國立台東大學生命科學系碩士論文 Department of Life Science National Taitung University Master Thesis

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國立台東大學生命科學系碩士論文

Department of Life Science National Taitung University Master Thesis

指導教授:李俊霖博士 Advisor: Chun-Lin Lee, Ph.D.

深層海水及其主要離子對紅麴山藥代謝物生成及抑制 3T3-L1 前脂肪細胞增生、分化與脂滴形成之影響 Effect of Deep Ocean Water and Its Major Ions on the

Metabolites Formation and Inhibition of 3T3-L1 Preadipocytes Proliferation, Differentiation and

Adipogenesis of Red Mold Dioscorea

研究生:龍姿縈 Student: Tzu-Ying Lung

中華民國 101 年 7 月

July, 2012

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謝誌

這本論文終於在艱辛的日子裡完成了。這一路以來首先我要感謝指導老師李俊霖李爸爸的收留，當初誤打誤撞的想要讀喜歡的科系，終於在推徵時進入這個領域，而當時面談時老師說知道細胞膜在哪就可以了，就這樣開始我的碩士兩年生活，但是路途中很多不懂的地方老師都會很有耐心地教懂我，還有佛心的師母都會不時對我們伸出援手替我們解圍，真的很謝謝你們夫妻的照顧。

接著我要感謝遠從北部台大微生物與生化學所教授潘子明博士、輔仁大學蔡宗佑博士及南部輔英科技大學王志傑博士的口委們專程來到台東幫我口考，給了我很多專業上的指導及知識，使我的論文可以更加完整，真的感念在心。

而碩班的日子裡，我要感謝一起奮鬥的同班同學們，大家的喧鬧聲是最棒的。

重頭戲來了，實驗室的兩年生活中，我要感謝帶我入門的貢丸學姊，因為學姊一開始就把所有的實驗都教會我，讓我在這兩年裡實驗都很順手，並且有任何問題提出疑問學姊都會詳細的教我，真的很謝謝妳的幫助；還有在遠方的聖恩學姊，

一進入實驗室學姊就有講了很多該如何做實驗的事情以及一點入門守則，對我很有幫助，謝謝妳的幫助；還有坐在我旁邊很久會一起瞎鬧的佳燕學姊，很多時候其實我沒有開口，但是學姊都會適時的關心並且教我很多事情，還替我物色對象，

真的很好笑，不過很感謝妳在這路上幫了我很多忙，妳要幸福喔!還有帥郭的熱心幫助，多謝你的唸功，讓我越來越能夠變堅強，希望你當兵順利喔!還有軒佑學長教我使用儀器，讓我能在短時間內學會儀器的使用，祝你可以事事順心喔!

接下來我要感謝我的恩人楊咩，從一開始到最後一路走來，我真的很感謝妳，有妳的細心以及熱心幫助真的讓我在這路上真的超級感動，一直以來有妳的句句叮嚀讓我可以注意更多事情，這條路也因為有妳，讓我感到超大心的，最愛妳了，

妳要加油喔!還有佩穎跟小人，謝謝你們兩個在我碩一的時候衝了很多地方，接下來你們要加油喔!而跟我一起努力拚碩士學位的佩穎，努力了那麼久終於拿到妳想要的學位，未來的路上妳要加油而且要幸福喔!另外，謝謝小人如同後母般的言詞犀利對待我，使我在講話功力上面進步了不少，未來加油!還有喬巴愛好者嘉麒，雖然我們很晚才熟，但謝謝你在我準備口考的時候很大心的幫了我很多忙，並且一直不斷在搞笑，謝謝你，加油嘿!還有一起打羽球的孟宣、聰明的阿飄，你們真的很厲害，有你們的幫助以及關心讓我很感動，有機會再一起打羽球吼!我的大師妹麗雅，雖然妳很多時候都常常出好笑的事情，但是還是不放棄的認命做下去，祝福妳可以考上好學校並且很幸福喔!另外筱仙真的很搞笑外加失控，但是妳不放棄加上不服輸的個性非常厲害，欣賞妳的精神，妳要繼續保持這種精神衝刺，考上好學校喔!很謝謝妳們兩個一路上的搞笑作伴，增添了很多細胞房裡好笑的回憶，一起在操作台的日子我會懷念的，妳們兩個要加油喔!還有跟我一起網拍的昭如、拼命的宇平、好笑的丁丁、愛欺負我的叡耆、好笑的加力、

愛做實驗的舒卉、認真的復華、逸蓉、鳥哥…等，實驗的路雖然不好走，但是大家要加油喔!還有系辦小姐小銘，謝謝妳在我手忙腳亂之時，幫我處理離校的手

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續，謝謝妳，也加油喔!

還有最感動的是一路上在後面支持我的家人，還好有我溫暖的家人，在我實驗不順或是常常熬夜的日子裡，時時都讓我感覺很溫暖，因為有你們的溫暖，讓我在難過的時候可以飛奔回你們的懷抱，我最愛你們了!另外還有對我最好的小象、認命的阿爸、瘋瘋的小柚、搞笑的腋毛弟、貼心的小花、長不大的番薯、悶燒的郡主、愛籃球的宜涵、搞怪的語之以及傻傻的魚板，一路上大家一起瘋癲的日子真的很好玩，以後我會懷念常常玩到嗨翻天的日子的，大家都要加油!

還有我的姊妹們，冷血兒倩、瘋子村姑、瀟灑的魚、色老伯、淡定阿雞，在我拼命的日子裡，有你們的大心陪伴以及為了我除夕夜移到我實驗室陪我聊天的日子，真的很開心有妳們一路上的陪伴，我們的心都是緊緊在一起的，愛妳們喔!

另外還有小分、芸函、蔡胖跟黑人，大家一起瘋的日子沒有因為各自的忙碌而忽略，謝謝你們一路上陪我走過來這段安排時間瘋的日子，大家都要加油喔!最後我也要特別感謝沒多久前從褓姆升級為男友的軒丞，謝謝你一路上的貼心照顧和鼓勵，還為了陪我而熬夜生病，謝謝你讓我在拼命地趕論文時不用再多擔心很多生活上的瑣碎事情，而接著換你開始水深火熱了，要記得加油喔!

這兩年有大家的一路幫助，讓我可以如期的畢業，真的很謝謝你們大家，大家都要加油喔!

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I

中文摘要

深層海水 (Deep Ocean Water, DOW) 中富含豐富的無機鹽與微量元素 (Ca²⁺、Mg²⁺、PO42- 等離子) 有促進酵母菌生長和麴菌的活性功能。在過去文獻中發現，以深層海水發酵之紅麴山藥中 (red mold dioscorea cultured using deep ocean water, DOW-RMD) 含有的次級代謝物黃色素 monascin (MS) 與 ankaflavin (AK) 之含量，其具有較佳降低體脂肪之效果。本實驗是比較以超純水發酵之紅麴山藥 (RMD cultured using ultrapure water, UPW-RMD)、DOW-RMD、

合成水發酵之紅麴山藥 (RMD cultured using synthetic water, SW-RMD)、DOW 及 SW 對抑制 3T3-L1 前脂肪細胞增生及分化之機制差異，也另外加以探討 DOW 其中之何種離子可促使 MS 與 AK 提升，再以反應曲面法 (response surface methodology, RSM) 進行最適條件探討。研究結果顯示，DOW-RMD 具有較 SW-RMD 高量的 MS、AK 及低量的 citrinin (CT)。另外，以不同濃度之單一離子 (Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺、Zn²⁺ 與 Fe²⁺) 進行固態發酵試驗，結果顯示，分別添加與 DOW 中相同濃度之單一離子可使 MS、AK 生成量有明顯增加之趨勢，並使 CT 生成量有減少之趨勢。而以體外細胞試驗探討 DOW 與 DOW-RMD 對 3T3-L1 前脂肪細胞增生分化之影響，發現 DOW-RMD 具有較佳抑制增生之能力、脂滴之累積、關鍵轉錄因子 (PPARγ 及 C/EBPα) 之表現量及胞外脂蛋白脂解酶 (lipoprotein lipase, LPL) 活性，並且能提升胞內脂解率。而 RSM-RMD 能顯著提升 MS 與 AK 生成量，另外，也可有效抑制 3T3-L1 細胞增生、減少分化中脂滴之累積及成熟脂肪細胞脂滴之形成能力。綜合上述結果證實 DOW-RMD 能有效減少脂肪細胞累積。

關鍵字:深層海水、合成水、離子、紅麴山藥、3T3-L1 前脂肪細胞、體脂肪

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II

Abstract

The deep ocean water (DOW) contains rich metals and trace elements (Ca²⁺, Mg²⁺, PO42-

, etc.) promoting the yeast growth or functional activity of Aspergillus.

