摘要 分離自囊胚內細胞群的胚幹細胞，為一種具分化多能性的細胞。在適當 的體外培養條件下，胚幹細胞可維持其未分化的特性並且大量增殖或自我更 新。而此自我更新而不進入分化程序的機制，咸認為與其轉錄因子 Oct-3/4 的表現有關。胚幹細胞在體外培養下可自發性分化，亦能以人為操作誘發分 化，成為構成胚體包括內胚層、中胚層和外胚層等胚層的組織進而形成個體 的各種組織、器官的細胞系。而胚幹細胞一旦分化，其 Oct-3/4 的表現即無法 檢出。雖然胚幹細胞在組織工程、治療性移植、基因治療等方面的醫療應用 具有相當潛力，基於人道與倫理道德考量，人類胚幹細胞引回成體組織中進 行功能重建的醫療移植方面的研究，因限於無法精確誘發或導引其分化為具 有某單一特定型態與功能的成體細胞；而且直接將胚幹細胞移植入人體，也 有無法追蹤控制和避免惡質化成為癌細胞的危險。本計畫在人道與醫學倫理 的考量之下，企以生理解剖構造和人類相近的豬隻為對象，利用本計畫申請 人已掌握的豬胚幹細胞相關技術，進一步以標的基因轉殖建立具 Oct-3/4-水 母螢光蛋白質複合基因的基因轉殖胚幹細胞株，以探討胚幹細胞的分化現象 和胚幹細胞進入分化程序的基因表現和其遺傳調控機制；期能建立一個可供 探討人類胚幹細胞分化啟動、分化方向的調控、細胞組織工程、治療性移植、 新藥測試和基因治療的動物模式。 關鍵辭：豬、胚幹細胞、標的基因轉殖、分化。
一、前言
分離自囊胚內細胞群的胚幹細胞，為一種未分化且具有分化多能性 （pluripotency）的細胞（Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981; Robertson,
1987）。在適當的體外培養條件下，胚幹細胞可以維持其未分化的特性並且大 量裂殖（proliferation）或自我更新（re-new），株化成為具有相同而且穩定的 染色體組之胚幹細胞株系（clone）。胚幹細胞在體外培養的環境下，如果條 件適當時，可以產生自發性的分化，也能夠利用培養條件的改變或藥劑的添 加以誘發分化。以囊胚注射（blastocyst injection）或與胚細胞集聚（aggregation） 等方式引回胚體之後，可以參與胚體包括內胚層、中胚層和外胚層等各個胚 層 的 組 織 形 成 ， 在 體 內 分 化 成 為 組 成 個 體 的 各 種 組 織 、 器 官 的 細 胞 系 （lineages）而造成嵌合動物（chimera）。如果被引入的胚幹細胞參與性腺 （germline）的形成，則會造成嵌合動物的性腺嵌合現象，並且形成具有胚幹 細胞遺傳物質的生殖細胞（Khillan and Bao, 1997）。
雖然胚幹細胞在組織工程、治療性移植、標的基因轉殖等方面的醫療應 用具有相當的潛力，然而目前文獻顯示已經分離並且株化出胚幹細胞的哺乳 動物的物種卻僅有小鼠（Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981）、豬（Chen et al, 1999a,b）和人類（Thomson et al. 1998）。從兩個非人類物種分離株化得到 的胚幹細胞，均經過體外分化能力測試，並均以通過利用囊胚注射引回胚體 產製嵌合體進行體內分化能力的檢測（Chen et al, 1999a,b ; Smith, 2001）。不 過，基於人道與倫理道德的考量，人類胚幹細胞並未以引回胚體進行嵌合體 產製之體內分化能力檢測（Thomson et al. 1998; Smith, 2001）。
小鼠是第一個被分離並建立胚幹細胞的物種（Evans and Kaufman, 1981;
Martin, 1981）。目前所積累的胚幹細胞相關的知識也都是建立在以小鼠幹細
胞為對象的研究上（Smith, 2001）。20 年來小鼠胚幹細胞科技的研究為人類 建立了很多有關遺傳學、生理學、胚胎學、甚至人類醫學方面中要的發現與 相關的知識資料基礎（Liegeois et al. 1996; Smith, 2001; Wobus, 2001）。但是， 由於小鼠與人類之間的物種歧異性所存在之體型、解剖構造、生理、胚胎發 育與生命期等方面的差異，當以小鼠用做為人類醫療模式動物時實會出現相 當的限制和困擾（Graves and Moreadith,1993）。甚至在某些在人類突變時會 導致嚴重遺傳缺陷的諸如 HPRT 與 CFTR 等基因，在小鼠方面卻無法建立出 相似的遺傳缺陷表現模式（Kuehn et al. 1987; Snouwaert et al.1992）。因此， 以體型、生理條件和臟器解剖構造相近於人類的之豬隻做為進一步發展胚幹 細胞科技的模式動物，提供有關人類組織工程、功能重建性移植醫療以及新 藥開發之試驗研究，或結合標的基因轉殖技術（Piedrahita et al. 1998; Vazquez et al. 1998）更精準有效地產製可以直接供作人類器官移植的基因轉殖豬，均 較小鼠的模式更適當（Moore and Piedrahita, 1997ab; Tu et al. 2001）。
