行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
貝他型肌動蛋白與脂肪滴連結之研究 Inter action between Beta-actin and Lipid Dr oplet
計畫編號：NSC 89-2320-B-038-071
執行期限：89 年 08 月 01 日至 91 年 01 月 31 日 主持人：馮琮涵 助理教授
計劃參與人員：廖伊文 研究生
執行機構及單位名稱：私立台北醫學大學解剖學科
一、中文摘要
細胞內脂肪滴表面的蛋白質，多數具有 調節脂質代謝之功能。然而細胞內脂質代謝 之機轉及運送途徑仍有許多未知，所以本研 究擬探討是否仍有其他的脂肪滴表面蛋白 質存在，以及其功能為何。本實驗取材自大 白鼠腎上腺細胞與脂肪細胞，分別分離出細 胞內之脂肪滴，利用電泳與免疫轉漬方法分 析脂肪滴表面的蛋白質。結果發現，不論是 從腎上腺細胞或脂肪細胞分離出的脂肪滴 中皆有肌動蛋白存在。經二次電泳與免疫轉 漬方法證實為貝他型肌動蛋白。進一步培養 腎上腺皮質細胞，並利用免疫螢光染色法觀 察細胞內貝他型肌動蛋白分佈的位置，結果 顯示貝他型肌動蛋白除了架構成肌動蛋白 絲之外，同時也分佈於脂肪滴表面。另以 FITC-phalloidin 標示法證實脂肪滴表面的肌 動蛋白為顆粒狀。此外，利用藥物 dibutyryl cAMP 促使脂質水解，而後觀察脂肪滴的形 態以及其表面肌動蛋白分佈位置的變化。實 驗結果發現，以 dibutyryl cAMP 刺激，脂肪 滴會隨著刺激時間的增加而變小，原本位於 脂肪滴表面的肌動蛋白會脫落游離在胞質 中。推測脂肪滴表面的貝他型肌動蛋白可能 具有幫助脂質運送的功能。
關鍵詞：腎上腺皮質細胞、脂肪細胞、脂肪 滴、貝他型肌動蛋白
Abstr act
Several lipid droplet-associated proteins are involved in regulating intracellular lipid metabolism. However, the molecular basis of the acute hormonal regulation and mechanism of lipolysis in cells remains unclear. In this study, intracellular lipid droplets were isolated from rat adrenocortical cells and adipocytes.
The lipid droplet-associated proteins were analyzed by electrophoresis and Western blotting. We found that actin was copurified with both lipid droplet preparations.
According to the data of two dimentional electrophoresis and Western blot, lipid
droplet-associated actin was confirmed as beta isoform. Immunofluorescence with
anti-beta-actin antibody showed that beta-actin not only constructed the stress fibers, but also located on the surface of lipid drolplet. In addition, FITC-phalloidin staining displayed lipid droplet-associated actin was globular type. To investigate the interaction between beta-actin and intracellular lipid droplets, the redistribution of beta-actin was examined by administration of dibutyryl cAMP. After treatment of dibutyryl cAMP to stimulate lipolysis, lipid droplets were decrease in size. Immunofluorescence revealed that the number of stress fibers was
decrease and beta-actin was translocated from the surface of lipid droplets into cytosol in cultured adrenocortical cells. These data demonstrated that lipid droplet-associated globular beta-actin might facilitate
intracellular lipid transport during lipolysis.
