科技部補助專題研究計畫成果報告
期末報告
環境真菌物種多樣性與赤箭屬植物物種多樣性
計 畫 類 別 ： 個別型計畫
計 畫 編 號 ： MOST 105-2621-B-006-003- 執 行 期 間 ： 105年08月01日至106年07月31日 執 行 單 位 ： 國立成功大學生命科學系
計 畫 主 持 人 ： 宋皇模
計畫參與人員： 碩士班研究生-兼任助理：黃棋桂 碩士班研究生-兼任助理：李宜蓉
中 華 民 國 106 年 10 月 31 日
中 文 摘 要 ： 赤箭屬(Gastrodia)植物是蘭科植物的一屬，而赤箭屬植物中最廣為 人知的物種是高赤箭(G. elata)又名天麻，是自古以來被用來治療 很多不同疾病的珍貴中藥材。赤箭屬植物中普遍都含有具有主要療 效作用的天麻素。因此，了解赤箭屬植物的生態多樣性亦可幫助我 們建構台灣的醫療生物資源。本計畫將透過研究台灣不同地理分布 類型的赤箭屬植物其塊莖及棲地土壤中真菌的物種組成，探討赤箭 屬植物中的共生真菌族群結構與環境真菌的物種組成之間的關聯性
。簡單的說，本計畫最主要的目標，即是了解環境真菌的物種組成 與赤箭屬植物生態多樣性的關聯性。不同地理分布類型的赤箭屬植 物對環境的適應情形可能和微棲地的菌相組成及和特殊真菌的專一 性程度有關，我們認為地區分布類型的赤箭屬植物其植物-真菌的專 一程度應較廣泛分布類型的赤箭屬植物高，因此本計畫將透過多源 基因體學的方法來探討：1) 不同地理分布類型之夏赤箭與爪哇赤箭 植物與共生真菌的專一性程度差異；2) 環境真菌的物種組成與赤 箭屬植物生態多樣性的相關性。這二個議題都是為了釐清微棲地環 境真菌的物種組成對赤箭屬植物與特殊真菌間的專一性程度及赤箭 屬植物生態多樣性的關聯性。
中 文 關 鍵 詞 ： 多源基因體學, 菌相族群結構, 環境微生物, 赤箭屬植物, 真菌異 營植物, 天麻
英 文 摘 要 ： The specific aim of this project is to characterize the fungal diversity in tubers of Gastrodia species and in the surrounding soil. Gastrodia is one of the Orchid genus and G. elata has been used as a prominent herbal medicine for centuries. The major effective ingredient of G. elata is gastrodin and almost every Gastrodia species contains gastrodin. Gastrodia species are achlorophyllous plants that obtain carbon and nutrients from their mycorrhizal fungi. It is now known that the G. elata obtain nutrients from symbiosis fungi such as Mycena and Armillaria species during germination process and normal growth phases,
respectively. However, not every Gastrodia species rely on Armillaria fungi for nutrients. Recent studies showed that G. confusa obtains carbon through Mycena fungi, G. similis was found to be associated largely with Resinicium fungi, and G. sesamoides relies on Campanella and Marasmius fungi for nutrients. Characterization of the fungal diversity in tubers of Gastrodia species could provide important
information on the biodiversity of these species in Taiwan.
There are 19 Gastrodia species in Taiwan, 7 of them are worldwide distributed and 12 of them are endemic species of Taiwan. It was suggested that the different distribution capabilities of these mycoheterotrophic orchids may
correlate to their specific symbiosis-fungi in their nature habitats, and we believe that worldwide distributed
Gastrodia species may have lower plant-fungus specificity than the endemic species. However, there is no information
regarding the correlation between the environmental fungal diversity and the biodiversity of Gastrodia species. In this study, we will use the metagenomics approach to characterize the fungal diversity in the tubers of
Gastrodia species and also in their natural habitats for the better understanding of the following issues: 1) the specificity of plant-fungus relationships of Gastrodia species and 2) the correlation between the environmental fungal diversity and the biodiversity of Gastrodia species.