哺乳動物等胚幹細胞自我更新而不進入分化程序的機制，咸認為是與轉 錄因子 Oct-轉錄因子的表現有關（Nichols et al. 1998; Niwa et al. 2000）。胚幹
細胞一旦進入開始分化的程序，其 Oct-轉錄因子的表現就顯著地降低到無法 檢出的程度（McWhir et al.1996; Nichols et al. 1998）。在本研究的計畫中，將 以訊息核糖核甘酸差異性顯示反轉錄聚合脢連鎖反應（messenger RNA differential display RT-PCR, Liang and Pardee, 1992），進行豬胚幹細胞分化啟 動有關之特異 cDNA 的分離與解析，並將序列分析所得的 DNA 序列編碼， 利用生物資訊資料庫的比對，以探討比較豬胚幹細胞分化前後特異基因的表 現。 二、研究方法與進行步驟 本計畫在醫學倫理的考量之下，企以生理解剖構造近似於人類的豬隻為 對象探討胚幹細胞的分化現象，探究胚幹細胞進入分化程序的遺傳機制；期 能建立一個可供做探討人類胚幹細胞分化啟動、分化方向的調控、細胞組織 工程、治療性移植、新藥測試和基因治療的動物模式。本研究擬進行的方法 與步驟將分年敘述如下。 第一年計畫（2002 年 8 月 1 日到 2003 年 7 月 31 日）： 由於胚幹細胞的分化程序啟動並不能由胚幹細胞的型態表現看出端倪，然而 胚幹細胞的 POU family 之 Oct-轉錄因子（octamer-binding transcription factor, Oct）表現程度的變化，卻可以提供相當明確的線索（Nichols et al. 1998; Niwa et
al. 2000）。因此，在第一年的計畫中，將著手進行豬胚幹細胞樣本的準備，並以
水母螢光蛋白質（Aequoria green fluorescent protein, GFP）報導基因的基因構築 測試豬胚幹細胞的基因轉殖最佳條件由於各種細胞基因轉殖的效率不同，在本計 畫第一年的工作中，將探討以電孔法、微脂粒媒介法等本計畫申請人已經在豬胚 幹細胞使用過的方式，進行豬胚幹細胞的標的基因轉殖。同時也比較各種方式的 操作便利性與轉殖的效率。 (一)豬胚幹細胞的取得與培養 1. 從豬的囊胚內細胞群分離培養豬胚衍生細胞：以畜產試驗所杜洛克與 蘭嶼豬的囊胚內細胞群為材料，與分讓自食品工業研究所之 STO 細 胞利用 10μg/ml 的 mitomycin C 去活而製做的供養層（feeder layer） 共培養。培養液則為以高葡萄糖配方的 DMEM 添加β-硫基乙醇、16% 胎牛血清、 MEN 非必需氨基酸、核甘酸混合液等配製成的 ESM （Chen et al. 1991b）。培養條件為 37℃，氣相條件為含 5﹪二氧化碳 的空氣。並依前報（Chen et al. 1999ab）的方式，定期更換培養液且 依照豬囊胚內細胞群衍生細胞的群落密度、大小與表型變化進行繼代
培養予以增殖（圖一）。
2. 豬胚幹細胞的株化：經培養後所衍生的豬囊胚內細胞群衍生細胞群 落，則依前報（Chen et al. 1999ab）以細胞表型、細胞標記表現與細 胞核型分析（包括染色體數與 G-banding）等分析檢驗予以篩選並株 化之。並選用具有幹細胞表型、胚幹細胞標記、染色體組正常且通過
