行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
具釋控性去乙醯幾丁聚醣/聚乳酸水膠在導引組織再生之開 發與應用研究
計畫類別： 個別型計畫
計畫編號： NSC93-2314-B-038-037-
執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 臺北醫學大學牙醫學系
計畫主持人： 李勝揚
共同主持人： 劉巡宇，楊正昌
報告類型： 精簡報告
處理方式： 本計畫可公開查詢
中 華 民 國 94 年 10 月 24 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 ■ 成 果 報 告
□期中進度報告
具釋控性去乙醯幾丁聚醣/聚乳酸水膠在導引組織再生 之開發與應用研究
計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫
計畫編號：NSC 93 － 2314 － B － 038 － 037 － 執行期間： 93 年 8 月 1 日至 94 年 7 月 31 日
計畫主持人：李勝揚 教授
計畫參與人：楊正昌
、詹進忠、李憲坤成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
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□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
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處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、
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□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢
執行單位：台北醫學大學/牙醫學研究所
中 華 民 國 94 年 10 月 24 日
具釋控性去乙醯幾丁聚醣/聚乳酸水膠在 導引組織再生之開發與應用研究
李勝揚
台北醫學大學/口腔醫學院/牙醫學研究所
計畫期間：93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 計畫編號：NSC 93-2314-B038-037-
中文摘要
將吸收性高分子結合組織導引再生術(Guided Tissue Regeneration, GTR)之觀念而應用 到治療牙周病上，不僅具免除二次手術之優點，更在臨床醫療上證實新骨質之生成，然而 在手術後為減少或舒緩發炎反應，往往需藉助抑菌漱口水或使用抗生素藥物，甚至在 GTR Barrier 產品中添加 Doxycycline，而具水溶性之抗生素在劑量設計時常不易兼顧安全性與持 久性，故本計畫之目的在發展出兼具操作便利性與長效抑菌性之新型 GTR Barrier 阻隔材。
研發構想上，係以可注射式之吸收性聚乳酸共聚物溶液系統為基礎，透過導入具有抑菌功 能與促進骨瘉合功能之幾丁聚醣，有效地提供長時間之抑菌效果降低發炎反應及加速癒合 以縮短療程。研究重點在探討幾丁聚醣與聚乳酸共聚物溶液之相分離行為以增進對薄膜孔 洞大小控制之瞭解，並探討浸泡時間對不同組成配方之抑菌性影響，為產品配方上兼顧整 體療效與便利性之設計基礎。
關鍵詞：組織導引再生、吸收性植入材、去乙醯幾丁聚醣、聚乳酸 Abstract
The improvement in surgical technique and the barrier materials have made the GTR (Guided Tissue Regeneration) technology successfully applied in periodontal therapy. A variety of resorbable barrier materials have been marketed during these few years offering the benefit of second-stage surgery free as well as the promotion of new cementum formation and connective tissue fiber attachment. Although these resorbable GTR barriers showed some promising results, the development of post-surgical infection control is still needed. Our goal is to develop an injectable GTR Barrier with a long-lasting antibacterial function and wound healing to meet specific human biology requirements. A resorbable PLA/NMP solution system formulated with the addition of Chitosan. The phase separation behavior of the Chitosan/PLA/NMP solution system was studied to gain the control of pore-formation in membrane for cell occlusion. The soaking time dependence of antibacterial effect of various GTR barriers was evaluated to compare the lasting period of effectiveness.