英 文 關 鍵 詞 ： metagenomics, mycorrhizal community, Gastrodia, symbiosis, mycoheterotrophic plant, fungi
科技部補助專題研究計畫成果報告
（期末報告）
環境真菌物種多樣性與赤箭屬植物物種多樣性
計畫類別：個別型計畫
計畫編號：MOST 105－2621－B－006－003－
執行期間：105 年 08 月 01 日至 106 年 07 月 31 日
執行機構及系所： 國立成功大學生命科學系
計畫主持人： 宋皇模
研究背景及目的：
蘭科植物的種子非常細小，又缺乏可作為萌芽時營養來源的胚乳組織，因此蘭科植物種 子的萌芽及幼苗的生長與發育都得依靠特殊的真菌來供給生長時所需的營養(Smith and Read 2008)。多數的蘭科植物在種子萌芽後具葉綠體，因此可利用行光合作用來獲取植物體生長 所需的碳源，然而有超過 100 種以上的蘭科植物在成株後並不具葉綠體，而這類型不具葉綠 體的蘭科植物終其生命週期完全得依靠真菌來提供生長所需的碳源，因此這類型不具葉綠體 的蘭科植物也稱為真菌異營(myco-heterotrophic)蘭科植物(Bidartondo 2005; Leake 2005)，而 赤箭屬植物不僅是蘭科植物中真菌異營植物的代表，亦是真菌異營蘭科植物中最大的族群 (Hsu 2008)。真菌對於異營蘭科植物的生長發育扮演了非常重要的角色，因為當缺少了這些 可提供碳源的真菌，異營蘭科植物便無法在自然環境中存活，因此這些提供異營蘭科植物碳 源的真菌對於異營蘭科植物的生存、競爭及分布就有相當重要的影響(Rasmussen 1995;
Currah et al. 1997; Jacquemyn et al. 2010)。雖然這些真菌對不具葉綠體的異營蘭科植物的生 存、競爭及分布都有非常重要的影響，但是至目前為止在異營蘭科植物生長的微棲地環境中 這些真菌的物種多樣性及對異營蘭科植物物種多樣性的影響，則是鮮少被研究與了解(Batty et al. 2001)，因為傳統的菌種培養、檢定等研究方法並無法有效瞭解環境真菌的物種多樣性 及菌相的族群結構，而利用分子標誌以檢驗真菌物種多樣性的研究其所使用的引子又對不同 的真菌有不同的親和力，因此並無法有效瞭解環境真菌的菌相族群結構。本實驗室檢驗了 49 個目前常在文獻中被用來鑑定真菌物種多樣性的引子(primers) (Vilgalys and Hester, 1990;
White et al. 1990; Cubeta et al.1991; Anderson et al. 2003; Martin and Rygiewicz 2005; Taylor and McCormick 2008; Krüger et al. 2009; Prodorutti et al. 2009; Vancov and Keen 2009; Baumgartner et al. 2010)，結果發現這些引子的目標區段在不同真菌間都包含了一定程度的變異性，而這 樣的變異性會在 DNA 聚合酶擴增反應(PCR)時，對不同真菌物種的 DNA 會有選擇性的擴增 現象，因為在 PCR 的過程中引子會選擇性地增量與之黏合度高的真菌 DNA 序列，如此一來 便會影響後續真菌族群數量分析的準確性。為改善及避免所使用引子的選擇性擴增效應問 題，本實驗室設計了一組 28S rDNA 分子標誌的效果非常良好，能有效分析土壤中真菌菌相 組成，而使用此對引子的夏赤箭研究成果「Highly diversified fungi are associated with the
achlorophyllous orchid Gastrodia flavilabella」也已發表在 BMC Genomics (2015)期刊上。
赤箭屬(Gastrodia)植物是蘭科植物的一屬，而赤箭屬植物中最廣為人知的物種是高赤箭 (Gastrodia elata)又名天麻或定風草，是自古以來被用來治療很多不同疾病的珍貴中藥材。中 華藥典指出天麻可治療驚厥，並具有鎮痛和鎮靜的療效且可有效抗眩暈、全身癱瘓、癲癇和 破傷風(Xu and Guo 2000)。最近亦有研究指出天麻除了具有抗驚厥的功效外，亦有抗氧化清 除自由基、增近學習能力、加強記憶力、恢復記憶力及抑制真菌等功效(Wu et al. 1996; Hsieh et al. 1997; Hsieh et al. 2001; Wang et al. 2001)。研究指出天麻素正是高赤箭植物發揮醫療效果 的最主要成分而高赤箭植物塊莖中就含有大量的天麻素(Hsieh et al. 1997)，而赤箭屬植物中 普遍都含有天麻素，因此，了解赤箭屬植物的生態多樣性亦可幫助我們建構台灣的醫療生物 資源。本計畫最主要目標即是想透過檢定 28S rDNA 編碼區序列分析的方法，來探討環境真 菌的物種組成與爪哇赤箭(G. javanica)生態多樣性的關聯性。
一般而言，真菌異營植物與真菌之間的專一性非常高(Bidartondo et al. 2002; Roche et al.