體外分化能力檢驗，能夠形成 embryoid body 且可在體外分化成為組 成成體各種細胞系（圖二）的豬胚幹細胞株供進一步的研究之需。 （二）.豬胚幹細胞之基因轉殖轉殖操作 1. 以電孔法（electroporation）進行豬胚幹細胞之基因轉殖轉殖：係利 用瞬間高壓直流電電流脈衝，把用來進行插入的水母螢光蛋白質基 因及 neo 篩選基因之 pEGFP-N1 基因構築轉染到豬胚幹細胞。操作 的方式參考 Melkonyan et al.（1996）的方法，將生長旺盛的豬胚幹 細胞移除 ESM 後，用未加血清的 DPBS 清洗，再以胰蛋白脢離散後 以 Opti MEM（Gibco）將之重新懸浮，並調整細胞濃度到 4-5x105 /ml。 旋即取細胞懸浮液與含有 1.25%的 DMSO 與 20µg 的質體 DNA 的 Opti MEM 混合，使 400µl 的混合液中含有 1.4x105個細胞。混合液 裝入電擊槽並於室溫下靜置一分鐘後， 在 250 伏特的電壓下，分別 以 250µF、500µF、或 950µF 的電容條件進行電擊處理。電擊處理後 的豬胚幹細胞在 30 秒內以遠心分離的方式移除上液，並立即將豬胚 幹細胞以 ESM 重新懸浮後，置入於常規的豬胚幹細胞培養系統與 STO 細胞共培養。 2. 以微脂粒媒介轉染法（liposome-mediated transfection）進行豬胚幹細 胞之基因轉殖轉殖：先把豬胚幹細胞繼代培養在 96 孔的細胞培養盤 中，再依 lipofect AMINE（Gibco）之使用說明進行進行基因轉殖。 操作上先將質體 DNA 溶於含有 lipofect AMINE 的 Opti MEM 溶液 中，使之在室溫下形成 DNA-liposome complex。然後移除培養盤中 豬胚幹細胞的 ESM 培養液，以未加血清的 DPBS 清洗後加入 DNA- liposome complex。並於 37ºC 下培養三小時以進行基因轉殖。之後 再更換培養液為 ESM 於 37ºC 下培養。 （三）基因轉殖效率測定： 將以電孔法和經微脂粒媒介轉染法基因轉殖的豬胚幹細胞，分別以 螢光顯微鏡檢視，以比較不同基因轉殖方式與不同轉殖條件的效率。 三、 結果與討論 第一年研究進度報告（91 年 8 月 1 日起至 92 年 7 月 31 日） 在去年計畫核定後，於 91 年 8 月 1 日起迄今依照實驗進度，分別進行豬 胚幹細胞的分離培養與株化，以及豬胚幹細胞基因的轉殖條件測試等試驗， 今分述如下： 1. 豬胚幹細胞的取得、培養與株化：供胚母豬經每頭予肌肉注射 1000iu 之 孕馬血清激性腺素（pregnant mare serum gonadotropin, PMSG），並於 72 小時後再給與肌肉注射 750iu 之人類絨毛膜激性腺素（human chorionic gonadotropin, hCG）予以發情同期化處理，並以同品種之公豬配種，而 於配種後第七天以外科方式採胚。總計由 10 頭（八頭畜試一號黑豬與二
頭蘭嶼豬）採得共 91 個孵化囊胚，經以 STO 細胞利用 10μg/ml 的 mitomycin C 去活而製做的供養層（feeder layer）及以高葡萄糖配方的 DMEM 添加β-硫基乙醇、16%胎牛血清、 MEN 非必需氨基酸、核甘酸 混合液等配製成的 ESM（Chen et al. 1991b）共培養。培養條件為 37℃， 氣相條件為含 5﹪二氧化碳的空氣。並依前報（Chen et al. 1999ab）的方 式，定期更換培養液且依照豬囊胚內細胞群衍生細胞的群落密度、大小 與表型變化進行繼代培養予以增殖。經共培養後從畜試一號黑豬與蘭嶼 豬之囊胚分別分離到二個與一個具有典型豬胚幹細胞之細胞與群落表型 之細胞株。其繼代期間分別為三個月與六個月，其 doubling time 約為 18 到 24 小時。其未分化群落均表現正常的 alkaline phosphatase 活性， 且均具有正常的染色體組。 2. 豬胚幹細胞的體外分化測試：這三個細胞株經體外分化誘導的初步實驗 結果顯示，在懸浮培養下可以形成 embryoid body（圖四），且在進一步 的分化培養條件下具有強烈之分化形成神經細胞系（neural cell lineage）
之細胞的潛能（圖五與圖六）。
3. 轉殖基因的構築：
利用生物資訊學的方式，在網路上搜尋豬基因體學（genomics）和基因 定位（gene mapping）資料庫，已找出位於豬隻第九對染色體上 POU Oct-轉錄因子編碼基因在染色體上的位置，現已設計出引子進行選殖（表
一），以便進一步解構此段基因及其前後序列編碼，以便構築包括有
