第三章 實驗部分
第一節 實驗材料
一、 實驗試藥
(一) 標準品及試劑
1. Hesperidin (97%) Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo, U.S.A.)
2. Hesperetin (95%) Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.)
3. Naringin (95 %) Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.)
4. (±)-Naringenin (95 %) Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.)
5.Narirutin (95 %) Extrasynthese (Genay France) 6. Polyethylene glycol 400 Merck，Germany
7.β-Glucuronidase (type B-1) Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.)
8. Sulfatase (type H-1) Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.)
9. Acetonitrile, LC Grade J. T. Backer Inc. (Phillipsburg, NJ, U.S.A.) 10. Methyl alcohol, LC Grade Mallinckrodt Baker, Inc. (Paris, KY,
U.S.A.)
11. Ethyl acetate, LC Grade J. T. Backer Inc. (NJ, U.S.A.)
12. Ortho-phosphoric acid, 85% Riedel-deHaën AG (Seelze, Germany) 13. L (+) - Ascorbic acid Riedel-deHaën AG (Seelze, Germany) 14. Ethyl paraben Aldrich (WI, U.S.A.)
15. Dimethylacetamide Wako (Osaka, Japan)
16. Ethyl ether Shimakyu’s Pure Chemical (Osaka, Japan) 17. Methotrexate Wyeth (Wolfratshausen, Germany)
18. 6,7-dimethoxycoumarin (98%) Aldrich (Milwaukee,WI, U.S.A.) 19. 5,7-dimethoxycoumarin (99%) Aldrich (Milwaukee,WI, U.S.A.) 20. Hydrochloric acid Wako Pure Chemical Industries. Ltd.
(Osaka, Japan)
21. Sodium acetate, anhydrous Kohusan Chemical Works, Ltd.
(Kyoto, Japan)
22. TDx Methotrexate kit Abbott Laboratories (Abbott Park, Illinois, U.S.A.)
23. Milli-Q Millipore Co. (Bedford, MA, U.S.A.)
24. 藥用酒精 臺灣菸酒公賣局
二、 儀器設備 (一) 儀器
1. 酸鹼測定儀
Microprocessor pH-mV meter
W.T.W. (Taiwan)
2. 高速離心機 Z 200 M/H
Hermle (Germany)
3. 渦旋振盪器
Vortex Genie G-560
Scientific Industries Inc. (U.S.A.)
4. 超音波振盪器 Bransonic 8120
Branson Ultrasonics Co. (U.S.A.)
5. 控溫往復式振盪水槽 BT-350
Yih Der Instruments Co., Ltd. (Taiwan)
6. 氮氣濃縮裝置 N-EVAP 112
Organomation Associates Inc. (U.S.A.)
7. 分析天平 AB 104
Mettler Toledo (Switzerland)
8. 微量移液管
Pipette 2-20 µL, 10-100 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Eppendorf-Netheler-Hinz Gmbh (Germany)
9. 水壓抽氣機
Eyela Aspirator A-2S
Tokyo Rikakikai Co. Ltd. (Japan)
10. 電熱板 HP-20
Shin Kwang Machinery Industry (Taiwan)
11. 高效液相層析儀包括:
幫浦 LC-10AT
Shimadzu (Japan)
層析管
Cosmosil (150 × 4.6 mm) Apollo ® (250 × 4.6 mm)
Waters (U.S.A.)
管柱前濾膜 LiChroCART®4-4
Merck (Germany)
紫外光偵測器 SPD-10A
Shimadzu (Japan)
自動注射器 SIL-10AD
Shimadzu (Japan)
12. 螢光偏極免疫分析儀 Abbott Laboratories (U.S.A.)
（二）實驗動物用器材 1. 拋棄式注射針及針筒
3.0 mL Syringe (0.55×25 mm)
1.0 mL Syringe (0.45×13 mm) Terumo (Japan) 2. 胃管
(0.9×L 70 mm, 1.5×L 120 mm) 晶龍科技儀器有限公司 (Taiwan) 3. 微量離心管
(1.7 mL 透明管)
Axycen Scientific Inc. (U.S.A.)
4. 針頭濾膜
(0.22 µm, 0.45 µm)
Alltech Associates Inc. (U.S.A.)