2010)，然而近期亦有研究建議廣泛分布類型的真菌異營植物對特殊真菌的專一性程度並沒 有區域分布類型的真菌異營植物那麼高(Bonnardeaux et al. 2007; Roy et al. 2009; Jacquemyn et al. 2010)，因此不同真菌異營蘭科植物與共生真菌的專一性程度差異對不同真菌異營蘭科植 物的生存及分布的影響也逐漸被重視，因為對這些與蘭科植物共生的真菌的了解也能為蘭科 植物的保育，特別是真菌異營蘭科植物的保育提供較佳的視野及策略(Bonnardeaux et al.
2007; Swarts et al. 2010)。雖然真菌異營蘭科植物與特殊真菌之間的專一性程度可能會影響這 類型真菌異營蘭科植物的地理分布，然而目前對蘭科植物生長的微棲地環境中的真菌物種多 樣性與真菌異營蘭科植物的生長與分布的相關性仍較少被研究與了解(Batty et al. 2001)。赤 箭屬植物大部分分布於亞洲及大洋洲地區，北起西伯利亞東緣，韓國、日本、台灣、中國，
西至印度半島南抵澳洲及紐西蘭皆可見其分布(Hsu 2008)。目前在台灣被發現的赤箭屬植物 共有 19 種，其中高赤箭(G. elata)、爪哇赤箭(G. javanica)、細赤箭(G. gracilis)、冬赤箭(G.
pubilabiata)、日本赤箭(G. nipponica)、緋赤箭(G. callosa)和清水氏赤箭(G. shimizuana)為全球 廣域分布型的物種。高赤箭(G. elata)主要分布於東亞地區，包含西伯利亞、韓國、日本、台 灣及中國，並向南延伸至喜馬拉雅山區至印度東北一帶。爪哇赤箭(G. javanica)主要分布於 東南亞地區如菲律賓、中南半島及印度尼西亞各島嶼，其北界則延伸至琉球群島(Hsu
2008)。細赤箭(G. gracilis)和冬赤箭(G. pubilabiata)分布於日本與台灣；日本赤箭(G.
nipponica)分布於日本、琉球與台灣；緋赤箭(G. callosa)則在爪哇與台灣都曾被發現；清水氏
赤箭(G. shimizuana)則分布於琉球群島與台灣。其餘 12 種赤箭屬植物為台灣特有種，主要分 佈於低海拔至 1500 公尺的山區(Hsu 2008)。本計畫將以爪哇赤箭(G. javanica)及已發表過的 夏赤箭(G. flavilabella)研究結果來探討區域分布型赤箭屬植物與廣泛分布型赤箭屬植物對微 棲地環境中的真菌族群結構是否有不同專一程度的依存性，我們認為地區分布類型的赤箭屬 植物其植物-真菌的專一程度應較全球廣泛分布類型的赤箭屬植物高。爪哇赤箭(G. javanica) 是屬於全球廣域分布類型的赤箭屬植物主要分布於東南亞地區如菲律賓、中南半島及印度尼 西亞各島嶼，北界則延伸至琉球群島，在台灣則可見於恆春半島、蘭嶼及綠島等地區；夏赤 箭(G. flavilabella)則為區域分布類型的赤箭屬植物是台灣特有種，因此我們可以比較相類似 地理區塊環境中的真菌菌相差異與爪哇赤箭及夏赤箭中的真菌族群結構是否有關聯性。
研究材料與方法:
我們隨機挑選了五棵爪哇赤箭植物塊莖及植物塊莖周圍三公分土壤來萃取 DNA，所以 目前共有十個樣品的 DNA 以雙端定序(paired-end, PE)的次世代定序法進行定序，定序的結 果顯示QT≥ 35 的高品質讀序資料量約為 0.2GB。整體來說，每個樣品至少都有 700,000 條 經由雙端定序產生的 DNA 序列資料。經過資料品質篩選處理後，每個樣品大概有 500,000 條甚至更多的 DNA 序列資料可供後續分析使用。
我們以選定用來檢驗真菌的分子標誌，對土壤及植物塊莖 DNA 以聚合酶鏈鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR)進行擴增，在上機前先以定量即時聚合酶鏈鎖反應
(Quantitative real time polymerase chain reaction，簡稱 Q-PCR)和 Qubit 核酸測定儀來定量欲 上機的 DNA libraries，之後以高通量定序技術(Illumina HiSeq 2000/2500)進行雙端定序 (Paired-End sequencing)。並以下列步驟處理定序結果：1) 根據引子的序列以 BLAST