Oct-轉錄因子編碼與水母螢光蛋白質基因與 neo 篩選基因的人工合成基因。 即參酌 McWir et al. 1996 與 Han et al.（2001）的方式，將包括有 Oct3/4 基因完整的 promoter、enhancer 等 transcription element 和 5’-端編碼區的 D102 載體經 PCR 突變法在起始編碼子 ATG 後加入限制脢切點，以利 插入外源基因。用來進行插入的水母螢光蛋白質基因及 neo 篩選基因為 來自 pEGFP-N1 載體者（圖三）。這個載體為水母綠螢光蛋白質的一個 變異株，其 excitation 與 emission 的最大波長分別為 488 和 507nm （Clontech, cat. 6085-1）。將 pEGFP-N1 載體上 PFG 報導基因序列片段 以限制脢在適當的限制脢切點切下，並黏合到 D102 載體經 PCR 突變法 在起始編碼子 ATG 後加入限制脢切點，以得到在 Oct3/4 起始編碼子 ATG 後之後插入 PFG 報導基因序列的新載體。然後再於此新載體的兩端分 別切接與豬第九對染色體上 POU Oct-轉錄因子編碼基因前後兩端相同 的 DNA 序列，以完成本計畫進行豬胚幹細胞標的基因轉殖所需的 Oct-轉錄因子-水母螢光蛋白質複合基因構築（暫稱為 pGTOCTPFG）。 4. 豬胚幹細胞之基因轉殖轉殖操作
在進行豬之 POU Oct-轉錄因子編碼基因與其前後兩端相同的 DNA 序列 選 殖 ， 以 及 構 築 Oct- 轉 錄 因 子 - 水 母 螢 光 蛋 白 質 複 合 基 因 構 築 （pGTOCTPFG）之同時，亦以電孔法（electroporation）進行豬胚幹細
胞之基因轉殖轉殖測試。試驗係利用包含水母螢光蛋白質基因及 neo 篩 選基因之 pEGFP-N1 載體，經線性化處理後，以瞬間高壓直流電電流脈 衝，把這段基因構築送到豬胚幹細胞的染色體組。操作的方式參考 Melkonyan et al.（1996）的方法，將生長旺盛的豬胚幹細胞移除 ESM 後， 用未加血清的 DPBS 清洗，再以胰蛋白脢離散後以 Opti MEM（Gibco）
將之重新懸浮，並調整細胞濃度到 4-5x105
/ml。旋即取細胞懸浮液與含 有 1.25%的 DMSO 與 20µg 的 pEGFP-N1 質體 DNA 的 Opti MEM 混合，
使 400µl 的混合液中含有 1.4x105個細胞。混合液裝入電擊槽並於室溫 下靜置一分鐘後， 在 250 伏特的電壓下，分別以 250µF、500µF、或 950µF 的電容條件進行電擊處理。電擊處理後的豬胚幹細胞在 30 秒內以遠心 分離的方式移除上液，並立即將豬胚幹細胞以 ESM 重新懸浮後，置入 於常規的豬胚幹細胞培養系統與 STO 細胞共培養。初步結果顯示，電 擊後經 24 小時的培養，以 250µF、500µF、或 950µF 的電容條件進行電 擊處理，其存活率與表現 GFP 綠色螢光的細胞比率分別為 96%與 23%， 80%與 53%，16%與 56%。 本計畫為未經一次核定多年期之三年連續計畫，係自 91 年 8 月開始進 行。試驗之進展頗為順利，已經依進度建立了三個具有典型表型之豬胚幹細 胞株，並已證實這些胚幹細胞具有正常的核型與體外分化能力。另一方面， 也以 pEGFP-N1 質體 DNA 電孔法完成豬胚幹細胞的基因轉殖測試等試驗， 證實電孔法可以用在豬胚幹細胞之基因轉殖操作。目前正依計畫進度持續進 行豬之 POU Oct-轉錄因子編碼基因與其前後兩端相同的 DNA 序列選殖，以 利後續設計標的基因轉殖試驗所需的基因構築以完成第一年計畫中原先規劃 之目標。同時，並以接續進行第二年的研究計畫。
表一、 豬胚幹細胞 POU Oct-轉錄因子編碼基因選殖引子組 Primer list Sequence
Oct11-AR ATGGTGAATCTGGAGTCCAT Oct11-AL GCCTCAAATCGTGAGATGG Oct11-BR ATTAAGCTGGGCTTCACACA Oct11-BL TCAGTGGAGGTAGGTGGAA
圖一、 豬胚幹細胞之典型群落表型
圖二、 豬胚幹細胞體外分化所衍生的細胞型態： A. Epithelial-like；B. Endoderm-like；C.
Trophectoderm-like；D. Muscle-like；E. Fibroblast-like；F. Neural-like。
圖三、水母螢光蛋白質基因及 neo 篩選基因來源 之 pEGFP-N1 載體 圖四、豬胚幹細胞經懸浮培養分化誘導在體外 可形成 embryoid body
圖五、豬胚幹細胞經體外分化誘導處理，產生類似 neural sphere 的結構。
圖六、經體外分化誘導培養的豬胚幹細胞，衍生出具
四、參考文獻
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ABSTRACT