三、 實驗動物
Sprague-Dawley 大白鼠 中國醫藥大學動物中心
四、 溶液製備 1. 內標準溶液
a. 精確稱取 5,7-dimethoxycoumarin 10.0 mg，加入乙酸乙酯定容 至 10.0 mL，即得 1.0 mg/mL 之貯存溶液，再以乙酸乙酯稀釋 成各種所需濃度之內標準溶液。
b. 6,7-dimethoxycoumarin 製備方法如上。
2. 緩衝溶液 (pH 5.0)
取 0.1N 醋酸鈉溶液（a） 68 mL，加入 0.1N 醋酸溶液（b）
至 100 mL，再加 1N 氫氧化鈉調至 pH = 5.0 ± 0.1。
（a）0.1N 醋酸鈉溶液：
稱取 0.82 g 無水醋酸鈉，加水溶解至 100 mL。
（b）0.1N 醋酸溶液：
量取醋酸 (d = 1.049) 0.6 mL，加水至 100 mL。
3. β-Glucuronidase 溶液
取β-glucuronidase (666,400 units/g, type B-1) 75.0 mg，以 pH 5.0 緩衝溶液溶解使成 50 mL，貯存於-30℃備用。
4. Sulfatase 溶液
取 sulfatase (20,000 units/g, type H-1) 2.5 g，以 pH 5.0 緩衝溶 液溶解使成 50 mL，貯存於-30℃備用。
5. 抗壞血酸溶液
稱取抗壞血酸 100 mg，加水至 1 mL 即得 100 mg/mL 之抗壞 血酸溶液，使用前新鮮製備。
6. MTX 溶液
精確量取 1.0 mL MTX (25 mg/mL)，加水定容至 10.0 mL，即 得 2.5 mg/mL 之 MTX 溶液，使用前新鮮製備。
第二節 實驗方法
一、 Hesperetin 於大白鼠體內之代謝動力學
(一) 血清標準溶液之製備及定量前處理
精確稱取 hesperetin，以甲醇溶解並稀釋定容，製備介於 4.0 ~ 1000.0 µg/mL 間之 9 種濃度標準溶液，各取 100 µL 標準溶液，
加入 900 µL 空白血清，得濃度分別為 0.4, 0.8, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25.0, 50.0 及 100.0 µg/mL 之血清標準溶液。
(二) 檢量線之繪製
取 100 µL 血清標準溶液，加 100 µL 緩衝液 (pH 5.0)、 50 µL 抗壞血酸 (100.0 mg/mL) 及 50 µL 0.1 N 鹽酸，再以 300 µL 含內 標準 (2.0 µg/mL 5,7-dimethoxycoumarin) 之乙酸乙酯萃取，用試管 振盪器振盪 20 秒後高速離心 (9860 g) 15 分鐘，取乙酸乙酯層，
用氮氣吹乾後，以 50 µL 氰甲烷溶解，取 20 µL 供 HPLC 分析。
(三) 動物給藥及採血
雄性 Spraque-Dawley 大白鼠，體重介於 400 ~ 550 g，實驗前 禁食 12 小時。採隨機交叉設計給藥。
(1) 靜脈快速注射給藥及採血
Hesperetin 溶 液 (10 mg/mL) 以 dimethylacetamide ： PEG 400：water （1：5：4）之混合溶媒溶解，並經 0.22 µm 滅菌濾
膜 (cellulose acetate) 去除熱原。
相當於 10 mg/kg 劑量之 hesperetin 溶液，經由尾靜脈快速 注射給藥，給藥後於 3, 15, 30, 60, 120, 180, 240 及 480 分鐘從心 臟採血，每次採血 0.8 mL，離心 (9860 g) 15 分鐘，取上層血清，
貯存於 -30 ℃，俟後分析。
(2) 口服給藥及採血
Hesperetin 溶液 (50 mg/mL) 之製備，與靜脈快速注射溶液所 用之溶媒相同，但未經 0.22 µm 濾膜過濾滅菌。
靜脈快速注射給藥一週後，經由胃管口服給予 50 mg/kg hesperetin 溶液，給藥後於 5, 15, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 480 及720 分鐘從心臟採血，每次採血 0.8 mL，離心 (9860 g) 15 分 鐘，取上層血清並貯存於 -30 ℃，俟後分析。
(四) 血清檢品之前處理及定量
血清中 hesperetin 及其 sulfates、 glucuronides 之定量
(1) 血清中自由態hesperetin之定量