The recent studies showed that red mold dioscorea cultured using deep ocean water (DOW-RMD) had more secondary metabolites, monascin (MS) and ankaflavin (AK) which were prover at the functional ingredients of hypolipidemic and body fat-lowering effect. In this study, we compared the effect of RMD cultured using ultrapure water (UPW-RMD), DOW-RMD, RMD cultured using synthetic water (SW-RMD), DOW, and SW on the inhibition of 3T3-L1 preadipocytes proliferation, differentiation and adipogenesis as well as the modulation mechanism. We also explored functional ions in the DOW for increasing the concentration of MS and AK.

In addition, the optimal condition of the response surface methodology (RSM) was explored. The results show that DOW-RMD had more production of MS and AK, and less production of citrinin (CT) than UPW-RMD. We used different concentrations of ions (Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺、Zn²⁺ and Fe²⁺) to culture Monascus under solid state fermentation. The results showed single ion at an equal concentration in the DOW, significantly increased the production of MS and AK and decreased the production of CT. Regarding the effect of DOW and DOW-RMD on 3T3-L1 preadipocytes proliferation and differentiation. DOW-RMD had better ability to inhibit the proliferation, accumulate ion of the lipid droplets, key transcription factors (PPARγ and C/EBPα) expression and extracellular lipoprotein lipase (LPL) activity, and enhance the rate of intracellular lipolysis. The RSM-RMD significantly enhanced the formation of MS and AK. Additionally, it also inhibited 3T3-L1 cell proliferation, reduced of lipid droplet accumulation and lipid droplets formation in adipocytes.

Those results demonstrated DOW-RMD was effective to reduce adipocytes.

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III

Keyword: deep ocean water, synthetic water, ions, red mold dioscorea, 3T3-L1 preadipocytes, body fat

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IV

縮寫表

ACEI (angiotensin converting enzyme inhibitor)：血管張力素轉換酶抑制劑 α-ARs (α-asrenoceptors)：α-腎上腺素受體

β-ARs (β-asrenoceptors)：β-腎上腺素受體

ALBP (adipocyte lipid binding proteins)：脂肪細胞脂質結合蛋白質 BAT (brown adipose tissue)：棕色脂肪組織

BMI (body mass index)：身體質量指數

cAMP (Cyclic adenosine monophosphate)：環磷酸腺苷

C/EBPα (CCAAT/ enhancer-binding protein α)：增強子結合蛋白質 α C/EBPβ (CCAAT/ enhancer-binding protein β)：增強子結合蛋白質 β C/EBPδ (CCAAT/ enhancer-binding protein δ)：增強子結合蛋白質 δ DG (diacylglycerol)：甘油二酯

DEX (dexamethasone)：地塞米松

DMBA (7,12-Dimethylbenzanthracene)：7,12-二甲基苯蒽

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)：Dulbecco's 改良最低必需培養液 DMSO (Dimethyl sulfoxide)：二甲基亞碸

DOW (deep ocean water)：深層海水

DOW-RMD (red mold dioscorea cultured using deep ocean water)：深層海水培養之紅麴山藥

DPPH (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl)：1,1-二苯基苦基苯肼 ERK (extracellular signal regulated kinase)：細胞外信號調節激酶 FBS (fetal bovine serum)：胎牛血清

FFA (free fatty acid)：自由脂肪酸

GABA (γ-amino butyric acid)：γ-胺基丁酸 GAD (glutamate decarboxylase)：谷胺酸脫羧酶

HPLC (high-performance liquid chromatography)：高效液相層析

HR-LPL (heparin-releasable lipoprotein lipase)：肝素釋放脂蛋白脂解酶 HSPG (heparan sulfate proteoglycan)：肝素硫酸糖蛋白

IBMX (isobutylmethylxanthine)：甲基異丁基黃嘌呤

IOTF (International Obesity Task Force)：國際肥胖任務小組 KRB (Krebs Ringer bicarbonate)：Krebs-Ringer 重碳酸鹽溶液 L-Gln (L-glutamine)：麩胺酸

LPL (lipoprotein lipase)：脂蛋白脂解酶

MAPK (Mitogen-activated protein kinases)：絲裂原活化蛋白激酶 PDE (phosphordiesterase)：磷酸二脂酶

PKA (protein kinase A)：蛋白激酶 A

PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ)：過氧化體增生劑活化受體 γ

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V

RMD (red mold dioscorea)：紅麴山藥 RMR (red mold rice)：紅麴米

RSM (response surface methodology)：反應曲面法

RSM-RMD (red mold dioscorea cultured using response surface methodology)：以反應曲面法最適條件培養之紅麴山藥

SW (synthetic water)：合成水

SW-RMD (red mold dioscorea cultured using synthetic water)：合成水培養之紅麴山藥

TG (triglyceride)：三酸甘油酯

TNF-α (tumor necrosis factor-α)：腫瘤壞死因子-α

TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)：12-鄰-四葵酸佛波醇-13-乙酸 UPW (ultrapure water)：超純水