Keywor ds : adrenocortical cells, adipocytes, lipid droplets, beta-actin
二、計畫緣由與目的
目前許多研究報告指出在細胞內脂肪 滴表面有許多不同的蛋白質存在。這些脂肪 滴 表 面 的 蛋 白 質 具 有 調 控 脂 質 代 謝 的 功 能。例如 perilipin (62 KD)為一種受荷爾蒙 調控的磷酸化的蛋白質，已知存在於脂肪細 胞(Greenberg et al., 1991)、腎上腺皮質與睪 丸間質細胞中(Servetnick et al., 1995)。此 外，若將 perilipin 的 cDNA 植入尚未分化的 脂肪前身細胞(3T3-L1 preadipocytes)內，可 以促進脂肪滴的生成與堆積，因此學者推測 perilipin 扮演調控脂肪滴分解與生成的角色 (Londos et al., 1995)。
Adipose differentiation-related protein (ADRP)是另一種位於初形成的脂肪滴表面 的蛋白質。在脂肪前身細胞、MA-10 Leydig cells, chinese hamster ovary(CHO) fibroblasts 及 human hepatoma (Hep G2) cells 等細胞的 脂肪滴表面也被發現有 ADRP，學者們推測 可 能 具 有 保 護 新 形 成 的 脂 肪 滴 之 功 能 (Brasaemle et al., 1997)。
另外，在大白鼠的腎上腺皮質細胞與倉 鼠 的 睪 丸 間 質 細 胞 中 發 現 的 被 囊 蛋 白 質 (capsular proteins)，也是位於脂肪滴表面。
進一步發現當細胞受到脂質分解的荷爾蒙 刺激時，被囊蛋白質會藉由分佈位置的改變 而調控脂質之水解(Wang and Fong, 1995;
Fong et al., 1996; Fong and Wang, 1997)。在
脂肪前身細胞中也有被囊蛋白質的存在，可 能負責穩定初生成的脂肪滴(Wang et al., 1997)。目前對脂質分子如何進出脂肪滴的 機轉尚未明瞭，可能還有其他的脂肪滴表面 蛋白質存在(Londos et al., 1999)。
肌動蛋白普遍存在於真核細胞內，是構 成細胞骨架中肌動蛋白絲的主要蛋白。已知 肌肉組織中為 alpha 型；其他種類細胞以 beta 或 gamma 型 為 主 要 (Vandekerckhove and Weber, 1978)。根據先前許多的研究顯示，
肌動蛋白絲會與細胞膜連結，因此具有維持 細胞形狀、參與細胞運動及細胞間連結的功 能(Geiger, 1983; Jacoson, 1983)。而肌動蛋白 質連結細胞膜的方式可能經由一些連結蛋 白質(actin-binding proteins)，如 alpha-actinin (Rotman et al., 1982)、vinculin (Otto, 1990) 與 talin (Burrige and Cornell, 1983)；或是直 接與脂質連結(Gicquaud, 1995; Bouchard et al., 1998)。同樣由脂質構成的細胞內脂肪滴 而言，肌動蛋白是否與其連結則尚未有文獻 報導。
歸納以上所述理由，我們推測脂肪滴表 面可能有肌動蛋白存在。因此本實驗選用大 白鼠副睪旁的脂肪組織及腎上腺皮質為材 料，因為這兩種組織的細胞內含豐富脂肪 滴，並且易於分離純化。首先分離出細胞內 之脂肪滴，以生化方式檢測是否有肌動蛋白 並存。進一步做細胞培養，利用免疫螢光染 色觀察細胞內肌動蛋白的分佈位置。並分別 利用藥物 dibutyryl cAMP 促使脂質水解，而 後觀察脂肪滴的形態以及其表面肌動蛋白 分佈位置的變化。相信對脂質代謝的機轉能 有更深入的了解。
三、結果
在顯微鏡下觀察從腎上腺皮質細胞中 分離出來的脂肪滴比從脂肪細胞中分離出 的脂肪滴小(圖 1)。以抗肌動蛋白的多株抗
體進行免疫染色顯示脂肪滴周邊出現明亮 的螢光反應(圖 1B 與 D)。推測兩種細胞分 離出的脂肪滴表面皆有肌動蛋白附著。