Keywords: GTR, Resorbable implant, Chitosan, PLA
ㄧ、前言與研究目的
根據統計，三十五歲以上的成年人罹患程度不等的牙周疾病的比例高達 80%，牙周病 的成因是來自牙菌斑及牙結石，其內包含很多細菌導致牙齦發炎、紅腫，若未及時治療則 細菌會引起慢性發炎反應，導致牙齒周圍支持組織，包含齒槽骨及牙周組織之吸收破壞。
組織引導再生(Guided Tissue Regeneration, GTR)技術本質上是將膜片植入患處，藉以阻隔生 長較快之上皮細胞不當之增生，同時預留空間，以利生長速率較慢之其他組織細胞能重新 聚集在骨缺損區，進一步形成骨質再生之治療方式。目前市面上暨有之 GTR membrane 商 品超過 15 種以上，其中國內具代理商之商品則多達 8 家，而目前國內尚無廠家生產，醫療 上之需求全賴進口供應，顯示出 GTR membrane 在醫療上之重要性，與國人積極投入研發 之重要性。
綜觀市售 GTR 膜片商品種類雖多，然而臨床實務上，在 GTR 手術後之 3 - 6 週為 減少或舒緩發炎反應，往往需藉助抑菌漱口水，必要時甚至使用抗生素藥物，並起有 Atrisorb-D®產品在 GTR Barrier 中添加 Doxycycline 以解決術後發炎問題，然而
Atrisorb-D®係以將聚乳酸與抗生素溶於 NMP 溶劑中使其具流動性方便施打，操作時則 需藉由水之沖洗移除溶劑 NMP，使聚乳酸固化成具孔洞之薄膜，然而因 Doxycycline 為 具水溶性之抗生素，易伴隨 NMP 移除時被洗出而流失，再者由 Atrisorb-D®之經體外釋 放控制測試研究指出，在 24 小時之內 Doxycycline 釋放的比例高達 90％以上，使得抗生 素之劑量設計時常不易兼顧安全性與持久性。
幾丁聚醣(Chitosan)為一種具有抑菌性之天然多醣類 (Polysaccharide) 高分子，文獻 已證實對於在牙周病病原菌中常見的 Actinobacillus actinomycetemcomitans (A.A)和 Porphyromonas gingivalis (P.G)的生長抑制，促進傷口癒合，與新骨增生上也有不錯的效 果，而 Chitosan 在酸性水溶液(pH < 6.3)中之溶解度雖依其去乙醯度之不同而異，但在鹼 性環境中並不溶解，而在口腔中正常唾液的 pH 值介於 5.6 到 7.6 之間，故在配方設計上 選擇以添加幾丁聚醣來提供 GTR barrier 持久之抑菌功能。
因此本研究之目的係以可注射式之吸收性聚乳酸共聚物溶液系統為基礎，透過導入 具有抑菌功能與促進骨瘉合功能之去乙醯幾丁聚醣，有效地提供長時間之抑菌效果降低 發炎反應及加速癒合以縮短療程。
二、材料與方法 2.1 材料
Poly(D/L-lactic acid), 20KDa, BMG Inc., JAPAN。
Chitosan (DD=95％, 35KDa), 世展科技。
Amorphous calcium phosphate (Ca/P = 1.5), 實驗室製備。
N-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP), ACROS。
Lactic acid, 90%, ACROS。
Bacterial : actinomycetemcomitans（ATCC 29523）
2.2 實驗流程圖
不同濃度PLA溶液，
對於材料孔洞之影響 不同濃度PLA溶液，
對於材料孔洞之影響
分別比較含有Doxycycline 及Chitosna之Barriers的
抑菌效果 分別比較含有Doxycycline
及Chitosna之Barriers的 抑菌效果
探討可塑性機制及微結構 探討可塑性機制及微結構 PLA / NMP / Water
ternary phase diagram Antibacterial activity 可塑性探討 PLA/Chitosan/ACP GTR barriers
PLA/Chitosan/ACP GTR barriers
‧動態接觸角儀
‧流變儀
‧熱重分析儀
‧光學顯微鏡
‧電導度測試計
•A.A.菌（ATCC 29523）
•分光光度計
•SEM
三、結果與討論
3.1 PLA 與 Chitosan 之溶液相行為
