[34]。而 1212 cm^-1對應於C-O，1456 cm^-1與1587 cm^-1屬於一級胺，二級胺[35, 36]，重要的是 EPCDs 分別在1625 cm^-1，1570 cm^-1也顯示出酰胺鍵的證據，證實EDTA 確實與 bPEI 結合[36]。

(26)

15

XPS 中全譜圖顯示於 Figure 3- 5(A)明顯兩 Au3/2與Au5/2來自於金標定的訊

號。而O1s 譜於 532.5 eV、531.3 eV、530.2 eV 分別屬於 C=O、C-OH/C-O-C、

COOH 在 Figure 3- 5(B)。而在 N1s 譜中可以看到 400.9ev、399.5ev 與 398.3ev 分

別對應於O=N-C、N-C、C=N-C 結果於 Figure 3- 5(C)最後 C1s 譜中有 4 支訊號 288.2 eV、286.5 eV、286.0 eV、284.5 eV 依序為 C=O/C=N、C-O、C-N、C-C/C=C

而在292eV 處缺少 π-π*震動峰，顯示缺乏共軛 π 電子系統[37]結果呈現在 Figure 3- 5(D) 。.由 XPS 與 FTIR 可映證 EDTA 確實與 bPEI 結合。

Figure 3- 6(A)為 EPCDs 的吸收光譜、螢光激發與放射光譜，從吸收光譜(黑

色線)可以發現 EPCDs 在 350 奈米處 n-π*的電子躍遷[38]。與吸收 200~250 奈米

歸因於 EPCDs 表面官能基 C=O 之 n-π*或其他亞螢光基團的 n-π*躍遷的電子躍遷[39]。再來由 EPCDs 激發光譜與放射光譜得知其最佳激發波長為 350 nm，放

射波長為450 nm。EPCDs 的激發依賴螢光光譜於 Figure 3- 6(B)，隨激發變化顯 示螢光波長位移，顯示碳點與碳點表面富含的氧化基團受激發波長變化而有不同強度的放射。

(27)

16

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0.4 0.6 0.8 1.0

Relative intensity

pH EPCD240

EPCD150 EPCD120 EPCD180 PCD 5EPCD

Figure 3- 1. Fluorescence spectra of CDs synthesized via different methods at different pH.

(28)

17

Figure 3- 2. FTIR spectra of the different CDs (from (a) to (e) : EPCD240, EPCD150, EPCD120, PCD, 5EPCD).

4000 3000 2000 1000

d c b

e a

% T ransmittance

Wavenumber (cm

^-1

)

(29)

18

Figure 3- 3. TEM images of the as prepared EPCDs (A), the corresponding size distributions of the EPCDs (B).

(30)

19

Figure 3- 4. FTIR spectra of bPEI (curve a),EDTA (curve b) and the EPCDs (curve c).

(31)

20

Figure 3- 5. XPS full scan spectrum (A) and high-resolution XPS spectra of O1s (B), N1s (C), C1s (D) of the EPCDs.

(32)

21

Figure 3- 6. UV-vis spectrum (black), fluorescence excitation (blue) and emission (red) spectra of EPCDs (A). Excitation dependent fluorescence spectra of EPCDs. (B).

(33)

22

3.2 EPCDs 螢光穩定性

對於奈米感測器而言，螢光的穩定性是相當重要的。為確認所合成的EPCDs

在受到激發時所釋放的螢光是否穩定，我們分別利用接受不同照光時間與配製在

不同濃度的氯化鈉溶液中來測試 EPCDs 的耐光性及耐鹽性。其分析結果展示於

Figure 3- 7。由數據結果我們可以肯定，不論在照光一小時或者溶於 1 M 氯化鈉

溶液中都不會對 EPCDs 的螢光有太大的干擾。除此之外，我們同樣也探討了金

屬離子對EPCDs 螢光的影響，如 Figure 3- 8 所示。幾乎所有金屬離子對 EPCDs 螢光都無明顯干擾，而Figure 3- 9 在 30 種常見有機農藥之中，不會受到顯著影 響，眾所周知的，EDTA 是一種常見的金屬離子螯合劑，它有2 個胺和的 4 個羧

酸可作為配體的齒，與金屬陽離子結合組成螯合物，但由於其羧酸基團被用來與 bPEI 形成醯胺鍵，失去其螯合金屬能力，固EPCDs 得以保持其穩定性。綜合以

上特性證實有利於其應用於真實環境之中。

3.3 EPCDs 對 pH 的螢光響應機制

在本研究中，我們螢光強度隨著溶液pH 值的增加而降低。因此仔細的研究

了EPCDs 對 pH 的響應。為了更深一步研究 EPCDs 螢光特性，圖 Figure 3- 10 (A) EPCDs 的螢光強度隨著 pH 的增加而逐漸淬滅，並觀察到螢光強度與 pH 在

3.0〜10.0 之間的良好線性關係。可觀察到隨著環境 pH 的升高而波鋒有些紅位移

產生，許多以PEI 為原料的材料報導，在鹼性下可能導致奈米點的分裂或聚集，

我們以DLS 測量粒徑分布，結果顯示 EPCDs 在相比於 pH 3.0 下 pH 10.0 時只有

(34)