利用電泳及免疫轉漬分析肌動蛋白的 型式。已知肌原纖維內的肌凝蛋白(200 KD) 與肌動蛋白(43 KD)含量非常豐富(圖 2A 中 lane 1)；腎上腺皮質細胞及脂肪細胞內有許 多的蛋白質伴隨脂肪滴一起被分離出(圖 2A 中 lane 2 及 lane 3)，其中皆有一分子量為 43 KD 的蛋白質(圖 2A 中星號)。免疫轉漬結果 顯示此蛋白質被抗貝他型肌動蛋白抗體標 示；而肌原纖維內的 alpha 型肌動蛋白則未 被標示(圖 2B)。未加一級抗體的對照組則皆 無免疫反應(圖 2C)。
由二次電泳及免疫轉漬的結果發現腎 上腺皮質細胞(圖 3A 與 C)或是脂肪細胞(圖 3B 與 D)中附著於脂肪滴的確實為貝他型肌 動蛋白(43 KD)。
培 養 的 腎 上 腺 皮 質 細 胞 經 甲 醇 固 定 後，脂肪滴成空泡狀(圖 4A 中箭頭)。抗貝 他型肌動蛋白的抗體標示出絲狀的 stress fibers(圖 4B 中箭號)，同時也染到脂肪滴周 邊(圖 4B 中箭頭)。未加入一級抗體的對照 組沒有螢光反應(圖 4C 與 D)。
另外再以 FITC-phalloidin 標示，染出絲 狀的 stress fibers (圖 5B 中箭號)，脂肪滴表 面卻沒有被標示。此結果顯示脂肪滴表面的 肌動蛋白應為顆粒狀而非絲狀構造。
以藥物 dibutyryl cAMP 刺激細胞二小 時與四小時後，發現隨著時間增長，脂肪滴 有逐漸變小的情形(圖 6 中箭頭)。絲狀的 stress fibers 有變少及變短且集中在細胞邊 緣的現象，脂肪滴週邊皆沒有明顯的螢光反 應(圖 6B 與 D)。
四、討論
先前已有研究報導腎上腺皮質細胞及 睪丸間質細胞內脂肪滴以及富含脂質代謝
酵素的粒線體皆會與 vimentin 中間絲的細 胞 骨 架 相 連 結 (Almahbobi et al., 1992;
1993)。若是以藥物 acrylamide 破壞 vimentin 中間絲時，固醇物的產量會上升。學者推測 因為脂肪滴與粒線體兩者的距離縮短所致 (Shiver et al., 1992)。此外，在脂肪前身細胞 分化轉變成脂肪細胞時，細胞內初生成的脂 肪 滴 有 被 vimentin 中 間 絲 圍 繞 的 情 形 (Franke et al., 1987)。這些研究顯示屬於細胞 骨架的 vimentin 蛋白質似乎也會與脂肪滴 連結，並且影響脂質代謝。
另 一 方 面 的 研 究 指 出 ， 以 藥 物 cytochalasins 破壞腎上腺細胞內的肌動蛋白 絲時，ACTH 所引發的固醇物合成作用也會 被抑制。進一步發現是脂肪滴中釋出的膽固 醇 無 法 運 送 到 粒 線 體 內 轉 化 成 固 醇 物 所 致。此報告顯示肌動蛋白絲可能參與脂質之 運送(Mrotek et al., 1977; Hall et al., 1981)。
此外以抗肌動蛋白抗體或 DNase I 干擾細胞 內舊有或新生成之肌動蛋白時，膽固醇運送 到 粒 線 體 的 現 象 也 會 被 抑 制 (Hall, 1995;
1997)。這結果則顯示細胞內必須維持一定 數量的肌動蛋白來幫助脂質的運送。
我們的研究發現不論是腎上腺皮質細 胞或脂肪細胞的脂肪滴表面皆有顆粒狀的 貝他型肌動蛋白附著。此兩種細胞的生理功 能不同，脂質代謝的機制相似，因此推測肌 動蛋白可能廣泛存在於各種組織細胞的脂 肪滴表面。
以藥物 dibutyryl cAMP 促進脂質分解 時，脂肪滴被分解變小，且位於脂肪滴表面 的貝他型肌動蛋白會離開脂肪滴表面游離 在胞質中。推測游離的肌動蛋白可能幫助從 脂肪滴中分解釋出的脂質運送至粒線體或 其他胞器以利脂質代謝的進行。至於脂質與 肌動蛋白之間是直接或間接連結則需進一 步實驗證實。
五、計畫成果自評
本次研究內容與原計畫相符，發現兩種 不同種類的細胞其脂肪滴表面皆有貝他型 肌動蛋白存在。此項發現對細胞內脂質的運 送機制或代謝方式的探討極具學術價值。這 一部份成果已發表在 BBRC 289: 1168-1174, Dec. 2001。
另一方面，利用藥物刺激細胞後的變化 也顯示與脂肪滴連結的貝他型肌動蛋白可 能具有調節脂質代謝之功能。目前正積極從 事其他藥物刺激的結果分析(如 cytochalasin D)，相信不久將有更進一步的成果展現。
六、參考文獻
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