取100 µL 血清檢品，加100 µL 緩衝液 (pH 5.0)、50 µL 抗壞 血酸 (100 mg/mL) 及 50 µL 0.1 N 鹽酸，再以 300 µL 含內標準 (2.0 µg/mL 5,7-dimethoxycoumarin) 之乙酸乙酯萃取，用試管振盪
器振盪 20 秒後高速離心 (9860 g) 15 分鐘，取乙酸乙酯層，用氮 氣吹乾後，以 50 µL 氰甲烷溶解，取 20 µL 供 HPLC 分析。
(2) 血清中 hesperetin sulfates、glucuronides 之定量
取 100 µL 血清檢品，加100 µL sulfatase 或 glucuronidase (溶 於 pH 5.0 緩 衝 溶 液 ， 含 sulfatase 或 glucuronidase 1000.0 units/mL)、50 µL 抗壞血酸溶液 (100 mg/mL)、 50 µL 0.1 N 鹽 酸，以300 µL乙酸乙酯 (含2.0 µg/mL 5,7-dimethoxycoumarin 之內 標準) 萃取，用試管振盪器振盪 20 秒後高速離心 (9860 g) 15 分 鐘，取乙酸乙酯層，用氮氣吹乾後以50 µL 氰甲烷溶解，取20 µL 供 HPLC 分析。
(五) 高效液相層析分析條件
層析管：Cosmosil ® 5C18-ARⅡ column (5 µm, 4.6 x 150 mm) 流速：1.0 mL/min
檢測波長：287 nm
移動相：氰甲烷：0.1 % 磷酸 ( 35：65, v/v )之混合液
(六) 分析系統及方法之確效
(1) 精密度(precision)
將各濃度之血清標準溶液，分別於同日內早、午、晚及連續 三日之異日間各進行一次層析，並以獲得之檢量線方程式求得每 次實驗濃度。以三次同日內及三次異日間實驗濃度分別求其平均 值(mean)、標準偏差(standard deviation, S.D.)及變異係數(coefficient of variation, C.V.)。
(2) 準確度(accuracy)
三次同日內及三次異日間實驗濃度與理論濃度間之相對誤差 (relative error)表示之。
(3) 靈敏度(sensitivity)
將 hesperetin 血清標準溶液一再稀釋，直到其波峰為雜訊三倍 之濃度為偵測極限。
(4) 回收率(recovery)
將 hesperetin 標準溶液(溶於甲醇)，分別加入空白血清及水 中，製備 100.0, 12.5 及 0.4 µg/mL 等三種濃度之血清及水標準溶
液各三份，所測得之血清標準溶液之波峰面積比值除以各對應濃 度之水標準溶液之波峰面積比值，即為回收率。
(七)數據分析
使用 WINNONLIN (version 3.0; Pharsight Corp., U.S.A.)及 Excel (version 7.0, Microsoft) 等軟體計算動力學參數。
二、 Hesperidin 於大白鼠體內之動力學
經由胃管口服給予 101 mg/kg 之 hesperidin 懸浮液，給藥後於 5, 15, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 480 及 720 分鐘從心臟採血，每次採 血 0.8 mL，離心 (9860 g) 15 分鐘，取血清貯存於 -30 ℃，俟後分 析。分析方法及條件同 一、 Hesperetin 於大白鼠體內之代謝動力學。
三、 柳橙汁黃酮於人體之尿藥代謝動力學
(一)柳橙汁購買與製備
於台中市英才路某水果店購買以機器現榨整粒柳橙所得之柳橙 汁，未加水、糖及任何添加物。
(二) 柳橙汁中 hesperidin、 narirutin 之定量 1. 高效液相層析儀 (HPLC) 之分析條件
分析管柱：Apollo ® C18 5 µm (250 × 4.6 mm) 保護層析管柱：LiChrospher 100 RP-18 e ( 5 µm )
移動相：水與氰甲烷 ( 78：22 , v/v) 流速：1 mL/min
檢測波長：280 nm
內標準：6,7-dimethoxycoumarin ( 40.0 µg/mL )
2. Hesperidin、narirutin 檢量線之繪製
精確稱取 hesperidin、narirutin 各 10.0 mg，分別以少量甲醇溶 之，並定容至 5.0 mL 即為貯存溶液。取適量貯存溶液以甲醇稀釋，
使 hesperidin、narirutin 的標準溶液濃度為 50.0、25.0、12.5、6.3、
3.1、1.6 及 0.8 µg/mL。分別取標準溶液 200 µL，加入等體積之內 標準甲醇溶液 ( 6,7-dimethoxycoumarin，40.0 µg/mL )。所得之