因聚乳酸PLA之接觸角(Contact Angle)約為 73o，特性上較為疏水( Hydrophobic)，需 溶於NMP之強極性溶劑，卻不易溶於水，而Chitosan為親水性材料(Hydrophilic)，可溶於 微酸性之水溶液，但不溶於NMP溶劑中，無法找到單一溶劑可以同時溶解PLA與Chitosan，
故需找出特定混合比例範圍之Lactic acid/NMP共溶劑，以將此二種性質不同的材料進行混 合。
首先將Chitosan溶於不同濃度之乳酸Lactic acid水溶液中，配製成呈鵝黃色之透明 Chitosan/Lactic acid(aq)溶液，再將溶液，加入不同比例之NMP溶劑，利用磁石攪拌均勻混 合後觀察其靜置後溶液是否有沉澱物析出，據此判斷其組成份濃度對Chitosan溶液相行為 之影響，將其組成份之溶解狀況標示於三相圖上，以虛線分隔soluble 及insoluble 區 域，其結果如圖一(a)之Chitosan/NMP/water三相圖所示。而另ㄧ方面則是將不同濃度之 PLA/NMP溶液增加水之含量，以平衡後觀察溶液系統中是否會有沉澱產生，作為判斷 PLA/NMP/Water組成份為one-phase 或是two-phase產生相分離之依據，其結果如圖一(b) PLA/NMP/water三相圖所示。
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Wate DL-PLA
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
NMP
0 10 20
30 40 50 60 70 80
90 100
Col 23 vs Col 24 vs Col 25 Col 26 vs Col 27 vs Col 28 Chitosan solution in W / N
Water
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Chitosan / Lactic acid
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
NM P
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
soluble insoluble
Insoluble
(a) Chitosan / Water / NMP (b) PLA / NMP / Water
圖一、PLA 及 Chitosan 分別在 Water 及 NMP 溶劑中之 Ternary Phase Diagram 關係
3.2 PLA/NMP/Water 之相行為
將不同濃度之 PLA/NMP 溶液於水中沉澱固化成形，並將材料進行乾燥後在經由 SEM 觀察薄膜之斷面（如下圖），可發現 25、35、45%之 PLA/NMP 溶液在固化後其斷面均有 Finger-like 較大之孔洞結構，而且孔洞大小之分布較廣，而在 55%之 PLA/NMP 溶液在固化 後 Finger-like 孔洞結構明顯減少，而且孔洞大小之分布則較為均ㄧ，顯示 PLA/NMP 溶液 在進行相轉變時，會因組成份不同而影響其固化路徑，而導致不同相轉變後之薄膜孔洞結 構，而影響材料孔洞的大小及分佈。
25%
25%
35%
35%
45%
45%
55%
55%
Finger -like Structure
●Soluble ☉Insoluble
圖二、 PLA/NMP 溶液固化成膜後之斷面形態
3.3 PLA/Chitosan 溶液之配製
藉由Ternary Phase Diagram可瞭解其PLA及Chitosan在Water及NMP兩種溶劑下之比 例關係，再經由分別配製之PLA/NMP與Chitosan/ Lactic acid(aq)溶液，以不同之比例混合配 製，以找出可以同時溶解PLA與Chitosan之Lactic acid/NMP共溶劑濃度範圍。在以 8％之 Chitosan 水 溶 液 與 PLA/NMP 進 行 混 合 後 均 有 沈 澱 物 析 出 ， 並 且 考 慮 到 其 pH 質 較 為 低 (pH=4.64)，對於細胞組織可能造成影響，故以 4％之Chitosan水溶液與 55％PLA 溶液進行 混合，其溶液配製後之結果如照片所示，圖三(a) PLA/Chitosan = 87/1 無明顯之沉澱物析出，
圖三(b) PLA/Chitosan = 69/1 配製後則會有透明析出物沾黏在瓶壁上，若將將PLA /Chitosan