UPW-RMD (red mold dioscorea cultured using ultrapure water)：超純水培養之紅麴山藥

WAT (white adipose tissue)：白色脂肪組織

WHO (World Heawlth Organization)：世界衛生組織

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VI

表目錄

表 1 深層海水之功能與應用產品………..……17

表 2 深層海水之營養元素及其功能………..……19

表 3 紅麴次級代謝產物在預防醫學應用上的發展……….….23

表 4 深層海水之離子組成……….….36

表 5 三變數-三階層反應曲面設計之操作條件變數及階層……….……37

表 6 固態發酵之三因子-三階層之中心旋轉組合設計……….…38

表 7 一級抗體與二級抗體所使用之稀釋比例……….….42

表 8 超純水、深層海水與合成水對紅麴山藥之 MS、AK 及 CT 生成量之影響………...………..….…………52

表 9 超純水、深層海水與合成水對紅麴山藥之紅色素及橘色素生成變化量之影響………..………54

表 10 比較深層海水發酵之紅麴山藥及超純水發酵之紅麴山藥中 Mg²⁺ 及 Ca²⁺ 之含量及比例………...………….56

表 11 以不同離子水培養紅麴山藥中紅色素及橘色素生成變化量之影響…….65

表 12 三變數三階層反應曲面實驗結果………..…..88

表 13 反應曲面試驗設計之變異數分析………...89

表 14 以最適條件培養之 RMD 中 MS、AK 及 CT 含量……….96

表 15 發酵實驗結果綜合比較……….…….…..108

表 16 細胞實驗結果綜合比較……….……..….111

表 17 以 RSM 條件培養之 RMD 於紅麴菌代謝物生成及對 3T3-L1 細胞調控之綜合結果分析……….………...113

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VIII

圖目錄

圖 1 分化後 3T3-L1 前脂肪細胞之油紅染色圖………7

圖 2 脂肪細胞之多效性功能………8

圖 3 3T3-L1 前脂肪細胞藉由 C/EBPs 與 PPARγ 分化的模式………..9

圖 4 3T3-L1 前脂肪細胞分化過程………10

圖 5 磷酸二酯酶 (phosphordiesterase, PDE) 路徑調控脂解作用…………...…14

圖 6 深層海水分佈圖………...…...…16

圖 7 紅麴菌之生活史………...……...21

圖 8 八種紅麴色素之結構………...…...…24

圖 9 實驗架構………...………...29

圖 10 MS 之 HPLC 檢量線………..……...……….46

圖 11 AK 之 HPLC 檢量線………...47

圖 12 CT 之 HPLC 檢量線………..…………...48

圖 13 UPW-RMD 及 DOW-RMD 中 MS 生成變化……….……....49

圖 14 UPW-RMD 及 DOW-RMD 中 AK 生成變化………...………50

圖 15 UPW-RMD 及 DOW-RMD 中 CT 生成變化…………...…………...…51

圖 16 紅麴次級代謝物之紫外光全波長吸收波峰圖譜 ………..…53

圖 17 不同濃度 Mg²⁺對紅麴山藥中 MS、AK 與 CT 含量之影響………….57

圖 18 不同濃度 Ca²⁺對紅麴山藥中 MS、AK 與 CT 含量之影響…………...58

圖 19 不同濃度 K⁺ 對紅麴山藥中 MS、AK 與 CT 含量之影響………60

圖 20 不同濃度 Na⁺對紅麴山藥中 MS、AK 與 CT 含量之影響………61

圖 21 不同濃度 Zn²⁺對紅麴山藥中 MS、AK 與 CT 含量之影響……..….…62

圖 22 不同濃度 Fe²⁺對紅麴山藥中 MS、AK 與 CT 含量之影響……..….…63

圖 23 以不同離子水培養紅麴山藥中次級代謝物之 HPLC-PDA 之紫外光全波長吸收波峰圖譜………..…64

圖 24 不同發酵物質對 3T3-L1 前脂肪細胞增生之影響………....67

圖 25 不同濃度之 DOW 與 SW 對 3T3-L1 前脂肪細胞增生之影響………68

圖 26 以不同水分培養之紅麴山藥乙醇萃取物對 3T3-L1 前脂肪細胞分化第 9 天油紅染色圖之影響 ..………..……69

圖 27 以不同濃度之 DOW 與 SW 對 3T3-L1 前脂肪細胞分化第 9 天油紅染色圖之影響………..………71

圖 28 不同水分發酵之紅麴山藥對誘導分化第 2 天之 3T3-L1 前脂肪細胞轉錄因子 C/EBPβ 蛋白質表現之影響………...………..…72

圖 29 不同濃度之 DOW 與 SW 對誘導分化第 2 天之 3T3-L1 前脂肪細胞轉錄因子 C/EBPβ 蛋白質表現之影響………73

圖 30 不同水分發酵之紅麴山藥對誘導分化第 6 天之 3T3-L1 前脂肪細胞轉錄因子 PPARγ 蛋白質表現之影響………..……….…….…75

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IX

圖 31 不同濃度之 DOW 與 SW 對誘導分化第 6 天之 3T3-L1 前脂肪細胞轉錄因子 PPARγ 蛋白質表現之影響………..….76

圖 32 不同水分發酵之紅麴山藥對誘導分化第 6 天之 3T3-L1 前脂肪細胞轉錄因子 C/EBPα 蛋白質表現之影響………..…...77

圖 33 不同濃度之 DOW 與 SW 對誘導分化第 6 天之 3T3-L1 前脂肪細胞轉錄因子 C/EBPα 蛋白質表現之影響………...78

圖 34 不同發酵物質對 3T3-L1 成熟脂肪細胞存活率之影響………80 圖 35 不同濃度之 DOW 與 SW 對 3T3-L1 成熟脂肪細胞存活率之影響…81 圖 36 不同發酵物質對 3T3-L1 脂肪細胞脂解作用之影響………82 圖 37 不同濃度之 DOW 與 SW 對 3T3-L1 脂肪細胞脂解作用之影響……83 圖 38 不同發酵物質對 3T3-L1 脂肪細胞 heparin-releasable LPL 活性之影響………..85

圖 39 不同濃度之 DOW 與 SW 對 3T3-L1 脂肪細胞 heparin-releasable LPL 活性之影響………..…86

圖 40 Mg^{2 +}、Zn^{2 +} 濃度與深層海水比例對紅麴次級代謝物 MS 之反應曲面………..…91

圖 41 Mg^{2 +}、Zn^{2 +} 濃度與深層海水比例對紅麴次級代謝物 AK 之反應曲面圖………..……92

圖 42 Mg^{2 +}、Zn^{2 +} 濃度與深層海水比例對紅麴次級代謝物 CT 之反應曲面圖………..…93

圖 4 3 M g^{2 +} 濃度與深層海水比例對紅麴次級代謝物 M S 、 A K 與 CT 生成量之等高線交疊圖 (Zn²⁺濃度為 0.095 μg/mL) …..………….………...95

圖 44 最適條件培養之 RMD 對 3T3-L1 前脂肪細胞增生之影響…….….….97

圖 45 最適條件培養之 RMD 對 3T3-L1 前脂肪細胞分化第 9 天油紅染色圖之影響………..98

圖 46 最適培養條件之 RMD 對誘導分化第 2 天之 3T3-L1 前脂肪細胞轉錄因子 C/EBPβ 蛋白質表現之影響………..…..………….100 圖 47 最適培養條件之 RMD 對誘導分化第 6 天之 3T3-L1 前脂肪細胞轉錄因子 PPARγ 蛋白質表現之影響………….………..………....…101 圖 48 最適培養條件之 RMD 對誘導分化第 6 天之 3T3-L1 前脂肪細胞轉錄因子 C/EBPα 蛋白質表現之影響……….………...…...102 圖 49 最適條件培養之 RMD 對 3T3-L1 成熟脂肪細胞存活率之影響……103 圖 50 最適條件培養之 RMD 對 3T3-L1 脂肪細胞脂解作用之影響……….104

圖 51 最適條件培養之 RMD 對 3T3-L1 脂肪細胞 heparin-releasable LPL 活性之影響……….…………105

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1

前言

近年來由於國人的生活品質提升，以及速食業的蓬勃發

展，使國人在選擇飲食上面有很大的改變，進而導致高熱量飲食所造成的肥胖與慢性疾病的發生率增加。根據行政院衛生署統計資料顯示，國人在 2010 年的十大死因中，發現排名第二、三位的心血管疾病、第五位的糖尿病及第九位的高血壓皆屬於肥胖可能造成之疾病 (行政院衛生署，2011)。而肥胖是由於不正常或過度的脂肪累積，其中飲食因素會使脂肪細胞增生和脂肪細胞肥大最終進而導致肥胖 (Herberg et al., 1974)。其造成肥胖的成因很多，包含遺傳、生活型態、

疾病用藥等，造成體內能量的不恆定，熱量的攝取與消耗的不平衡。目前研究最新探討的深層海水 (Deep Ocean Water, DOW)，具有低溫性、穩定性、豐富營養鹽以及微量元素等特性 (Hwang et al., 2009)。其礦物元素具有預防骨質疏鬆症、

減緩糖尿病、降低高血壓、抑制中性脂肪膽固醇上升、防止

老化與改善體質、皮膚炎等療效作用 (王等，2003)。在豐富

營養鹽中，其鎂、鈣與磷酸鹽離子具促進麴菌的活性功能 (蘇

等，2005)。研究指出鎂及鈣離子之比例可以減少心血管疾病

的產生 (Kousa et al., 2006)。而深層海水可促進紅麴菌

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(Monascus species) 的生長及大量提升 monascin (MS) 與 ankaflavin (AK) 之生成量 (Lee et al., 2011)。更有研究指出藉由深層海水可以調降脂肪轉錄基因的表現量以達到抑制脂肪細胞的分化 (Hwang et al., 2009)。

紅麴菌為重要的傳統食品添加物，其產生一級代謝物醇

、酸、酯等芳香物，是釀造食品的絕佳選擇 (蘇，1970)。近年來更發現次級代謝物所含有的色素也有很大的探討發展空間。之前學者研究指出以山藥作為紅麴固態發酵基質，可使黃色素 MS 提升，證實具有抗發炎的功效 (Lee et al., 2006)。接著發現紅麴山藥 (red mold dioscorea, RMD) 可改善高油脂飲食所引起之體脂堆積、高血脂及高血胰島素之症狀 (Chen et al., 2008)。也有研究顯示，黃色素 MS 及 AK 在抑制前脂肪分化、促進成熟細胞分解胞內脂質釋出甘油、降低成熟脂肪內肝素釋放脂蛋白脂解酶 (heparin-releasable lipoprotein lipase, HR-LPL) 的活性、降低胞內三酸甘油酯 (triglyceride, TG) 之合成及累積有很好的效果 (Jou et al., 2010)。

根據前人以深層海水發酵之紅麴山藥進行降低體脂肪

及血脂肪之試驗結果發現，以深層海水發酵之紅麴山藥

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3

(RMD cultured using DOW, DOW-RMD) 之二次代謝物黃色素中的功效成分 MS 與 AK 具有較佳降低體脂肪之效果 (龔，2010)。本研究比較 DOW-RMD 及超純水發酵之紅麴山藥 (RMD cultured using ultra-pure water, UPW-RMD) 對抑制 3T3-L1 前脂肪細胞增生及分化之影響。並以不同濃度之深層海水主要離子進行紅麴山藥固態發酵，探討影響深層海水中的 Mg