(v2.2.29+, options: -word_size 5 -evalue 0.001)的方式，檢查每條 reads 上單邊引子(正向引子或 是反向引子)的序列只能出現一次。若 reads 定序的長度夠長時，可能在同一條 reads 上會各 出現一次正向引子(forward primer)和反向引子(reverse primer)的序列。接著移除符合上述條 件 reads 的引子序列；2)利用 FLASH (v1.2.7)軟體以原始參數設定(雙端定序中間的重疊序列
需要≥10 bp)，將雙端定序的同一種 PCR 產物的正反引子序列組合成一條完整的 DNA 序列 並移除<100 bp 的 reads；3) 再以每 5 bp 為一個視窗掃描第二個步驟中已組合好的 reads，確 保這些 reads 的定序品質(Quality trim) ≥ 30。我們會使用這些高品質的 reads 進行後續的結果 分析。
物種歸類(Taxonomy classification)
為了確定在目前已知核糖體大次單元序列資料庫中尋找與高品質組合讀序(merged reads) 序列最相近的已知物種，本研究使用 MegaBLAST(Altschul et al. 1990; Morgulis et al.
2008)(v2.2.29+, option: −word_size16 -evalue 1e-10)將高品質組合讀序與核糖體大次單元參考 序列兩兩進行序列的比對。對於每條讀序，其序列比對位於最上方的結果具有最低 E 值(E- value)，也就是說本研究使用最鄰近法對讀序進行註解與歸類。兩者序列比對後可找出高品 質組合讀序序列在目前已知核糖體大次單元序列資料庫中最相近且相對應的序列資料，進一 步知悉該序列已知的物種分類譜系，其比對結果可能會找出超過一個以上的相對應序列資 料，因此比對序列歸類的規則被修改如下。首先，將比對結果之已知物種譜系中含有
“uncultured”或“fungal_sp”關鍵字，視為目前未知的物種。如果比對結果存在目前已知並且有 明確分類階層的譜系，則比對結果中目前屬於未知物種類的譜系會被排除。其次，選擇比對 結果中該序列具有最完整物種分類資訊的譜系。最後，如果在已知物種分類層級中有一個以 上的分類層級目前屬於未被歸類，亦視為被未分類的譜系。根據物種分類的標準，本研究從 物種分類中界的層級開始將讀序做歸類。
操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)分析
本研究使用 UPARSE pipeline (Edgar 2013)(v7.0.1090)將每個樣品獲得的高品質真菌組合 讀序叢集轉為操作分類單元來表示，其步驟如下：1)本研究只使用唯一讀序，計算同一讀序 被定序的數量後，以單一條讀序作為代表序列，稱為唯一讀序(usearch –derep_fulllength – sizeout)；2)以讀序被計數的數目將唯一讀序排序與移除無法被歸群的 singletons(−sortbysize – minsize 2)；3)進行 OTU 群集分析(−cluster_otus)；4)嵌合 OTUs(Chimeric OTUs)會進一步利 用 NCBI LSU 序列作為參考過濾(−uchime_ref –db ncbilsu.fa –strand plus –nonchimeras)；5)唯 一讀序會被重新分配給相似度閥值(cutoff)為 0.97 的OTU(−usearch_global –starnd plus –id 0.97)。然後獲得 OTUs 的統計數據，用收集來的 OTU 代表序列比較真菌菌相的異同。
結果與討論：