hesperidin、 narirutin 與內標準之波峰面積比值，與 hesperidin 、 narirutin 之各已知濃度進行直線迴歸，求得檢量線之方程式。
3. 柳橙汁中 hesperidin、narirutin 之定量
柳橙汁 300 µL 加甲醇 700 µL 振盪混合，離心 15 min (9860 g) 後 ， 取 100 µL 上 清 液 加 入 等 體 積 之 內 標 準 甲 醇 溶 液 (6,7-dimethoxycoumarin，40.0 µg/mL ) 振盪混合後，以微孔濾器 ( 0.45 µm ) 過濾。取 20 µL 注入 HPLC 分析，以檢品中 hesperidin
、narirutin 與內標準之波峰面積比值代入檢量線方程式，求出檢品 中 hesperidin 與 narirutin 之含量。
4. 分析系統及方法之確效
（1）精密度 ( Precision )
將不同濃度之 hesperidin 及 narirutin 標準溶液，於同日內晨
、午、晚及連續三日之異日間各進行一次層析，然後將所得波峰 面積比值代入先前獲得的迴歸直線方程式，求得每次的實驗濃度 值，再分別求其平均值 (mean)、標準偏差 (standard deviation，S.D.) 及變異係數 ( coefficient of variation，C.V.)。
（2）靈敏度 ( Sensitivity )
將 hesperidin 及 narirutin 標準品濃度一再稀釋，直至其波峰 與雜訊之比值為 3 時之濃度為其偵測極限。
（3）準確度 (Accuracy)
三次同日內及三次異日間實驗所得平均濃度與理論濃度間之
相對誤差(relative error)表示之。
（4）回收率 ( Recovery )
取已測定 hesperidin 及 narirutin 含量之柳橙汁檢品 300 µL 各三份，分別加入已知濃度（50.0, 6.3 及 0.8 µg/mL）的 hesperidin 及 narirutin 標準品溶液 700 µL 振盪混合， 離心 15 min (9860 g) 後，取上清液 100 µL ，以 900 µL 甲醇稀釋，振盪混合後，取 200 µL 各加入等體積內標準甲醇溶液 (6,7-dimethoxycoumarin，40.0 µg/mL ) 混合後，振盪混合 1 分鐘，並高速離心 15 min (9860 g)
，然後分別層析定量，將換算所得之 hesperidin 及 narirutin 之增 加量除以已知的標準品添加量即為回收率。
（四）服用方法與尿液收集
自願受試者十一名（21-30 歲、52–78 公斤）於實驗前一週接受 健康檢查，經檢查肝酵素(SGPT、SGOT)、尿素氮(BUN)以及肌酸酐 (Creatinine)的生化指數正常，實驗前一周開始禁止食用柑橘屬類的水 果。
實驗前一天晚上十點開始禁食。實驗當天未服柳橙汁前先排空尿 液，並採空白尿液 4mL。於 20 分鐘內喝完柳橙汁 1000 mL，4 小時 後方可進食。
服藥後於 0-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-12及12-24 小時，共收 集七個時段之尿液，每段尿液分別測量並記錄其體積後，各取4 mL
之尿液，置於- 30 ℃貯存，俟後分析之用。
（五）尿液中 hesperetin、naringenin 及其結合態代謝物之分析 1. Hesperetin、naringenin 檢量線繪製
精確稱取 hesperetin 、 naringenin 各 5.0 mg，以少量甲醇溶之，
定容至 10.0 mL 為貯存溶液。將貯存溶液以甲醇稀釋成一系列濃度
（500.0、250.0、125.0、31.3、15.6、7.8、3.9、1.9 及 0.95 µg/mL），
取各濃度之標準溶液 100 µL 加空白尿 900 µL，製備 hesperetin、
naringenin 之尿標準溶液，濃度分別為 50.0、25.0、12.5、3.1、1.6、
0.8、0.4、0.2 及 0.1 µg/mL。取尿標準溶液 300 µL 加 150 µL 緩衝 溶液 (pH = 5.0) 及抗壞血酸 50 µL (200.0 mg/mL)，再於試管振盪 器上充分混合，加 100 µL 0.1 N 鹽酸及 600 µL 乙酸乙酯 (含 2.0 µg/mL 5,7-dimethoxycoumarin 內標準)，用試管振盪器振盪 20 秒後