²⁺

、Ca

²⁺

、K

⁺

、Na

⁺

、Fe

²⁺

與 Zn

²⁺

對 MS、AK 及肝腎毒素 citrinin (CT) 生成之影響，進而篩選出重要離子以反應曲面法提升功能性代謝物並增加對細胞增生、分化及脂滴生成之抑制效果之影響。

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第一章文獻回顧第一節肥胖

由於生活便利、產品開發迅速，使得人類可以在生活忙碌的步調中，以最短時間獲取非常多的資源。根據台灣十大死因排行中，發現癌症、腦血管疾病、心臟疾病及糖尿病都與肥胖有很大的關聯性，其中最常見的肥胖問題已成為目前導致代謝疾病發生率增加的元凶之一，顯示現今台灣對於降低體脂肪是非常重要且必要的一件大事。而肥胖大致可分為二大類：第一類為肥胖直接引起的疾病，像是造成的心理障礙、睡眠中止症及關節炎等，第二類為肥胖所導致代謝疾而所引發的疾病，像是心血管疾病、高血壓、糖尿病、膽囊疾病及癌症 (Bray, 2004)。

肥胖已成為非常重要的健康問題，如何降低體脂肪是大家所關注的議題。

一、肥胖之定義

主要指過多的脂肪組織累積或是高熱量的攝取量增加而導致體重增加，進而造成肥胖使身體產生疾病。而世界衛生組織 (World Health Organization, WHO) 所界定肥胖的標準是以身體質量指數 (body mass index, BMI) 為準，公式如下：

BMI = 體重 (kg) / 身高平方 (m²)

由 BMI 值得之，如果超過 25 以上為過重，一旦超過 30 以上則為肥胖。

另外，國際肥胖任務小組 (International Obesity Taskforce, IOTF) 在亞太地區提出以日本人之資料作依據，建議以女性腰圍 80 公分，男性腰圍 90 公分做為中央肥胖的切點，顯示中央 (腰腹部) 肥胖與各種肥胖相關代謝疾病之關係更為密切

。而根據衛生署調查發現，在國內 BMI 值 27 以上之成人中就有大約 85% 以上與肥胖之代謝症疾病相關。而將國人過重之切點訂在 BMI 值為 24 以上，肥胖之切點訂在 BMI 值為 27 以上。因此，在 24 ≦ BMI ＜ 27 為過重，又 27

≦ BMI ＜30 為輕度肥胖，而 30 ≦ BM I＜ 35 為中度肥胖，最後 BMI ≧ 35 為重度肥胖。以此數值訂為國人中央肥胖之切點，是根據國人 BMI 27 之成人之平均腰圍亦為女性 80 公分、男性 90 公分，因此建議之。各種代謝疾病的風險性隨著腰圍過大而有所提高，所以腰圍過大之中央肥胖定義可和 BMI 過高同時使用 (行政院衛生署，2002)。

二、肥胖之成因

肥胖發生主要是攝取量超過能量的消耗率。而可能造成肥胖的成因有很多種

，像是飲食及生活習慣、運動量少與疾病用藥等環境因素，或是遺傳因子與心理壓力因素都皆會致使肥胖產生。但目前主要還是以飲食及生活習慣為最主要造成現代人肥胖的問題。

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肥胖被認為是從增加脂肪細胞數量或個別脂肪細胞的大小而導致疾病產生，

而脂肪細胞則是由前脂肪細胞增生並分化為成熟脂肪細胞，在肥胖的發展史上脂肪細胞的生成作用扮演著關鍵角色 (Marcos et al., 2001)。

三、肥胖與代謝症候群 (metabolic syndromes)

在很多先進開發中國家已發現，肥胖、高血壓、高血脂、糖尿病及心臟疾病等代謝症候群的發生率有日益提升的趨勢。有學者發現肥胖、胰島素阻抗、高血壓、高尿酸症與血脂異常等危險因子皆不是獨立發生，而是在同一人身上可能會同時存在有兩種以上代謝異常之症狀 (Reaven, 1988)。

第二節脂肪細胞

所有的脊椎動物脂肪組織中，對於能量儲存、脂肪代謝、組織周圍保護與細 胞激素等扮演著很重要的角色。脂肪組織有兩種，一種為白色脂肪組織 (white adipose tissue, WAT)，在細胞內 WAT 佔了 80%，其主要功能為能量的儲存及貯存大型油滴，可調控神經與內分泌的運作，以調節脂肪釋出或貯存，故 WAT 可做為肥胖的指標。另一種為棕色脂肪組織 (brown adipose tissue, BAT)，在動物體中則呈現褐色狀態佔細胞內 20%，其貯存多量的小型油滴，細胞核呈橢圓型並有粒線體存在，此類脂肪細胞是以熱能形式釋放熱量，提供動物體溫及熱量之 所需，主要存在於皮下組織、心臟、腎臟及內部等器官 (Sell et al., 2004)。而白 色脂肪組織超過所規定的堆積，可視為導致脂肪細胞增生及大量分化轉變為成熟細胞 (Liu et al., 2008)。另外，白色脂肪是一個特殊的內分泌器官，為調節生物體能量平衡的重要組成部分，也在生理和病理過程發揮重要作用 (Feige and Auwerx, 2007)。

一、前脂肪細胞之介紹

目前在體外試驗當中，主要以 3T3-L1 前脂肪細胞來探討脂肪細胞分化及其分子機制問題。而 3T3-L1 前脂肪細胞為研究前脂肪細胞分化為脂肪細胞中典型之肥胖的細胞代表且應用最廣泛之細胞株 (Ntambi and Kim, 2000)，而前脂肪細胞分化成脂肪細胞後會產生三酸甘油酯之堆積。前脂肪細胞在分化之過程中會使 CCAAT/ enhancer-binding proteinα (C/EBPα) 、 peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) 基因表現大幅增加 (Rosen et al., 2002)，藉由絲裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinases, MAPK) 路徑調節 C/EBPα 和 PPARγ 的 mRNA 表現量，進而抑制 3T3-L1 前脂肪細胞分化成脂肪細胞 (Prusty et al., 2002)。

二、脂肪細胞之分化

前脂肪細胞在良好的培養下會不斷的進行細胞分裂，然而前脂肪細胞卻不具

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有成熟脂肪細胞之生理功能，必須經過分化階段才能轉變為成熟的脂肪細胞 (圖 1)，而近年來也發現脂肪細胞能夠分泌很多種的物質，所引起其他的生理效應 (圖 2)。分化為經由多個轉錄因子調控基因表現之過程，使這些基因轉化成不同的形態及功能 (Morrison and Farmer, 1999)。

分化前細胞首先要達到接觸抑制 (contact inhibition)，生長至互相接觸時會停止增殖，達到生長停滯 (growth arrest)。而當細胞全部長滿之後，則可藉由添加激素誘導細胞進行分化。以 3T3-L1 前脂肪細胞為例子，其進行分化時所需胰島素 (insulin) 、糖皮質素 (glucocorticoids) 與能夠增加細胞中環磷酸腺苷 (Cyclic adenosine monophosphate, cAMP) 之物質。在細胞試驗上所用之皮質素為 dexamethasone (DEX)，為一種合成皮質素，能刺激 glucocorticoid 傳遞訊息路徑，

而 isobutylmethylxanthine (IBMX) 是 cAMP-phosphodiesterase 的抑制劑，它可以抑制 cAMP 水解，insulin 可刺激使細胞快速累積 TG 轉換為成熟脂肪細胞。

在分化劑的誘導下，達到生長停滯的細胞會再行細胞分裂，這步驟稱之為克隆擴增 (clonal expansion)，可使分化相關轉錄因子結合至目標基因調控位置，而後再次進入生長停滯，此時的生長停滯稱為 GD，當正式進入分化階段時，成熟的脂肪細胞特徵會越來越明顯。從外觀型態上面可觀察到細胞由纖維狀轉變為圓形，

並且可於胞內觀察到油滴的累積 (Cornelius et al., 1994；Ntambi and Kim, 2000)。

當細胞分化時加入分化劑後，會使 c-fos、c-jun、c-myc 短暫的表現，此三種因子與細胞分裂有密切的關聯。接著 C/ EBPβ、C/ EBPδ 因子分別受 DEX 及 IBMX 誘導調控會先表現。而 C/EBPβ、C/EBPδ 會誘導 PPARγ 表現。另外 C/