23

些微的聚集，結果於Figure 3- 11。因此我們推測此螢光位移現象是由於碳點表 面有酸性位點，於去質子化過程中導致碳點的表面電荷變化並進而改變費米能級 [40]。在鹼性下由於這些基團的螢光受到淬滅，在酸性條件中恢復螢光。Figure 3- 12 為了證實其表面酸性位點的影響，調整 pH 至 10.0 以去質子化。相比於合

成過程中未加入 EDTA 的 PCDs，在鹼性下 EPCDs 螢光放射波長位置與幾乎與其相同，這也解釋了Figure 3- 10(A)隨著 pH 值變化的螢光位移現象，如 Scheme 1 所示。而另一個導致螢光淬滅原因，可能源於以 PEI 所形成碳點在較低的 pH

值下，由氫鍵作用引起的強烈振動、偶合可以導致能級增寬並增加 EPCDs 的結

構剛性[21]，因此螢光強度增強。基於上述觀察，EPCDs 在不同 pH 下螢光強度

的變化應該是歸因於 EPCDs 在酸性和鹼性中可逆的質子/去質子化[41]，與整體結構一定程度的鬆散影響CEE 的現象而導致的 pH 敏感效應。

由Figure 3- 10(B)吸收光譜與能發現 EPCDs 隨著 pH 的增加，200~250 nm 處 C=O 之 n-π*[39]或其他亞螢光基團的 n-π*躍遷的電子躍遷對應於有著規律的紅位移的現象，應證了碳點表面基團的質子/去質子化的推測[42]。然而觀察到 350 nm 主吸收鋒並無明顯變化，顯示 pH 的變化鮮少影響碳點內部電子形態。由過

去文獻推測隨著pH 值的升高，由於 CDs 表面均勻的發生羧基的去質子化，表面

形成具有負電荷的“保護殼”[31, 43]固無明顯影響碳點內部狀態。

螢光壽命是研究 CD 固有特性一項利器，我們更進一步研究了 EPCDs 對於

pH 感應的機制，我們固定激發波長 390 nm 並於放射波長 450 nm 測量強度變化，

(35)

24

由 Figure 3- 13 可以見得在 pH 3.0 時有較長的螢光壽命，而 pH 10.0 的短螢光壽命可能是來自於鹼性環境下由於非共價分子間的相互作用，例如:N-H 或-OH 基團之間的氫鍵，導致碳點間的聚集，因而致使動態淬滅[44]。所有 FL 壽命結果

總結在表Table 3- 1 中，螢光衰減曲線可用多指數函數表示，表明鹼性環境導致 淬滅非單一因素。

(36)

25

Figure 3- 7. The fluorescent intensity of EPCDs under the irradiation of 365 nm UV light for 60 min (A), ionic strength stability of EPCDs (B).

(37)

26

Figure 3- 8. Fluorescent intensity response of EPCDs to various metal ions.

(38)

27

Figure 3- 9. Fluorescent intensity response of EPCDs to various pesticide (1 ppm, from left to right: Carbendazim, Dimethoate, Trichlorfon, Dichlorvos, Chlorothalonil, Prothiofos, Chlorpyrifos, Clothianidin, Glufosinate-ammonium, Methomyl, 2,4-D, Propanil, Glyphosate, Dicofol, Carbaryl, Fenvalerate, Thiodicarb, Acetamiprid, Kresoxim-methyl, Phosphamidon).

(39)

28

Figure 3- 10. (A) Fluorescence spectra (B) UV–vis absorption of the EPCDs at different pH.

(40)

29

Figure 3- 11 Dynamic light scattering (DLS) pectra of the EPCDs under pH=3.0 and pH=10.0.

(41)

30

Figure 3- 12 Fluorescence spectra of the EPCDs and PCDs under pH3.0 and pH10.0.

(42)

31

Figure 3- 13. Intensity decay traces of EPCDs aqueous dispersion (pH 3.0 and 10.0) monitored at 450 nm, excitation 390 nm.

(43)

32

Table 3- 1. PL decay parameters for EPCDs at different pH.

λex=390 nm λem=450 nm

pH A1(%) τ1 (ns) A2(%) τ2 (ns)

3 61.05% 7.268 38.95% 1.7055

7 60.41% 7.142 39.59% 1.6057

9 61.55% 6.818 38.45% 1.4050

10 62.32% 6.436 37.68% 1.3361

(44)

33

3.4 EPCDs 的應用

經過前面對於EPCDs 最佳化與的機制探討，EPCDs 可以有效作用於測量 pH 測量的螢光感測器，圖Figure 3- 14 說明合成的 EPCDs 是個優良的 pH 感應器，

其有著寬廣的感應範圍由pH 3.0~pH 10.0，R²為0.995，相較於過去文獻，我們的偵測範圍更加寬廣Table 3- 2。我們也以 2 M 的鹽酸與 2 M 的氫氧化鈉將環境 pH 值於 pH 3.0 與 pH 10.0 之間來回調整 7 個循環，觀察 EPCDs 對於檢測環境 pH 値變化的穩定性。實驗結果如 Figure 3- 15 所見，即使經過 7 個循環後 EPCDs