高速離心 (9860 g) 15 min，取乙酸乙酯層，用氮氣吹乾後，以 50 µL 移動相溶解，取 20 µL 供 HPLC 分析。所得之 hesperetin 及 naringenin 與內標準之波峰面積比值與 hesperetin 及 naringenin 之 濃度進行直線迴歸。
2. 尿液中 hesperetin、naringenin 之定量
溶液） 150 µL 及抗壞血酸 50 µL (200 mg/mL)，於試管振盪器上充 分混合後，加 100 µL 0.1 N 鹽酸及 600 µL 乙酸乙酯 (含 2.0 µg/mL
5,7-dimethoxycoumarin 內標準)，用試管振盪器振盪 20 秒後高速離 心 15 min (9860 g)，取乙酸乙酯層，用氮氣吹乾後，以 50 µL 移動 相溶解，取 20 µL 供 HPLC 分析。
3. 尿液中 hesperetin 及 naringenin 結合態代謝物之定量
取尿液 300 µL，分別加 sulfatase、glucuronidase （溶於 pH 5.0 之緩衝溶液，含 sulfatase、glucuronidase 1000.0 units/mL） 150 µL 及抗壞血酸 50 µL (200 mg/mL)，於試管振盪器上充分混合後，於 37
℃ 之恆溫水槽振盪 2 小時，之後加 100 µL 0.1 N 鹽酸及 600 µL 乙酸乙酯 (含 2.0 µg/mL 5,7-dimethoxycoumarin 內標準)，用試管振 盪器振盪 20 秒後高速離心 15 min (9860 g)，取乙酸乙酯層，用氮 氣吹乾後，以 50 µL 移動相溶解，取 20 µL 供 HPLC 分析。
4. 高效液相層析分析條件
層析管：Apollo ® C18 5 µm (250 × 4.6 mm) 流速：1.0 mL/min
檢測波長：287 nm
內標準：5,7-dimethoxycoumarin
移動相：甲醇：氰甲烷：0.1 % 磷酸 ( 17：26：57, v/v/v )
5. 分析方法之確效
(1) 精密度(precision)
將各濃度之 hesperetin 及 naringenin 尿標準溶液，分別於同日 內早、午、晚及連續三日之異日間各進行一次層析，並以先前所 得 之 檢 量 線 方 程 式 求 得 每 次 實 驗 濃 度 ， 再 分 別 求 其 平 均 值 (mean)、標準偏差(standard deviation, S.D.)及變異係數(coefficient of variation, C.V.)。
(2) 準確度(accuracy)
三次同日內及三次異日間實驗濃度與理論濃度間之相對誤差 (relative error)。
(3) 靈敏度(sensitivity)
將 hesperetin 及 naringenin 尿標準溶液一再稀釋，直到其波峰 為雜訊三倍之濃度為偵測極限。
(4) 回收率(recovery)
將 hesperetin 及 naringenin (溶於甲醇)標準溶液，分別加入空
白尿 300µL 及水中，製備 50.0, 6.3 及 0.8 µg/mL 等三種濃度各三
份，所測得之尿標準溶液之波峰面積比值除以等濃度之水標準溶 液之波峰面積比值，即為回收率。
6. 數據處理及統計分析
受試者在每段尿液收集時間點，利用 Sigma-minus 計算體內之 hesperetin、naringenin sulfates/glucuronides 殘餘量之自然對數值 (Y) 與時間 (X) 作直線迴歸，得斜率(k)，再代入 t 1/2 = 0.693/k，
即得排除半衰期 (t 1/2)。
四、 大黃、黃芩水煎劑於鼠體對 Methotrexate (MTX) 動力學 之影響
(一)水煎劑之製備
(1) 實驗用藥材飲片大黃、黃芩購自台中市欣隆藥行，經五官與顯微 定，確定基原後備用。
(2) 水煎劑之製備，係精確稱取大黃、黃芩飲片各 25.0 g，分別加入 500 mL 水，先行浸泡 30 分鐘，然後以直火加熱至沸騰，轉小火繼 續加熱，煮至水煎劑約 50 mL 或更少，趁熱過濾後加水定容至 50.0 mL，置於 - 30 ℃ 儲存備用。
(二) 大黃水煎劑之定量
(1) 大黃酸水解
於 1 mL 之水煎劑中各加抗壞血酸粉末 25 mg (於棕色磨砂玻 璃試管中)，再加入 1.2 N 鹽酸溶液 1 mL，塞以瓶蓋，振盪均勻後，
置於水鍋中以 80℃加熱 6 小時後，取出、放冷。
(2) 高效液相層析儀 (HPLC) 之分析條件
層析管：COSMOSIL 5C18-ARⅡ，5 µm，4.6×250 m.m.