= 87/1 之溶液組經水洗固化沉澱後，直接換算成PLA/Chitosan之比例為 99.92/0.08，Chitosan 的 含 量 為 0.08 ％ ， 並 且 在 特 定 混 合 比 例 之 Lactic acid/NMP 共 溶 劑 可 得 ㄧ 均 勻 之 PLA /Chitosan/Lactic acid/NMP/Water溶液系統。
N.o. N o
(a) PLA /Chitosan = 87/1 (b) PLA/Chitosan = 69/1 圖三、 PLA/Chitosan 溶液之配製混合比例與相容性之關係
將含 0.1%ACP 之 PLA/Chitosan/ACP 溶液置於去離子水中 24 小時，經水洗固化沉澱去 除所含之 NMP(N-methyl pyrrolidone)及 lactic acid 混合溶劑後，形成白色片狀物(圖四(a))，
即使延長在水中浸泡之時間達 5 天，並不影響成形物之外觀，但若將薄膜於靜置室溫下乾 燥 48 小時後，其外觀則由原先具摺痕之白色固體薄片，轉變為體積膨潤呈半透明狀，並具 有柔軟可塑特性之複合材如圖四(b)所示，此時如將複合材重新浸泡於水中，則可恢復如圖 四(a)之白色固體。
(a)固化後 (b)靜置 48 小時後 圖四、 PLA/Chitosan/ACP 複合材之形態
3.4 GTR barrier 之抑菌持續性測試
為模擬與對比 Atrisorb-D® GTR Barrier 所含之 Doxycycline 在臨床應用時，其抑菌特 性會依植入時間而變異，故配製四組不同組成份之 GTR Barrier 如下(a) PLA / Doxycycline (88.85 / 11.15) (b) PLA / Chitosan / ACP (99.82 / 0.08 / 0.10) (c) PLA / Chitosan / ACP (97.82 / 2.08 / 0.10) (d) PLA / Chitosan (97.92 / 2.08)，先在水中浸泡 5 分鐘固化成膜後，再分別持續 浸泡在水中 1、3、8、11、18 天後取出，以添加 actinomycetemcomitans（ATCC 29523）菌 種培養 24 小時後，以 ELISA 測試結果為其各別之抑菌性指標。含有 Doxycycline 之 GTR Barriers 在初期(1 ~ 3 天)呈現良好之抑菌性，而當隨浸泡時間增加(8 ~ 18 天)，其抑菌效果 降至 20 ~30 %。對於 PLA/Chitosan/ACP GTR Barriers，剛固化後之樣品可能因內含殘留之 NMP 溶劑而均呈現具有抑菌效果，而對 Chitosan 含量為 0.08% 之樣品則抑菌性迅速下降 至低於 20%，反觀高 Chitosan 含量 (2.08%)之樣品，在浸泡 1 ~ 18 天之間，持續地維持約 60% 之抑菌效果，並隨時間增加無顯著的差異。
Time soaking in water (day)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2
Antibacterial Activity (%)
0 20 40 60 80 100
PLA / Doxycycline (88.85 / 11.15)
PLA / Chitosan / ACP (99.82 / 0.08 / 0.10) PLA / Chitosan / ACP
(97.82 / 2.08 / 0.10)
PLA / Chitosan (97.92 / 2.08)
0
圖五、 不同浸泡時間對 GTR Barrier 抑菌性之影響 四、結論
本研究植基於 PLA 與 Chitosan 各別之溶液相行為研究，找到可以同時溶解 PLA 與 Chitosan 之 Lactic acid/NMP 共溶劑濃度範圍，而 PLA/NMP 濃度在 55wt%，其孔洞分佈較 緊密且平均，可直接與濃度 4％之 Chitosan 水溶液直接配製成均勻可注射式之 GTR Barriers，但在配方上由於其 Chitosan 僅佔整體固含量(PLA/Chitosan)之 0.08%，不足以提供 預期之抑菌效果，若將 Chitosan 含量提高至 2.08%，可使 GTR Barriers 具有長效性之抑菌 效果具有。
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