為了瞭解爪哇赤箭植物塊莖中和周圍土壤中真菌菌相組成的差異，我們利用 UPARSE 軟體將真菌的 DNA 序列資料進行親緣分類分析(Operational Taxonomic Units, OTUs)將 DNA 序列資料進行相似程度親緣分類分析，若定序得到的真菌 DNA 序列彼此間的相似度達到 97%就會暫時被歸類為同一群 OTU。從爪哇赤箭植物塊莖中隨機取樣 20,000 條 DNA 序列資 料分析後可得到約為 99-189 個 OTUs，在植物塊莖周圍土壤中的 DNA 序列資料則能被歸類 為 299-454 個 OTUs。我們發現爪哇赤箭周圍土壤中真菌 OTUs 的數量都遠高於植物塊莖中 真菌 OTUs 的數量，這結果也指出土壤中真菌菌相組成的複雜度是很高的，且爪哇赤箭對某 些真菌具有偏好性，因為爪哇赤箭中的真菌組成和土壤中真菌菌相組成並不相似。
為了探討爪哇赤箭植物塊莖中與周圍土壤的真菌菌相組成，我們使用 NCBI 資料庫中的 28S DNA 序列資料並以 BLAST 的方式對從爪哇赤箭塊莖與周圍土壤所獲得的讀序資料進行 真菌物種辨識分析。分析
結果顯示，以綱的分類層 級來說(圖一)，這些爪哇 赤箭植物塊莖中與周圍 土壤中數量比例最高的 真菌物種，佔有最高比例 的真菌物種全為擔子菌 門 分 類 下 的 傘 菌 綱 (Agaricomycetes) 真 菌 (16.69%-75.05%) ， 這 些
真菌物種依序分別為子囊菌門分類下的錘舌菌綱(Leotiomycetes)真菌(17.65%)、糞殼菌綱 (Sordariomycetes)真菌(17.95%, 21.51%)與擔子菌門分類下的傘菌綱真菌(27.79%, 14.89%)。
在目(order)的分類層級來說(圖二)，大部分爪哇赤箭植物塊莖中站數量比例最高的真菌物 種為擔子菌門分類下的傘菌目真菌；少部分爪哇赤箭植物塊莖中數量比例較高的真菌物種則 分別屬於子囊菌門
分類下的刺盾炱目 (Chaetothyriales) 真 菌 (11.08%) 和 擔 子 菌門分類下的木耳 目 (Auriculariales) 真菌(19.31%)；而五 棵爪哇赤箭周圍土 壤中數量比例最高
的真菌物種依序分別為子囊菌門分類下的柔膜菌目(Helotiales)真菌(15.66%)、肉座菌目 (Hypocreales)真菌(10.39%)、酵母目(Saccharomycetales)真菌(16.9%)、擔子菌門分類下的傘菌 目(Agaricales)真菌(13.73%)和子囊菌門分類下的酵母目真菌(4.99%)。
在科(family)的分類層級可發現(圖三)，這五棵爪哇赤箭植物塊莖中數量比例最高的真菌 物種分別是，擔子菌門分類下的口磨科(Tricholomataceae)真菌(8.4%)、彈球菌科
(Sphaerobolaceae)真菌(8.86%)、子囊菌門分類下的毛筒殼科(Tubeufiaceae)真菌(8%)、擔子菌 門分類下的明目耳
科(Hyaloriaceae)真 菌(19.26%)和角擔 菌科
(Ceratobasidiaceae) 真菌(26.28 %)；而 五棵爪哇赤箭周圍 土壤中數量比例最
高的真菌物種依序分別為子囊菌門分類下的晶杯菌科(Hyaloscyphaceae)真菌(9.65%)、接合菌 門(Zygomycota)分類下的被孢黴科(Mortierellaceae)真菌(8.27%)、子囊菌門分類下的酵母科
(Saccharomycetaceae)真菌(16.6%)、地星科(Geastraceae)真菌(11.02%)和黑耳科(Exidiaceae)真 菌(8.31%)。
在屬(genus)的分類層級可發現(圖四)，這五棵爪哇赤箭植物塊莖中數量比例最高的真菌 物種分別是，擔子菌門分類下的老傘屬(Gerronema)真菌(8.27%)、彈球菌屬(Sphaerobolus)真 菌(8.86%)、子囊
菌門分類下的毛筒 腔菌屬(Tubeufia) 真菌(7.95%)、擔 子菌門分類下的波 多耳屬(Bourdotia) 真菌(19.26%)和子 囊菌門分類下的似
指狀孢菌屬(Dactylaria)真菌(4.04%)；而五棵爪哇赤箭周圍土壤中數量比例最高的真菌物種 依序分別為子囊菌門分類下的 Hyaloscypha 屬真菌(9.64%)、黑殭菌屬(Metarhizium)真菌 (7.57%)、酵母屬(Saccharomyces)真菌(16.45%)、擔子菌門分類下的地星屬(Geastrum)真菌 (10.96%)和接合菌門分類下的被孢黴屬(Mortierella)真菌(7.21%)。