移動相：CH3CN---A 0.1% H3PO4---B 梯度沖提時間表
Time A B
0 50 50
10 60 40
15 85 15
20 85 15
25 50 50
流 速：1 mL/min 檢測波長：250 nm (3) 檢量線之繪製
分別取適量之 aloe-emodin、rhein、emodin、chrysophanol 貯 存溶液，加入適量之 2-methyanthraquinone 內標準甲醇溶液(10.0 µg/mL)，再以甲醇稀釋使各標準溶液之濃度為 0.8、1.6、3.2、6.3、
12.5、25.0、50.0 及 100.0 µg/mL。其中 20 µL 經 HPLC 分析後，
所得標準品與內標準之波峰面積比值，與其各標準品之濃度進行 直線迴歸，求得各成分之檢量線方程式。
(4) 水煎劑中非醣體之定量
取水煎劑 1 mL，加入 1 mL 內標準甲醇溶液 (10 µg/mL)，以 甲醇定容至 2 mL，振盪混合均勻，離心 15 分鐘(9,860g)，取其 上清液，經微孔過濾器(0.45 µm) 過濾後，取 20 µL 濾液注入 HPLC 分析，以檢品中 aloe-emodin、rhein、emodin 及 chrysophanol 與內標準之波峰面積比值代入各成分之檢量線方程式，求出檢品
中 aloe-emodin、rhein、emodin 及 chrysophanol 之含量。
(5) 水煎劑中配醣體之定量
水 煎 劑 水 解 後 定 量 出 之 aloe-emodin 、 rhein 、 emodin 及 chrysophanol 總含量減去水解前已定量出之非醣體 aloe-emodin、
rhein、emodin 及 chrysophanol 含量，即為其配醣體之含量。
(三) 黃芩水煎劑之定量
(1) 黃芩酸水解
取 0.6 mL 之水煎劑，加 1.4 mL 甲醇振盪混合，經 9860 g 高 速離心 15 分鐘，取上清液 1.5 mL，加 1.5 mL 之 0.6N HCl 溶液混 合，精取 2 mL，於棕色磨砂玻璃試管中，塞以瓶蓋。於 100℃之 水浴反應 1.5 小時後，加甲醇定容成 2.0 mL，並置於–30℃冷凍櫃 儲存備用。
(2) 高效液相層析儀 (HPLC) 之分析條件
層析管柱：COSMOSIL 5C18-ARⅡ，5 µm，4.6×250 m.m 移動相：氰甲烷與 0.5% 磷酸 (36：64, v/v)
流速：1.0 mL/min 檢測波長：270 nm
內標準：Ethyl paraben (20.0 µg/mL in methanol) (3) 檢量線之繪製
精確稱取 baicalin、baicalein 及 wogonin 10.0 mg，以少量甲醇 溶之，再以甲醇定容至 10.0 mL 為貯存溶液 (1.0 mg/mL)。取適量 貯存溶液用甲醇稀釋，使各標準溶液濃度分別為 0.8、1.6、3.2、
6.3、12.5、25.0、50.0 及 100.0 µg/mL。取各標準溶液 200 µL 分別 加入等體積之內標準甲醇溶液 (ethyl paraben，20.0 µg/mL)。經 HPLC 分析所得之標準溶液波峰與內標準之波峰面積比值，與標 準溶液之各已知濃度進行線性迴歸，求得檢量線之方程式。
(4) 黃芩水煎劑中 baicalin、baicalein 與 wogonin 之定量