分別於酸性及鹼性環境的螢光彼此間差異微小，顯示出 EPCDs 具有良好的環境

pH 値循環變化穩定性。

此方法可以應用於真實樣品的檢測，如Table 3- 3 所示，對於不同的環境干

擾皆能準確的偵測其pH 值。由於 pH 現性範圍寬廣，橫跨範圍可應用於生物學

的潛在感測系統。此外PEI 是聚陽離子大分子，由其分子結構中由各式的胺基，

同時具有一級胺、二級胺和三級胺的基團（比例為1：2：1），而經常被作為遞送

藥物或 DNA 進入細胞的一種常見載體原料，因此利用 bPEI 做為原料將有助碳

點進入細胞內用於成像[45, 46]。儘管據報導游離 PEI 具有細胞毒性，但在結合狀態下效果將大大降低[47]。利用這些優點，實際用於口腔上皮細胞染色 Figure 3- 16 顯示 EPCDs 確實進入細胞膜內進行染色，雖然本實驗尚未確定其染色部位，

根據文獻其bPEI 可能對於染色溶酶體有相當的針對性，且溶酶體 pH 值 5.0 而其他胞器很少低於5.5，故可推測其螢光處為細胞內溶酶體[48]。。

(45)

34

本研究開發的方法具有優秀的線性範圍與可接受的偵測極限。值得一提的是，

此方法實驗手法簡單且無複雜的樣品前處理，在作為快篩檢測方面具有極大的潛力。突顯了此碳點作為獨特感測器的巨大潛力。最後已實際應用於檢測細胞內成像，並詳細的研究其機理。

(46)

35

Figure 3- 14. A linear relationship between the fluorescent intensity and pH (3.0~10.0).

(47)

36

Figure 3- 15. The reversible pH-response of the fluorescence behavior of EPCDs between pH 3.0 and 10.0 (Inset: the photographs taken under 365 UV light).

(48)

37

Figure 3- 16. Cellular imaging of EPCDs at bright field (A), and fluorescence image (B).

(49)

38

Table 3- 2 . Comparison of the performance of the presented method with different sensors for pH detection.

CDs: carbon dots ； N- CDs: Nitrogen-doped carbon dots ； FYD: 5-(furan-2-ylmethylene)-2, 2-dimethyl-1, 3-dioxane-4, 6-dione ； PEI:

Polyethylenimine；bPEI: Polyethylenimine, branched ；FITC: Fluorescein isothiocyanate；EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid Probe Method of synthesis Materials pH range Ref.

N- CDs Solvothermal Citric acid, L-serine monoethanolamine 1.48 ~7.56 [19]

CDs-FYD Self-assembly FYD, PEI 6~8 [25]

CDs Microwave 1, 2-ethanediamine, Acrylic acid,FITC 3.5 ~ 9.0 [49]

N- CDs Femtosecond laser ablation Graphite powder, Aminotoluene 3.5~7.5

7.5~10.5 [5]

CDs Refluxing Chloroform, Diethylamine 5~8 [24]

CDs Hydrothermal Glutathione, Glucose 3-9 [44]

CDs-FITC Hydrothermal Kelp, PEI, FITC 4.6~7.7 [50]

CDs Hydrothermal Citric acid, Basic fuchsin 5.2~8.8 [51]

EPCDs Hydrothermal bPEI, EDTA 3~10 This work

(50)

39

Table 3- 3. Measurement of pH in environmental water samples.

Samples pH1a pH2b Percentage Error^c

Tap water 7.4 7.2 1.7%

Lake water 7.4 7.2 1.7%

a measured by pH meter.

b measured by the fluorescent pH sensor based on EPCDs in this work.

c Percentage Error = ^|pH_pH²^−pH¹^|

1 × 100%

(51)

40

Scheme 1. Schematic illustration of the mechanism of EPCDs for pH sensing

(52)

41

Chapter 4 結論

本研究開發出以一步水熱法合成出的乙二胺四乙酸-支鏈化聚乙烯亞胺碳點 (EPCDs)具有最佳激發光波長在 350 nm 下於 450 nm 處放射出藍色螢光之光學性

質。藉由調控 pH 值 3.0~10.0 利用 UV-VIS、螢光光譜儀、螢光生命週期、等儀

器偵測並詳細研究其特性。證實表面基團的變化導致對於pH 性質的響應，並改

善傳統碳奈米點 pH 感測器的應用範圍其於 pH 3.0~10.0 有 R²=0.995 的良好現

性，不僅如此也加以應證 EPCDs 不易受金屬離子、鹽類、農藥等等環境因子的

干擾，等等性質對於環境感測碳奈米點實為重要。並已用於準確檢測細胞內 pH

值成像。最後成功應用於檢測真實環境狀態，證實擁有良好性能與潛力。

(53)

42

Chapter 5 參考文獻

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