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嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告
Design and synthesis of G-quartet binders and applications toward G-quadruplex structures
計畫類別:V 個別型計畫 □整合型計畫 計畫編號:CN-9617
執行期間:96 年 1 月 1 日至 96 年 12 月 31 日
計畫主持人:林敬涵 計畫參與人員:蕭泳助 執行單位:醫藥化學系
中華民國 97 年 3 月 24 日
嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告
Design and synthesis of G-quartet binders and applications toward G-quadruplex structures
計畫編號:CN9617
執行期限:96 年 01 月 01 日至 96 年 12 月 31 日 主持人:林敬涵
利用結構相似性的機制來設計出新型的分子環四合胜肽引朵 cyclo-tetra-[N-(1H-indol-5- carboxam-ide-3-yl)] (CTIn) 11,並進而探討其對 G-quadruplexes 部位癌細胞的生長。
簡介
許多的藥物和抗生素是作用在細胞的去氧核醣核酸 鏈上才能顯示其治療疾病的功能,核酸結合藥物作用在 去氧核醣核酸鏈的方法主要可分為四類;第一類為崁入 法(intercalation) , 第 二 類 為 凹 槽 結 合 法 (groove- binding) 。 前 兩 類 皆 屬 於 非 共 價 鍵 結 合 法 , 如 actinomycin D 和 chromomycin A3 (或 mithramycin))皆屬 於利用非共價鍵結合法的核酸結合藥物專一性 GpC 之 核酸結合藥物。 而第三類為共價鍵結合法 (covalent linkages),另外最後一類為切斷核酸鏈骨幹法 (DNA backbone cleavages)。這些藥物已經被主要是從細菌萃 取出來的,並且具有治療癌症的活性,其抗癌活性主要 是抑制細胞核酸的複製或是轉錄。本研究主要是設計一 種新型的配位體 cyclo-tetra-[N-(1H-indol-5-carboxamide- 3-yl)] (CTIn)11,其結構骨幹與鳥糞嘌呤(1)形成的 G- quadruplex(2,5)相似並預期可以與人類 G-quadruplex(4)作 用來抑制人類端粒酶(5-7)的作用及壓制c-Myc 的表現(8-
11). (圖一)
圖一
結果與討論
首先我們將化合物 1(5-nitro-1H-indole))溶於二甲基 甲醯胺(N,N-Dimethylformamide)中,隨後在氮氣與冰浴 的 條 件 下 緩 緩 加 入 三 氟 醋 酸 酐 (Trifluoroaceticanhydride),得到化合物 2。接著在鹼性 條件下將酸保護成benzyl group 3。(圖二)
圖二
緊接著將化合物 3 在(Zn/NH4Cl)條件下還原 NO2,得到amine compound。為了得到四吲哚結構,接 下來我們取化合物 4 與化合物 2 在(DCC/HOBt)條件 下進行 couple 反應,卻得到複雜與無法辨識的產物(圖 三)。
圖三
於是我們修正合成途徑,我們取化合物 2 在 SOCl2 條件下,將官能基修飾得到醯氯化合物 5。在分別得到 化合物 4 與 5 後,在鹼性條件下進行 couple 作用,成 功得到交聯產物 6(圖四)。
圖四
接著將化合物 6 在 H2/Pt 條件下進行氫化,卻得到 斷鍵與還原產物 4 與 8(圖五)。
圖五
我們認為應該是化合物 6 在微酸條件下,進行了水 解。於是我們在反應時加入了 NaHCO3,在鹼性條件下 進行氫化,成功得到產物 7。然後再與化合物 4 進行 couple 作用,得到三吲哚架構化合物 9。重複相同步 驟,我們成功得到四吲哚結構化合物 10(圖六)。
圖六
N
NO2
N
NO2 O
OH
N
NO2 O
OBn TFAADMF NaHCO3, BnBr
1 2 3
N
NH2 O
OBn
N
NO2 O
OH
Conplex Compound
+ DCC/HOBt
4 2
N NO2 O
OH
N NO2 O
Cl
SOCl2, reflux N
NH O
OBn O
N NO2
5
6 2
NaHCO3, 4
N NH O
OBn O
N NO2
N NH2 O
OH
H2/Pt N
NH2 O
OBn +
6 8 4
N NH O
OBn O
N NO2
N NH O
OBn O
N NH2 H2/Pt, NaHCO3
N NH O
OBn O
N HN O
N 6 7
NaHCO3, 4
O2N
N NH O
OBn O
N HN O N N O H
N O2N
9
10 N
NH R
O
N
HN O
N N O H
N R
11
在這整個實驗中,以結構相似物的理論來模擬鳥糞 嘌呤的四合體結構設計出新型的配位體藥物(CTIn)11,
這個結構不但是屬於新穎的設計結構,再者因為結構的 可修飾性,因此發展的潛力是可以預見的,更進一步來 說,因為結構的新穎和複雜,因此可以為各界提供一個 新的合成方式。再者,預期此以鳥糞嘌呤的特殊結構為 相似結構的化合物可以針對細胞做初步測試達到效果,
或者在經由結構上的再修飾達到新型藥劑的改良及開 發。
實驗部分
5-nitro-1H-indole-3-carboxylic acid (1)