萃取之檢品解凍後，精取 300 µL 加甲醇 700 µL 振盪混合，經 9860 g 高速離心 15 分鐘，取 200 µL 上清液，加等體積之內標準 甲醇溶液 (ethyl paraben，20.0 µg/mL)，混合後經微孔濾膜 (0.45 µm) 過濾。取 20 µL 注入 HPLC 分析，以檢品中 baicalin、baicalein 及 wogonin 與內標準之波峰面積比值，分別代入 baicalin、baicalein 及 wogonin 檢量線之方程式，求出各檢品中 baicalin、baicalein 及 wogonin 之含量。
(5) 酸水解反應後 wogonin 之定量
酸水解反應之檢品解凍後，取上清液 100 µL 加甲醇 300 µL 振 盪混合，經 9860 g 高速離心 15 分鐘，取上清液 200 µL 加等體積 之內標準甲醇溶液 (ethyl paraben，20.0 µg/mL)，混合後經微孔濾 膜 (0.45 µm) 過濾，取 20 µL 注入 HPLC 分析，以檢品中 wogonin 與內標準之波峰面積比值，代入 wogonin 檢量線之方程式，求出 檢品中 wogonin 之含量。
經酸水解反應後，所得 wogonin 之總含量減去酸水解前 wogonin 之含量，計算而得 wogonoside 的含量。
(四) 動物、給藥及採血
(1) 動物
雄性 Sprague-Dawley 大白鼠 (體重介於 300 ~ 450 g，出生 8 ~ 12 週)。購自國科會動物中心，飼養於中國醫藥大學動物中心。
(2) 給藥
實驗前禁食 12 小時，實驗設計採平行試驗模式。口服投藥將大 白鼠隨機分成五組，第一組及第二組以胃管投予 MTX (5 mg/kg) 並 分別併服相當於 2.0 g/kg 及 1.0 g/kg 之大黃水煎劑，第三組及第四 組以胃管投予 MTX (5 mg/kg) 並分別併服相當於 2.0 g/kg 及 1.0 g/kg 之黃芩水煎劑，第五組投予 MTX (5 mg/kg) 併服與水煎劑等體 積的水。靜脈注射將大白鼠隨機分成三組，第一組尾靜脈注射 MTX (1 mg/kg) 口服併服相當於 2.0 g/kg 之大黃水煎劑，第二組尾靜脈注 射 MTX (1 mg/kg) 口服併服相當於 2.0 g/kg 之黃芩水煎劑，第三組 投予 MTX (1 mg/kg) 併服與水煎劑等體積的水。
(3) 採血
口服投藥後於 15、30、60、120、240、480、720、1440、2160 和 2880 分鐘，以心臟穿刺採血。靜脈注射於 5、15、30、45、60、
90、120、180、240 及 300 分鐘採血。每次採血量為 0.4 mL，將血
液檢品置於微量離心管，高速離心 (9860 g) 15 分鐘，貯存於 -30
℃，俟 後分析。
（五）血清中 MTX 之定量
利 用 TDx Analyzer 以 螢 光 偏 極 免 疫 分 析 法 (Fluorescence Polarization Immunoassay, FPIA) 定量血液中 MTX 濃度。
檢量線之繪製：取濃度分別為 0、0.05、0.15、0.30、0.60 及 1.00 µmol/L 之血清標準溶液 (TDx MTX monoclonal serum reagent) 各 80 µL，利用 MTX kit 以 TDx analyzer 分析，自動繪製檢量線。
血清檢品以 MTX kit 分析後，自動代入檢量線換算，獲得 MTX 濃度。檢量線範圍為 0.00-1.00 µmol/L；偵測極限為 0.02 µmol/L。
（六）數據處理及統計分析
利用電腦程式 WINNONLIN 之非室體模式 (noncompartment model) 計算動力學參數，並以 ANOVA – Scheffe 分析單服 MTX 與 併服大黃、黃芩組之組間差異 (p < 0.05)。