在夏赤箭的研究中顯示夏赤箭塊莖中的真菌族群結構包括菌相種類及數量均不受周遭土 壤中真菌族群結構的影響，在爪哇赤箭的研究中也是如此爪哇赤箭塊莖中的真菌族群結構也 不受周遭土壤中真菌族群結構的
影響。但是當我們把夏赤箭及爪 哇赤箭的塊莖及周遭土壤中真菌 OTUs 放在一起分析時，分析後 的資料顯示夏赤箭塊莖中的真菌 族群結構較不受周遭土壤中真菌 族群結構的影響，而爪哇赤箭塊 莖中的真菌族群結構比較容易受 周遭土壤中真菌族群結構的影
響。從圖五的 OTUs 相似程度分析中我們可以看的出來所有爪哇赤箭塊莖中的真菌 OTUs 彼 此間的相似程度是比較高的因此聚集成一群，而爪哇赤箭周遭土壤中的真菌族群結構亦比較 類似也因此聚集成一群，不存在著第八棵爪哇赤箭塊莖中的真菌族群結構亦會比較像第八棵 爪哇赤箭周遭土壤中的真菌族群結構的現象。有趣的是夏赤箭塊莖中的真菌族群彼此間的相 似程度是比較高的因此也聚集成一群，可是這一分支卻和爪哇赤箭塊莖中的真菌族群及爪哇 赤箭周遭土壤中的真菌族群比較近，反而和夏赤箭周遭土壤中真菌這一群的相似程度較遠，
此分析結果支持我們當初所提出假說，即地區分布型的赤箭植物對真菌的專一性程度較高且 不易受周遭土壤的真菌族群結構所影響，而廣域分布型的赤箭植物對真菌的專一性程度較低 較易受周遭土壤的真菌族群結構所影響。
除了 OTUs 相似程度分析外，我們另外還有幾項證據可以支持地區分布型的夏赤箭植物 對真菌的專一性程度較高，而廣域分布型的爪哇赤箭植物對真菌的專一性程度較低。在屬的 分類層級下來看夏赤箭即爪哇赤箭的真菌族群分布(圖六)，我們可以知道，夏赤箭植物塊莖 中真菌菌相以小菇
屬真菌為主且具有 很高的比例(約佔 47.15% - 96.45%)，
除了夏赤箭第三棵 植物塊莖因未能被 歸類的真菌物種比 例大幅上升
(85.02%)導致小菇
屬真菌物種比例看似較低外(6.86%)，小菇屬真菌可以說是夏赤箭塊莖中最主要的真菌了。
可是在爪哇赤箭中就不是如此了，爪哇赤箭中各棵植物塊莖內主要的真菌仍都不同，第二 棵、第四棵和第八棵分別以擔子菌門分類下老傘屬(8.27%)、彈球菌屬(8.86%)和波多耳屬 (19.26%)真菌為主，第六棵和第七棵則分別以毛筒腔菌屬(7.95%)和似指狀孢菌屬(4.04%)真 菌為主。在此分類階層，夏赤箭周圍土壤中，主要的真菌為 Mortierellomycotina 分類下的 Mortierellaceae(7.95%-13.32%)，爪哇赤箭周圍土壤中因 Mortierellaceae 的比例被分至其他物
種因此略微下降，主要的真菌變為酵母屬(0.01%-16.45%)。此項證據可以支持地區分布型的 夏赤箭植物對真菌的專一性程度較高，而廣域分布型的爪哇赤箭植物對真菌的專一性程度較 低。
為進一步瞭解夏赤箭植物比爪哇赤箭植物對真菌的專一性程度為高，我們運用生物多樣 性指標中廣泛被用來計算物種多樣性的 Shannon-Wiener 指數(H') (Shannon 1948)，分別計算 夏赤箭和爪哇赤箭植物塊莖中與周圍土壤真菌物種組成多樣性的差異。由圖七，可看出組成 爪哇赤箭植物塊莖中真菌菌相多樣性遠高於夏赤箭植物塊莖中真菌菌相多樣性，而兩者周圍 土壤中真菌菌相多
樣性組成則相差不 遠。這結果顯示，
爪哇赤箭植物塊莖 中真菌菌相多樣性 較高代表爪哇赤箭 對真菌的專一性程 度較低因此在爪哇 赤箭植物塊莖中能 容許較多不同種類
共生真菌存在，相反的在夏赤箭植物塊莖中真菌菌相多樣性較低代表著夏赤箭對真菌的專一 性程度較高因此在夏赤箭植物塊莖中只能容許少數不同種類共生真菌的存在，而在夏赤箭與 爪哇赤箭周圍土壤中真菌菌相多樣性並無差異，因此說明在夏赤箭與爪哇赤箭植物塊莖中真 菌菌相多樣性的差異並不是由於其周圍土壤中真菌菌相多樣性的差異所造成的。
參考文獻:
Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215: 403-410.