EBPβ、C/ EBPδ 也會誘導 C/ EBPα 的表現，其中 PPARγ 與 C/ EBPα 之間有正向回饋作用，不但促使彼此表現增加外，還大量活化下游脂肪細胞目標基因的表現量 (圖 3)，在誘導分化後第八天會超過 90％的脂肪細胞已經成熟 (Huang and Donald, 2007)。當分化過程開始，其中的重要轉錄因子將會持續表現出來，

而 C/ EBPα 與 PPARγ 啟動後會活化許多脂肪細胞特異性基因的表現，且會在分化後維持成熟脂肪細胞的性狀 (圖 4) (Ntambi and Kim, 2000； Morrison and Farmer, 1999; Cowherd et al., 1999)。

三、分化之主要調節轉錄因子

PPARs 是屬於核激素受體 (nuclear hormone receptor) 超級家族之轉錄因子，此家族之成員必須與另一核激素受體形成複合體，並且與配體結合後才具轉錄活性。目前已知三種 PPAR 家族成員 (PPARα、γ、δ) 皆是結合至過氧化體增殖物反應元件 (peroxisome proliferators response element)，主要在脂質堆積與脂質代謝調控上扮演重要角色，其中又以 PPARγ 是 PPAR 家族中專一表現於脂肪組織，並且已知 PPARγ 具有控制發炎反應、調控細胞分裂與分化等功能，在脂肪組織發展上扮演重要角色 (Berger and Moller, 2002)。而 PPARγ 根據轉錄起始位置不同及選擇性切割 (alternative splicing) 可分成 PPARγ1 及 PPARγ2，其中PPARγ1 在脂肪細胞中含量較低，主要表現於巨噬細胞、結腸表

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圖 1、分化後 3T3-L1 前脂肪細胞之油紅染色圖。

Fig. 1. Oil red O staining of differential 3T3-L1 preadipocytes.

(Oleg et al., 1997)

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圖 2、脂肪細胞之多效性功能。

Fig. 2. Pleiotropic functions of the adipocyte.

(Morrison and Farmer, 1999)

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圖 3、3T3-L1 前脂肪細胞藉由 C/EBPs 與 PPARγ 分化的模式。

Fig. 3. Mechanism of the differentiation of 3T3-L1 preadipoctes by C/EBPs and PPARγ regulation.

(Huang and Donald, 2007)

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圖 4、3T3-L1 前脂肪細胞分化過程。

Fig. 4. Progression of 3T3-L1 preadipocyte differentiation.

(Ntambi and Kim, 2000)

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皮細胞、膀胱、胸部及攝護腺等，而 PPARγ2 主要存在於脂肪細胞，調節脂肪細胞特異性基因之表現 (Rosen et al., 2002; Morrison and Farmer, 1999)。

C/EBPs 是屬於鹼性-白胺酸拉鍊 (basic leucine zipper) 家族之轉錄因子，此家族之成員可互相結合形成同質雙複合體 (homodimers) 或異質雙複合體 (heterodimers) 表現轉錄活性。C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ 存在於白色及褐色脂肪細胞中，對脂肪細胞之發育相當重要。當 C/EBPβ 與 C/EBPδ 表現時，可引起一連串轉錄因子基因表現 (Tang and Lane, 1999)，進而使 C/EBPα 活化促進下游含有 C/EBP 結合位置的基因之表現 (Hemati et al., 1997)。

第三節成熟脂肪細胞中脂滴分解與儲存之調控

當分化完全為成熟脂肪細胞時，其具有分解及儲存 TG 之能力，這些代謝作用在細胞中受到荷爾蒙的調控，因此其中之平衡決定了脂肪細胞體積大小。

一、脂蛋白脂解酶 (lipoprotein lipase, LPL)

對脂肪細胞來講，LPL 是儲存脂肪之關鍵酵素 (Frayn et al., 1995)，而脂肪細胞進行脂質合成，大部分是由於循環系統提供脂肪酸作為合成 TG 之來源。

二、 LPL 之合成及生理功能

LPL 主要在脂肪、肌肉及乳腺等組織進行合成，其作用於血管內壁。而在細胞內質網合成，經過醣基修飾作用形成 homodimer 具有活性後，再由囊泡分泌至細胞表面。藉由細胞表面的硫酸肝素蛋白聚醣 (heparan sulfate proteoglycan, HSPG) 進行結合，再透過機制轉位 (translocation) 至血管內壁 HSPG 中，可水解血液脂蛋白 (lipoprotein) 之 TG，其水解之產物直接由周邊組織吸收利用。另外，在肌肉組織裡，大部分水解產物被氧化代謝作為能量之來源，脂肪組織則是進行 TG 之合成及能量儲存。在實驗中，往往藉由添加肝素 (heparin) 使 HSPG 與 LPL 之間產生作用，將附著於細胞表面或血管內壁之 LPL 具有生理活性之酵素 (Braun and Severson, 1992)。

三、 LPL 之活性調控

LPL 之活性受到轉錄及後轉錄調控機制影響，其中又以後轉錄調控為主要之調控機轉，包括改變營養狀態及激素作用皆是利用後轉錄調控影響脂肪組織 LPL 之活性。其後轉錄調控包含了改變 mRNA 穩定性、轉譯作用、蛋白質降解作用、修飾作用、外泌作用、轉位作用與產物間相互抑制作用。Insulin 則可以增加脂肪組織 LPL mRNA 表現量，並且不影響基因轉錄速率，可能是藉由穩定調控 mRNA 及提高脂肪組織 LPL 之活性。兒茶酚胺 (catecholamines) 及甲狀腺素 (thyroid hormone) 可藉由產生 RNA 結合蛋白與 3’ 未轉譯區（3’

untranslated region, 3’ UTR）作用，產生抑制轉譯作用。另外，在糖尿病試驗中，

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缺乏 insulin 所導致脂肪組織 LPL 在轉譯時效率降低之現象，也是由於某些因子與 3’ UTR 作用之結果。當身體處於飢餓狀態時，脂肪組織中 LPL 之活性會下降，主要是由於醣基修飾作用受到抑制，或是蛋白質無法運送至高基氏體所導致。當血液中的游離脂肪酸濃度過高時，可能使 HSPG-LPL 間競爭，最後 LPL 被換至血液，其這種作用代表 LPL 之回饋抑制機轉，避免組織大量進行脂解作用 (lipolysis)，同時又可從循環系統繼續攝取脂肪酸 (Mead et al., 2002)。

四、脂解作用 (lipolysis)

(一) 荷爾蒙敏感性脂解酶 (hormone-sensitive lipase, HSL)

細胞中 HSL 可水解 TG 及甘油二酯 (diacylglycerol, DG)，為影響 lipolysis 之關鍵酵素。其中以膽固醇酯類 (cholesteryl esters)、維生素 A 酯類 (retinyl esters)、固醇酯類 (steroid esters) 及對硝苯酯類 (p-nitrophenyl esters) 都是 HSL 之催化受質，而甘油酯類 (acylglycerols) 則排除在外。HSL 含有催化結構區、

磷酸化作用位置的調控結構區及負責與蛋白質、油脂作用之 N 端變異結構區等三個結構區 (domains)。另外，HSL 平時在細胞質中，受到荷爾蒙刺激磷酸化後，

會由細胞質移動至油滴表面進行催化脂解作用 (Carmen and Victor, 2006)。

(二) Perilipins

Perilipins 為疏水性油滴結合磷酸蛋白 (hydrophobic lipid droplet-associated phosphoproteins) 之家族成員，位於脂肪細胞內儲存 TG 之囊泡裡，在膜內側會有蛋白質覆著於油滴表面稱為 perilipins。當未受到荷爾蒙刺激時，perilipins 可以幫助脂肪堆積，於油滴周圍形成屏障，進而阻礙酵素之基礎脂解作用 (basal lipolysis)。蛋白激酶 A (protein kinase A, PKA) 可催化 perilipins 進行磷酸化反應，使其失去屏障功能及提高 lipolysis 之效率。Perilipin 為剔除小鼠高程度之 basal lipolysis 表現及減少脂肪組織，和一般小鼠相較之下，較不易經由飲食誘導肥胖。另外，perilipin 也是轉錄因子 PPARγ 之目標基因之一，可受誘導而活化。而腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 具有促進 lipolysis 之效果，這可能和抑制 perilipins 基因表現有關 (Carmen and Victor, 2006；Holm, 2003)。

