行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
利用動力素蛋白質馬達與雙價性 DNA aptamer 來達到在微流 道中單方向地運輸特定分子的目的
計畫類別： 個別型計畫
計畫編號： NSC94-2218-E-038-001-
執行期間： 94 年 12 月 01 日至 95 年 07 月 31 日 執行單位： 臺北醫學大學生化學科
計畫主持人： 郭泰志
報告類型： 精簡報告
處理方式： 本計畫可公開查詢
中 華 民 國 95 年 10 月 31 日
計畫目的
本項計畫最終目的是欲利用kinesin 馬達蛋白質（kinesin motor protein）在微小化的檢測 器之微流道（microchannels）中具方向性及選擇性地運輸檢測物分子(analytes)。然而，kinesin 不會自然地與檢測物分子結合，兩者之間需要一個媒介分子（adapter）；此項研究提議以雙價 性aptamers 作為所需的媒介分子（相關背景資訊及詳細計畫內容請見計畫書）。
工作項目
本期的工作重點如下：利用基因重組技術[包括基因選殖，細菌轉型，以及誘發基因表 現]，生產與純化kinesin 馬達蛋白質的重鍊(kinesin heavy chain, KHC)，輕鍊(kinesin light chain, KLC)，以及輕鍊中的 tetratricopeptide (TRP domain)蛋白質區團；從動物的腦組織中純化微管 束蛋白質（microtubule proteins；kinesin 得在微管束上才能運動）；備製篩選 aptamers 所需的 單股DNA library (ssDNA library)；從 ssDNA library 中篩選 TRP 蛋白質區團的 DNA aptamers。
目前成果
(1) 本計畫主持人已經將專門表現於人類神經細胞的 kinesin 的重鍊 (KHC, KIF5A)，輕 鍊(KLC2)，以及輕鍊中的 TRP 區團的蛋白質的互補 DNA (cDNA)以核酸聚合連鎖反應複製（圖 一）並選殖到大腸桿菌的表現載體（圖二）；所殖入的DNA 的序列也已經確認無誤。含有表 現載體的大腸桿菌E. coli BL21(DE3)菌株（三株菌，分別含 r-KIF5Awt, r-KLC2 及 r-TRP），在 乳糖類似物IPTG 的誘發下生產蛋白質，這些蛋白質從細菌萃取液中以親和性層析方式
（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）純化出來，以蛋白質電泳(protein polyacrylamide gel electrophoresis)與質譜儀（mass spectroscopy）鑑定其身份，確認無誤。
(2) 篩選aptamers 所需的 ssDNA library，已經備製妥。此 ssDNA library 含有 1014種不同 序列。
(3) TRP 蛋白質 aptamers 的篩選正在進行中。
從新鮮豬腦中純化微管束蛋白質的工作正在進行中。
(4) 利用電腦來模擬篩選aptamers 所用的 SELEX 技術所需的最佳條件，其結果最近已經 投稿並且為國際學術期刊（SCI）Computers And Chemical Engineering 所接受（available online Oct 16, 2006）。
成果意義與未來工作
Kinesin 以及微管束在真核細胞中參與各種胞器（organelles）的運輸及細胞分裂時紡鎚絲 及染色體的分離，其所展現的精巧功能，對於發展微小化檢測機件的構想很具啟發意義。因 此，能夠自行備製kinesin 以及微管束是發展馬達蛋白質於體外系統（in vitro system）的仿生 應用的重要基礎。另外，目前已知kinesin 所涉及的分子運輸與許多的神經或運動退化疾病有 關，但是kinesin 如何辨識及結合被其所運輸的分子（cargo molecules）仍然不是很清楚；能 夠在體外重組（reconstruct and manipulate）kinesin 的分子運輸系統對於這些的疾病的研究也 有幫助。
未來仍須完成的工作包括：以生物化學及物理方法鑑定自行備製的kinesin 以及微管束及
完成TRP 區團 aptamers 的篩選。
圖一 (A) Kinesin 馬達蛋白質的重鍊(kinesin heavy chain, KHC)，(B) 輕鍊(kinesin light chain, KLC)以及 tetratricopeptide (TRP domain)蛋白質區團的 cDNA 複製策略；（C）以洋菜凝膠電 泳檢驗所複製的基因重組cDNA 產物的分子量。
含有人類神經細胞的馬達蛋白質重鍊與輕鍊cDNA 的載體（pKIF5Ad36nt-CMV6-XL4 與 pKLC2-CMV6-XL4）是向美國生物技術公司 OriGene 所購買。經 DNA 定序後發現所購得的 重鍊的基因比起原生型(NCBI KIF5A wild type)少了 36 個重要核苷酸(nucleotides)，因此利用 重複性核酸聚合連鎖反應（overlapping PCR）技術將短缺的部分補齊，重新產生原生型基因 重組馬達蛋白質重鍊的cDNA (r-KIF5Awt)（圖一 A）。至於馬達蛋白質輕鍊，所購得的基因序 列則無錯誤；經由核酸聚合連鎖反應，分別複製了完整的基因重組馬達蛋白質輕鍊的cDNA (r-KLC2) 以及其中的 TRP 區團蛋白質的 cDNA (r-TRP) (圖一 B)。所獲得的基因重組 cDNA 產物，包括r-KIF5Awt (3126bp)，r-KLC2 (1893 bp)與 r-TRP (618 bp)，其分子量大小與預期值 相符。
圖二 基因重組馬達蛋白質表現載體的建構
圖一所示的cDNA 經過 DNA 剪制脢(Nhe I, Bam H I)的處理後，戡入細菌表現載體(pET24b, Novagen Inc.)，送入大腸桿菌 E. coli BL21(DE3)菌株。經選殖與定序確認後，含有載體的菌株 以IPTG 來誘發外來蛋白質基因的表現，利用 IMAC 從細胞萃取液中純化基因重組蛋白質。