Anderson IC, Campbell CD, Prosser JI. 2003. Potential bias of fungal 18S rDNA and internal transcribed spacer polymerase chain reaction primers for estimating fungal biodiversity in soil. Environmental microbiology 5: 36-47.
Batty AL, Dixon KW, Brundrett M, Sivasithamparam K. 2001. Constraints to symbiotic
germination of terrestrial orchid seed in a mediterranean bushland. New Phytologist 152:
511-520.
Baumgartner K, Bhat R, Fujiyoshi P. 2010. A rapid infection assay for Armillaria and real-time PCR quantitation of the fungal biomass in planta. Fungal biology 114: 107-119.
Bidartondo MI. 2005. The evolutionary ecology of myco-heterotrophy. The New phytologist 167:
335-352.
Bidartondo MI, Redecker D, Hijri I, Wiemken A, Bruns TD, Dominguez L, Sersic A, Leake JR, Read DJ. 2002. Epiparasitic plants specialized on arbuscular mycorrhizal fungi. Nature 419:
389-392.
Bonnardeaux Y, Brundrett M, Batty A, Dixon K, Koch J, Sivasithamparam K. 2007. Diversity of mycorrhizal fungi of terrestrial orchids: compatibility webs, brief encounters, lasting relationships and alien invasions. Mycol Res 111: 51-61.
Cubeta MA, Echandi E, Abernethy T, R. V. 1991. Characterization of anastomosis groups of binucleate Rhizoctonia species using restriction analysis of an amplified ribosomal RNA gene. Phytopathology 81: 1395-1400.
Currah RS, Zelmer CD, Hambleton S, Richardson KA. 1997. Fungi from orchid mycorrhizas. In Orchid Biology: Reviews and Perspectives, Vol VII (ed. J Arditti, AM Pridgeon), pp. 117- 170. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.
Edgar RC. 2013. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Methods 10: 996-998.
Hsieh CL, Chiang SY, Cheng KS, Lin YH, Tang NY, Lee CJ, Pon CZ, Hsieh CT. 2001.
Anticonvulsive and free radical scavenging activities of Gastrodia elata Bl. in kainic acid- treated rats. Am J Chin Med 29: 331-341.
Hsieh MT, Wu CR, Chen CF. 1997. Gastrodin and p-hydroxybenzyl alcohol facilitate memory consolidation and retrieval, but not acquisition, on the passive avoidance task in rats.
Journal of ethnopharmacology 56: 45-54.
Hsu T-C. 2008. Taxonomy of Gastrodia (Orchidaceae) in Taiwan. In Graduate Institute of Ecology and Evolution Biology, Vol Master, p. 169. National Taiwan University, Taipei.
Jacquemyn H, Honnay O, Cammue BP, Brys R, Lievens B. 2010. Low specificity and nested subset structure characterize mycorrhizal associations in five closely related species of the genus Orchis. Mol Ecol 19: 4086-4095.
Jacquemyn H, Honnay O, Cammue BP, Brys R, Lievens B. 2010. Low specificity and nested subset structure characterize mycorrhizal associations in five closely related species of the genus Orchis. Mol Ecol 19: 4086-4095.
Kruger M, Stockinger H, Kruger C, Schussler A. 2009. DNA-based species level detection of Glomeromycota: one PCR primer set for all arbuscular mycorrhizal fungi. The New phytologist 183: 212-223.
Leake JR. 2005. Plants parasitic on fungi: unearthing the fungi in myco-heterotrophs and debunking the 'saprophytic' plant myth. Mycologist 19: 113-122.
Liu T, Li CM, Han YL, Chiang TY, Chiang YC, Sung HM. 2015. Highly diversified fungi are associated with the achlorophyllous orchid Gastrodia flavilabella. BMC Genomics 16: 185.