(三) 脂肪細胞脂質結合蛋白 (adipocyte lipid binding proteins, ALBP)

ALBP 屬於低分子量 (15 kDa) 蛋白質，具有 β-barrel 結構，與脂肪酸、維 生素 A 衍生物 (retinoids) 或其他疏水性配體結合，形成疏水性空腔。脂肪細胞脂質結合蛋白 (adipocyte lipid binding proteins, ALBP) 為除了 perilipins 外，另一種與脂質特異性結合之細胞質蛋白質，可隔離細胞中的脂肪酸，並同時協助細胞內脂質之運送。當進行 lipolysis 時，ALBP 與 HSL 會形成複合體，使 HSL 從細胞質移動至油滴，其 ALBP 之結合並隔離脂肪酸等特性可減少產物達到抑制作用及增加 HSL 之水解活性 (Carmen and Victor, 2006)。

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(四) Lipolysis 之調控機制

在脂肪細胞中，受到荷爾蒙、神經傳導物質及其他因子調控之 lipolysis，其 HSL 為主要調控目標之一。兒茶酚胺 (catecholamines) 藉由 cAMP 訊息傳遞路徑影響 lipolysis 為典型之調控機制。在細胞表面，Catecholamines 有三種 β-腎上腺素受體 (β-adrenoceptors, β-ARs) 及二種 α-腎上腺素受體 (α-adrenoceptors, α-ARs)。其 β-ARs 主要表現於脂肪組織中，此受體偶聯至 Gs-蛋白透過 lipolysis 之正向調控機制，當荷爾蒙與受體結合時， Gs- 蛋白可刺激腺苷酸環化酶 (adenylate cyclase) 促進 cAMP 生成。cAMP 可活化蛋白激酶 A (protein kinase A, PKA) 酵素，進而催化 HSL 及 perilipins 之磷酸化，使 perilipins 失去屏障功能，並同時 HSL 開始由細胞質移動至油滴表面水解 TG。除了 cAMP 之濃度外，β-ARs 及 Gs 表現量也是調控 lipolysis 要素之一。睪固酮 (testosterone) 可以誘導 β-ARs 表現，使刺激 lipolysis 具較長時間。

Gi-蛋白能抑制 adenylate cyclase 減少 cAMP 之生成，對於 lipolysis 會進行負向調控。過去研究顯示，β3-AR 同時與 Gs 及 Gi-蛋白偶聯，可同時傳遞二種調控 lipolysis 之訊息。β3/Gi 訊息傳遞路徑除了限制 Gs-蛋白對 adenylate cyclase 之活化作用外，還可刺激細胞外訊號調節激酶 (extracellular signal regulated kinase, ERK)，故 β3-AR 受體也具備調控細胞增生、凋亡、分化等功能。

其 α2-AR 也與 Gi-蛋白偶聯，表現抑制 lipolysis 之功能。此受體對生理胺類 (physiological amine) 具有很高之親合性及較低濃度 catecholamines 即能刺激訊息傳遞，代表 lipolysis 之基礎抑制機制。腺苷酸 (adenosine) 在脂肪細胞中也是結合至 Gi-蛋白偶聯受體之一，為另一種 lipolysis 抑制物。正常狀況下，脂肪細胞自動合成 adenosine 與抑制 basal lipolysis 。另外， TNF-α 可以減少 adenosine 受體偶聯之 Gi-蛋白，並且活化 lipolysis。而 Catecholamines 刺激 lipolysis 同時也會活化磷酸二酯酶 (phosphordiesterase, PDE)，並促進 cAMP 產生水解，避免短時間內的過度反應。PDE 依對 cAMP 及 cGMP 之親合性、對刺激物與抑制物反應之差異，分別有 14 種型式。其中 PDE3 對 cAMP 及 cGMP，依基因來源不同又分為 PDE3A 及 PDE3B。在脂肪細胞中，PDE3B 同時也是荷爾蒙調控目標之一。 Insulin 與高濃度 cAMP 荷爾蒙皆能夠促進 PDE3B 之磷酸化 (圖 5)。而在糖尿病患者體內發現，施打 insulin 或口服糖尿病藥物治療後，PDE3B 活性會降低，進而達到改善效果。其他像是甲狀腺素、

TNF-α 都具有抑制 PDE3B 及促進 lipolysis 之效果，而細胞中高濃度鈣離子則可活化 PDE3B 與抑制 lipolysis (Carmen and Victor, 2006)。

第四節深層海水 (Deep Ocean Water, DOW)

海洋以深度來區分大致可分為表海水層、中海水層及深海水層。而水深在 50 到 200 公尺表海水層有弱光層之稱，由於受到大氣影響水溫並不穩定；中深海水層為水深介於 200 至 1000 公尺又稱無光層，此層海水溫度會隨深度不同而

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圖 5、磷酸二酯酶 (phosphordiesterase, PDE) 路徑調控脂解作用。

Fig. 5. Phosphordiesterase (PDE) pathway to lipolysis.

(Carmen and Victor, 2006)

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有所差異，以致於很難精確界定；另外有些區域的溫度變化呈現跳躍式的變化，

故稱之為溫躍層但其穩定性高，可區隔上下層海水；又漸深海水層有漸黑、深黑之稱；深度約為 1000 至 4000 公尺，此深度多處於低溫狀態，故稱之為低溫冷水（吳，2004）。

一、深層海水之定義

地球表面面積中海洋約佔了 71%，平均水深約有 3795 公尺，而深層海水佔整個地球海域的 95%。深層海水主要定義在位於海平面 200 公尺以下之海水

，不受微生物或病原菌汙染條件，具有低溫、富含礦物質、高營養鹽與豐富的微量元素 (Hwang et al., 2009) 以及永續再生性等特性 (王等，2003)。

二、深層海水之特性介紹

由於陽光無法到達之深海處，而使得水溫比表層海水低且溫度變化不大，故終年低溫非常穩定。另一方面，也因為浮游生物無法生存，使氮、磷、矽、硝酸等無機營養鹽類都沒有被利用，以至於含量豐富。我國海域深層海水水溫約為 6 - 9℃，水壓高達 20 個大氣壓以上 (圖 6) (王等，2003)。將深層海水處理後，

可萃取出大量的礦物質與微量元素，其中礦物質包含鎂、鈣、鉀等，另外微量元素包含有鋅、銅、磷、硼、硒等高達九十多種。而硒在日常生活中不易取得，一旦人體缺少，則罹患糖尿病、心臟病與癌症等機率則會相對的增加。而在深層海水中所富含的硒，對於缺乏硒的人體中，具有非常大的幫助 (王等，2003)。

三、深層海水之預防代謝症候群之過去研究

由於近年來深層海水的開發，使得深層海水在各方面都受到關注，除了因為擁有高生產率外，也可以應用於各個產業，像是食品、妝品、農業及醫療上面 (表 1) (大仲鈞等，2002)，如過去研究已發現，飲用深層海水可改善皮膚炎及過敏性濕疹 (Hataguchi et al., 2005；Kimata et al., 2002)。

(一) 降血脂之過去研究

前人研究顯示，以深層海水餵食高膽固醇兔子，經餵食後第 28 天犧牲後觀察其內部器官，發現深層海水可以減少三酸甘油酯含量、降低血清中總膽固醇、

低密度脂蛋白膽固醇及脂質含量，進而達到防止血栓之形成 (Yoshioka et al., 2003; Katsuda et al., 2008)。

(二) 降體脂之過去研究

由於 3T3-L1 前脂肪細胞作為評估脂肪細胞分化及體外細胞試驗的典型細胞。有學者藉由深層海水對 3T3-L1 前脂肪細胞進行試驗，結果顯示，深層海水有顯著減少脂滴堆積的能力，具有調降脂肪轉錄相關基因表現量，可以抑制前脂肪細胞的分化情形，並且有劑量效應的存在 (Hwang et al., 2009)。

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圖 6、深層海水分佈圖。

Fig. 6. The distributed of deep ocean water.