Mammalian embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells isolated from the inner cell mass of blastocysts. Under suitable conditions ES cells can be propagated in vitro to produce a large undifferentiated clonal population. Expression of transcription factor Oct-3/4 was highly related to the status of infinite proliferation without differentiation of the ES cells. When differentiation onset, either occurs spontaneously or induced, ES cells would cease the expression of Oct-3/4 and derived to all three primitive embryonic layers, which would then further differentiate into all somatic lineages of the body. Because ES cells can be genetically modified and selected in vitro without losing their pluripotency, these cells promise a potential approach for the development in tissue engineering, therapeutic transplantation, and gene therapy in humans. However, the ethical considerations of the establishment and application of human ES cell lines, and upon the shortage in the technologies for precisely trace and control of differentiation direction, as well as the oncogenesis possibility, when the ES cells are reintroduced into the human body, made these studies of human ES cells highly limited. The objective of this study was to establish genetically modified porcine ES (PES) cell lines by gene targeting with transgene encoded both Oct-3/4 and green fluorescent protein genes, based on the physiological similarity of pigs to human beings and the knowledge of porcine ES cell technology of the project applicant. By establishing and using these transgenic PES cell lines we can investigate the gene expression and genetic control of differentiation launch in the ES cells much more easily and precisely. Ultimately, the animal model established in this study will benefit the further development of human ES cell technology and its application in novel therapeutic strategies.