Martin KJ, Rygiewicz PT. 2005. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC microbiology 5: 28.
Morgulis A, Coulouris G, Raytselis Y, Madden TL, Agarwala R, Schaffer AA. 2008. Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics 24: 1757-1764.
Prodorutti D, Vanblaere T, Gobbin D, Pellegrini A, Gessler C, Pertot I. 2009. Genetic diversity of Armillaria spp. infecting highbush blueberry in northern Italy (Trentino region).
Phytopathology 99: 651-658.
Rasmussen HN. 1995. Terrestrial Orchids, from Seed To Mycotrophic Plant. Cambridge University Press, Cambridge.
Roy M, Watthana S, Stier A, Richard F, Vessabutr S, Selosse MA. 2009. Two mycoheterotrophic orchids from Thailand tropical dipterocarpacean forests associate with a broad diversity of ectomycorrhizal fungi. BMC Biol 7: 51.
Shannon CE. 1948. A Mathematical Theory of Communication. Bell System Technical Journal 27:
379-423.
Smith SE, Read DJ. 2008. Mycorrhizal symbiosis. Academic Press, New York.
Swarts ND, Sinclair EA, Francis A, Dixon KW. 2010. Ecological specialization in mycorrhizal symbiosis leads to rarity in an endangered orchid. Mol Ecol 19: 3226-3242.
Taylor DL, McCormick MK. 2008. Internal transcribed spacer primers and sequences for improved characterization of basidiomycetous orchid mycorrhizas. The New phytologist 177: 1020- 1033.
Vancov T, Keen B. 2009. Amplification of soil fungal community DNA using the ITS86F and ITS4 primers. FEMS microbiology letters 296: 91-96.
Vilgalys R, Hester M. 1990. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of bacteriology 172: 4238- 4246.
Wang X, Bauw G, Van Damme EJ, Peumans WJ, Chen ZL, Van Montagu M, Angenon G, Dillen W. 2001. Gastrodianin-like mannose-binding proteins: a novel class of plant proteins with antifungal properties. The Plant journal : for cell and molecular biology 25: 651-661.
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications, (ed. MA Innis, et al.), pp. 315-322. Academic Press, San Diego.
Wu CR, Hsieh MT, Liao J. 1996. p-Hydroxybenzyl alcohol attenuates learning deficits in the inhibitory avoidance task: involvement of serotonergic and dopaminergic systems. The Chinese journal of physiology 39: 265-273.
Xu J-T, Guo S-X. 2000. Retrospect on the research of the cultivation of Gastrodia elata Bl, a rare traditional Chinese medicine. Chinese Medical Journal 113: 686-692.
105年度專題研究計畫成果彙整表
計畫主持人：宋皇模 計畫編號：105-2621-B-006-003- 計畫名稱：環境真菌物種多樣性與赤箭屬植物物種多樣性
成果項目 量化 單位
質化
（說明：各成果項目請附佐證資料或細 項說明，如期刊名稱、年份、卷期、起 訖頁數、證號...等）
國 內
學術性論文
期刊論文 0
研討會論文 0 篇
專書 0 本
專書論文 0 章
技術報告 0 篇
其他 0 篇
智慧財產權 及成果
專利權 發明專利 申請中 0
件
已獲得 0
新型/設計專利 0
商標權 0
營業秘密 0
積體電路電路布局權 0
著作權 0
品種權 0
其他 0
技術移轉 件數 0 件
收入 0 千元
國 外
學術性論文
期刊論文 0
研討會論文 0 篇
專書 0 本
專書論文 0 章
技術報告 0 篇
其他 0 篇
智慧財產權 及成果
專利權 發明專利 申請中 0
件
已獲得 0
新型/設計專利 0
商標權 0
營業秘密 0
積體電路電路布局權 0
著作權 0
品種權 0
其他 0
技術移轉 件數 0 件
收入 0 千元
參 與 計 畫 人 力
本國籍
大專生 0
人次
碩士生 0
博士生 0
博士後研究員 0
專任助理 0
非本國籍
大專生 0
碩士生 0
博士生 0
博士後研究員 0
專任助理 0
其他成果
（無法以量化表達之成果如辦理學術活動
、獲得獎項、重要國際合作、研究成果國 際影響力及其他協助產業技術發展之具體 效益事項等，請以文字敘述填列。）
研究論文撰寫中