(陳等，2003)

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表 1、深層海水之功能與應用產品

Table 1. The function and application of deep ocean water product

領域目的利用種別具體列/應用列

水產 1. 生產魚貝類及種苗

2. 養殖海藻類 3. 蓄養魚貝類

由於低溫性和清淨性，可以維持適合養殖或種苗的水溫和水質，預估能有穩定的生產量。

由於營養鹽豐富，非常適合生產海藻類、褐藻類和綠藻類。

由於幾乎沒有細菌、病毒的存在，是個很適合飼養健康的魚貝類之環境。

食品 1. 生產飲料水和酒類 2. 生產食品

3. 生產健康食品

脫鹽後用來製造飲用水、清涼飲料、

清酒、啤酒等酒精飲料。

由於報告說其有促進發酵等效果，故可以廣泛用來製造豆腐、魚板、蒟蒻、

涼粉、羊羹、和菓子、果凍、冰淇淋、

麵包、醬菜、鹹乾物、糕點類、拉麵、

納豆、鹽、味噌、醬油及供調味用的柳橙汁等。

可以增殖培養小球藻、螺旋型藍藻類等有用的微細藻類。

醫藥、醫療

、美容

1. 治療特異反應症皮膚炎

2. 海洋療法

3. 生產化妝品

由報告可以得知，利用海洋深層水來治療特異反應症皮膚炎，約有六成的患者獲得一些改善，期待科學能解明其因果關係。

海洋療法是指在醫學的監視下，使用有和人類幾乎相同的礦物質成分之海水、海藻或海泥等，提高自然治療力的療法。據說有減少體脂肪、減輕體重及美肌效果。

浸透肌膚的效果好，且具保濕效果，

大眾期待它能廣泛運用到美容領域。

農業 1. 控制出貨栽培

2.水耕 (養液) 栽培

藉其低溫特性來控制栽培設備內或栽培土壤的溫度，就可以栽培高原蔬菜等的低溫植物。此外，也可以調整花卉等的出貨時期。

可以活用其富營養性及礦物質性來作為栽培肥料。

能源資源 1. 利用海洋溫度差來發電 2. 作為設施內的冷氣、冷卻水 3. 生產淡水

藉由表層海水和海洋深層水的溫度差，

可以活用綠色自然資源。

由於可以作為綠色的冷熱能源，期待其能作為設施內冷氣或工廠的冷卻水。

因其具有清淨特性，不需要經過一般所需的前置處理作業就可以淡水化。

環保 1. 礁岩露出對策 (因海藻場枯萎)、淨化

2. 使二氧化碳固定化

活用其富營養特性，使海域肥沃化，

用來增殖海藻類與淨化海水。

可以利用海洋深層水來增殖需要吸收二氧化碳的植物浮游生物、珊瑚及海藻。

(大仲鈞等，2002)

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(三) 降血糖之過去研究

前人以動物實驗模式，藉由飲用深層海水探討肥胖與糖尿病的特定相關因子表現量，研究結果顯示，深層海水可調降脂肪組織中 FABP 與 Adiponectin 的蛋白質表現量，進而達到改善肥胖與糖尿病的效果，另外也發現深層海水具有顯著降低 PPARγ 與 C /EBPα 的 mRNA 表現量 (Hwang et al., 2009)。

四、深層海水對微生物發酵之影響

日本用深層海水發酵已成功開發出專利的麵包製造方法，也運用在味噌、啤酒、清酒、麵包等，除能加速發酵的結果，也使味道變得更加美味，並使麵包類產品防霉效果獲得顯著提升。以深層海水可促進發酵，其中鎂、鈣與磷酸鹽離子與酵母生長有關 (久武陸夫，2000)，可促進紅麴菌的生長及大量提升 MS 與 AK 之生成量 (Lee et al., 2010)。

五、深層海水富含離子之保健功效

深層海水中富含有非常豐富的微量元素及礦物質，其中有好幾種為人體中所需的攝取營養來源，如果缺乏其中一種都可能會使人體產生疾病或是身體不適 (表 2)。微量元素包含有鋅、銅、硼、磷及硒等種類多達 90 多種，而這些微量元素與人體內存在的礦物質元素相似，因此非常適合人類攝取以補充營養 (吳，

2004)。近年來研究指出提高鎂 / 鈣比值可以減少心血管疾病的產生 (Kousa et al., 2006)。更有研究指出，飲用富含鎂離子與鈣離子的飲用水可以降低罹患之高血壓。也有學者指出飲用水中的鈣與鎂的離子濃度與心血管疾病的死亡率相關，

尤其以鎂攝取可有效預防心血管疾病發生 (Tubek, 2006)、抑制粥狀動脈硬化 (Cohen et al. 2002)、肝癌 (Tabibzadeh et al., 1986)、胃癌 (Yang et al., 1998)、結腸癌 (Yang et al., 1997)、前列腺癌 (Yang et al., 2000) 及卵巢癌 (Chiu et al., 2004) 等的發生。若人體中缺乏硒，則罹患心血管疾病、糖尿病或癌症之機率非常高 (大仲鈞等，2002)。由於深層海水富含有豐富礦物質，像是鎂、鉀、鈣等皆被認為與預防心血管疾病有關，以至於有學者亦認為深層海水具有抗肥胖藥物的潛力存在 (Hwang et al., 2009)。

第五節紅麴菌

紅麴菌在中國已有千年的歷史。明朝李時珍撰的《本草綱目》寫到對紅麴的

功效有如下的記述：「紅麴主治消食活血，健脾燥胃。治赤白痢，下水榖、釀酒

破血行藥勢、殺山嵐瘴氣、治打撲傷損、治女人血氣痛及產後惡血不盡」。另外在明末宋應星的《天工開物》:「丹麴為一種世間最腐朽物，而此物薄施塗抹，

能固其質于炎暑之中，經歷旬日，色味不離初，蓋奇藥也」,裡面記載製作紅麴需選用精白在來米，以及二次蒸飯與接種後之管理方法亦沿用到至今 (蘇，

1970)。

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表 2、深層海水之營養元素及其功能

Table 2. Nutrients and functions of deep ocean water

元素名稱每日所需攝取量攝取不足可能引發之病症鈉 (Na⁺) 1500 mg 食慾不佳、暈眩、抽筋、四肢無力

鉀 (K⁺) 4700 mg 四肢無力、麻痺、口渴、腸胃乳動緩慢鈣 (Ca²⁺) 1300 mg 骨質疏鬆、抽筋、麻痺、憂鬱症傾向、指甲發

育不全

鎂 (Mg²⁺) 420 mg 手腳疼痛、暈眩、抽筋、亢奮鐵 (Fe²⁺) 18 mg 貧血、暈眩、四肢無力鋅(Zn²⁺) 11 mg 發育遲緩、皮膚炎、味覺異常銅 (Cu²⁺) 0.900 mg 貧血、發育不良、血管脆弱

碘( I^-) 0.150 mg 甲狀腺腫大、易疲勞、水腫、發育不良 (George et al.,2009; Adam, 2010)

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一、紅麴之介紹

紅麴又名赤麴，在日本以 beni koji 或 anka koji 稱之，歐洲則稱為中國紅米 (red Chinese rice) (陳，2003)。近年來紅麴產品一直推誠出新，從最早使用在釀酒及呈色劑等，到現在與微生物共發酵提升其功效，主要都是由於大家將健康逐漸視為重要，所以天然食品的功效就非常重要。

二、紅麴菌之生活史

紅麴菌之生活史 (圖 7) 為雌雄同體 (homothallic)，其菌絲呈不規則狀且內有大型液泡、微小體、粒線體及隔膜結構，主要由孢子 (conidium) 行無性生殖或產生子囊果行有性生殖。在行有性生殖時，菌絲頂端之精子器 (antherdium) 會延伸為一多核管狀細胞，而雌性母細胞同時會分裂為受精毛 (trichogyne) 與造囊果 (ascogonium)。結合後形成直徑約 20-40 μm 之子囊果，即成熟後子囊孢子會自子囊果裂口處釋出，再開始其新的生活史 (蘇等，1970) 。另外，溫度影響紅麴菌之有性及無性生殖非常明顯。其菌株於 25-35℃ 間培養有利於有性生殖，

且產生之子囊孢子較多；在 35-40℃ 間則是以無性生殖為較有利，且產生之分生孢子也較多。

三、紅麴菌之分類

紅麴菌屬 (Monascus) 是真菌界 (Fungi) 中的子囊菌亞門 (Ascomycota)、子 囊菌綱 (Ascomycetes)、散囊菌 (Eurotidles)、紅麴菌科 (Monascaceae)。其菌絲特徵是呈無色、褐色或紅色，具有橫膈 (septa)，在末端會有大型的有性厚壁子 囊 (ascocarp)。而紅麴菌常見的分類方法為將紅麴菌分為六種，分別為 Monascus pilosus、Monascus purpureus、Monascus ruber、Monascus floridanus、Monascus pallens、Monascus sanguineus (蘇等，1970)。

四、紅麴菌之代謝物

紅麴在我國有千年歷史，其紅麴菌經發酵後生產之代謝產物具有高經濟價值。

而近年來各項研究指出，紅麴可以產生的經濟產物如下：

(一) 菌體外水解酵素

紅麴所產生澱粉分解酵素 (amylase)、酸性蛋白質分解酵素 (acid protease)、澱粉葡萄糖化酵素 (glucoamylase)、麥芽糖分解酵素 (maltase)、果膠分解酵素 (pectinase) 、半乳糖分解酵素 (α-galactosidase) 及核醣核酸分解酵素 (ribonuclease) 等 (Su et al., 1976)，在發酵食品上面可以產生香氣及甘甜的味道，

因此可應用在加工食品的調味上 (林，1992)。

(二) 一級代謝產物

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圖 7、紅麴菌之生活史。

Fig 7. Life cycle of Monascus.

1, 2：子囊孢子形成營養菌絲

3→7：生殖器官之形成與造囊菌絲之發育 8, 9：成熟之子囊果

10：單一細胞分生孢子 (one cell conidia) 之無性生殖

(蘇等，1970)

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經由研究指出以紅麴菌培養於葡萄糖為碳源之培養基中，經七天培養後，可以產生檸檬酸 (citric acid)、琥珀酸 (succinic acid)、葡萄糖酸 (gluconic acid)、草酸 (oxalic acid) 及乙醇 (ethanol) 等一級代謝產物 (蘇等，1970)。

(三) 次級代謝產物

多年來國內外的各項研究顯示，紅麴的次級代謝產物 (secondary metabolites) 具有多種保健功效 (表 3)，故在次級代謝物的功效成分上面成為研究的焦點所在。

1. 紅麴色素群 (pigments)

紅麴菌的營養菌絲 (vegetative hyphae) 形成階段會產生紅麴色素，並且堆積在菌絲體內，再由菌絲尖端的微孔或細胞壁之破裂部分擠出色素 (蘇，1999)。

目前已知有八種化學結構被確定出來，其結構式圖 8 可分三類，分別為紅色素 (monascorubramine 及 rubropunctamine) 、橘色素 (monascorubrin 及 rubropunctatin) 及黃色素 (AK、MS、yellow II 及 xanthomonascin A)，相互間構造極為相似，屬於 azaphilones 類的真菌代謝物。橘色素的生成則是由一連串酵素反應合成，為對胺基酸有高度親和力的化合物，黃色色素是橘色色素的還原物，

橘色色素位在側環上的氧會與一級氨進行氮取代反應，而產生紅色色素。紅麴色素具耐熱、耐光性以及安定性高，往往被用於傳統食品之呈色上，尤其對蛋白質食品得著色能力良好且色澤誘人 (Su, 2005)。近來發現紅麴色素具有許多功效，

研究指出紅麴色素的橘色色素和黃色色素能抑制 Bacillus subtilis 和 Escherichia coli 的生長，具有防腐敗之功效 (Hawksworth and Pitt, 1983)。也有 研究發現紅麴之橘色素及黃色素會刺激老鼠脾臟 T 細胞之增生，具增強免疫之效果，且紅麴黃色素增強免疫之效果優於橘色素 (Martinkova et al., 1999)。 Martinkova 等人針對三類已知的紅麴色素探討其生物活性，將紅麴色素純化後 進行實驗，發現紅麴之橘色素及黃色素會抑制 Bacillus subtilis 及 Candida pseudotropicolis 生長，顯示具抗細菌及真菌之活性，且紅麴橘色素之抑菌效果 優於黃色素。 Yasukawa 等人在動物實驗結果發現，以橘色色素 monascorubin 塗敷於皮膚表面能抑制 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) 所引發癌症發展，推論透過減少發炎反應來減緩癌症之發展。紅麴色素除了可以抑制腫瘤生成之外，還具有抑菌生長的效果。而後 Yasukawa 等人又在 1996 年研究結果示紅麴色素可抑制腫瘤生成，在兩階段癌症模式以 7,12-dimethylbenzanthracene (DMBA) 為起始物，TPA 為癌症促進物，顯示在飲水中添加 0.02% 紅麴色素可有效抑制 TPA 所引發之癌症 (Yasukawa et al, 1996)。蘇等人進行動物安全性試驗，探討紅麴色素的食用安全性，以口腔管餵強迫給予及腹腔注射兩種方法進行毒性試驗。經由口腔管餵強迫給予所得的 LD50 大於 33.3 g/kg bw，超出安全性標準的一倍以上，腹腔注射所得的 LD50 約為 8.7 g/kg bw。另外，在測試為期 12 週的亞急性毒性試驗，試驗組的生長率、能量攝取量、飼料利用率均與對

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表 3、紅麴次級代謝產物在預防醫學應用上的發展

Table 3. The development of Monascus-fermented metabolite in the preventive medicine

年代功效有效成分發表期刊作者

1979 Hypolipidemia Monacolin K J Antibiot (Tokyo) Endo

1988 降血糖未知食品與科學玉田英明

1922 Anti-hypertension GABA Jpn J Nutri Tsuji et al.

1996 Anti-tumor promotion Monascus pigment Oncology Yasukawa et al.

1999 Hypolipidemia (clinical trials) Monacolins Am J Clin Nutr Heber

1999 Protection liver Dimerumic acid Gen Pharmacol Aniya et al.

2000 Anti-inflammation Aqueous extract J Ethnopharmacol Rhyu et al.

2003 Anti-atherosclerosis Monacolins J Nutr Biochem Wei et al.

2004 Inhibit the differentiation of preadipocytes Aqueous extract Life Sci Jeon et al.

2006 Anti-fatigue Amino acids and other

substances

Appl Microbiol Biotechnol Wang et al.

2007 Hypolipidemia and anti-atherosclerosis Monacolins J Agric Food Chem Lee and Pan

2007 Anti-alzheimer disease (Animal model) Monacolins, GABA,

Antioxidant

J Neurosci Research Lee and Pan

2008 Anti-alzheimer disease (Cell model) Monacolins, Antioxidant Appl Microbiol Biotechnal Lee and Pan

2008 Prevention of fat accumulation Monacolins, Antioxidant Int J Obesity Chen and Pan

2009 Blood pressure regulation GABA, ACEI J Agric Food Chem Wu et al.

2010 Hypolipidemia Monascin, Ankaflavin J Agric Food Chem Lee et al.

2010 Inhibit the differentiation of preadipocytes Monascin, Ankaflavin J Agric Food Chem Jou et al.

2011 Immunomodulatory activities and antioxidant Polysaccharides J Sci Food Agric Tseng et al.

2011 Regulation of lipid metabolism and antioxidant Monascin, Ankaflavin National Taiwan University Master Thesis

Jean-You Cai

2011 Prevents Zn deficiency-induced testis and sperms Injury Unknown (monascus-fermented rice)

Journal of Food and Drug Analysis Lee et al.

2011 Antidiabetic and antioxidative stress Monascin Free Radic Biol Med Shi et al.

2012 Lipid metabolism in blood, liverand adipocyte tissue Monascin, Ankaflavin, and Monacolin K

National Taitung University Master Thesis

Chia-Yan Wen

2012 Inhibition of leukemia proliferation Monascus-fermented dioscorea J Food Funct Lee et al.

2012 Monascus fermentation technology for high hypolipidemic effect Monascin, Ankaflavin, and Monacolin K

J Appl Microbiol Biotechnol Lee and Pan

2012 Suppresses inflammation via PPARγ regulation and JNK inactivation in THP-1 monocytes

Monascin J Food Chem Toxicol Hsu et al.

2012 Regulate endothelial adhesion molecules and endothelial NO synthase expression induced

Ankaflavin and Monascin J Agric Food Chem Hsu et al.

2012 Induction of apoptosis in human breast adenocarcinoma cells MCF-7 Azaphilone Molecules Hsu et al.

2012 Immunomodulatory activities and antioxidant properties of polysaccharides Monascus-fermented products J Sci Food Agric Tsenq et al.

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圖 8、八種紅麴色素之結構。

Fig 8. The chemical structures of eight types of Monascus pigments.

(Blanc et al., 1994；Jzlova et al., 1996)

國立台東大學 生命科學系碩士論文 Department of Life Science National Taitung University Master Thesis