將化合物 1(5-nitro-1H-indole) (10.0 g, 0.09 mol)溶於二甲 基甲醯胺(N,N-Dimethylformamide) (150ml)中,隨後在 氮 氣 與 冰 浴 的 條 件 下 緩 緩 加 入 三 氟 醋 酸 酐 (Trifluoroaceticanhydride) (21.4 g, 0.2 mol),此時會產生 白色煙霧並升高溫度。待穩定時改以油浴加熱迴流,大 約在 120-130℃反應二十四小時,反應由開始的黃色逐 漸變為橙棕色。待反應終了,慢慢回溫至室溫後,加入 二次水(500ml)以濾紙抽氣過濾,取其棕色固體以氫氧 化 鈉(Sodium hydroxide) ( 50g/200ml ) 溶 解 並 用 乙 醚 (Esther)與水萃取。取水層緩緩攪拌加入鹽酸水溶液,白 色固體慢慢析出,在經抽氣過濾後送烘箱烘乾得到化合 物 2 (19 g, 100%)。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ 7.74 (d, J= 9.0 Hz, 1 H), 7.81 (dd, J = 2.0, 2.0 Hz, 1 H), 8.25 (d , 1 H), 8.92 (d, J = 2.0 Hz, 1 H). 13C NMR (DMSO- d6)δ 110.02, 113.92, 117.18, 119.69, 125.28, 139.96, 140.97, 141.01, 143.70
Benzyl 5-nitro-1H-indole-3-carboxylate (2)
將化合物2(640 mg, 3.1 mmol)以二甲基甲醯胺(15ml)預 溶 後 , 加 入 碳 酸 氫 鈉(Sodium bicarbonate)(1.6 g, 19.0 mmol) 最 後 與 溴 化 甲 苯 (Benzyl bromide)(0.54mL, 4.5 mmol)室溫下反應18個小時顏色會由淡黃色變成橙色。
反應終了後加入二次水,並以乙酸乙酯(Ethyl acetate)進 行萃取,取有機層以硫酸鎂除水過濾後經過濃縮後,再 以正己烷少量洗滌三次,自然風乾後得到黃色半透明晶 體化合物3(828 mg, 90%)。1H NMR(500 MHz, CDCl3- d1) δ5.47 (s, 2 H), 7.18 (dd, J = 2.5, 1.5 Hz, 2 H), 7.37-7.43 (m, 4 H), 8.11 (d, J = 2.0 Hz, 1 H ), 8.22 (dd, J= 2.0, 2.0 Hz, 1H), 9.31 (d, J=2.0 Hz, 1H). 13C NMR(CDCl3-d1) δ 51.90, 111.14, 115.43, 117.74, 119,40, 120.21, 126.68, 126.98, 129.06, 129.48, 133.74, 139.50, 139.82, 139.85, 144.85, 174.66, 174.95
Benzyl 5-amino-1H-indole-3-carboxylate (3)
將 鋅 粉(Zinc powder)(32.7 mg, 0.5mmol) 與 氯 化 銨 (Ammonium choride)(17 mg, 0.162 mmol)在室溫下以甲 醇(Methol)(5ml) 內 攪 拌 , 隨 後 加 入 化 合 物 3(15.1 mg,0.051mmol)加熱迴流 4 小時,反應由白色變為綠 色。反應終了後以矽藻土(Celite)抽氣過濾最後經過管 柱層析法過濾分離(沖提系統 乙酸乙酯:正己烷=1:
1),濃縮抽乾溶液後得到黃色粉末化合物 4(10.3 mg, 78%)。1H NMR(500 MHz, CDCl3-d6)δ 5.28 (s, 2 H), 6.68 (dd, J = 2.5, 2.5 Hz, 2 H), 7.07 (d, J= 8.5 Hz, 1H) 7.15(d, J= 6.5 Hz, 2H) 7.26-7.36 (m, 4 H), 7.65 (s, 1H), 7.73 (d, J= 2.0 Hz, 1H). 13C NMR(CDCl3-d1) δ 27.43, 50.81, 107.27, 110.78, 113.53, 116.50, 126.90, 127.65,
128.11, 128.97, 131.58, 135.05, 135.90, 142.48, 192.99.
5-(5-nitro-1H-indole-3-carboxamido)-1H-indole-3- carboxylate (6)
先將化合物2做除水處理後加入3滴的二甲基甲醯胺最後 加入氯化亞硫醯(Thionlychloride)為溶劑進行反應加熱 約至70-80℃迴流,反應由一開始的白色逐漸轉變為黃 色。最後直接濃縮抽乾後得到黃色產物為化合物5。接 著不經純化先以二氯甲烷(Dichloromethane)預溶後加入 碳酸氫鈉攪拌數分鐘,待不再起泡後加入化合物2 (200 mg, 0.75 mmol)反應4小時,此時反應顏色會由淡黃色變 為深黃色。以矽膠乾填再經管柱層析法過濾(沖提系統 乙酸乙酯:正己烷= 1:4),濃縮得到黃色固體化合 物6。(242 mg, 53%)
5-(5-amino-1H-indole-3-carboxamido)-1H-indole-3- carboxylate (7)
將化合物 6 (50 mg, 0.11mg)以乙酸乙酯溶解,隨後加 入碳酸氫鈉最後再加入 Pd-10%C,以真空幫浦抽氣到 溶劑沸騰後充以氫氣,重複三次後攪拌反應一天。反應 結束以後,以矽藻土抽氣過濾得到深黃色固體化合物 7。(41mg, 88%)1H NMR(500 MHz, CDCl3-d1)δ5.25(s, 1 H ), 6.65(dd, J= 2.5, 2.5 Hz, 1H), 6.67(dd, J = 2.5, 2.5 Hz, 1 H), 6.9 (d, J= 1.5 Hz, 1 H), 7.07 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.12-7.15 (m, 3 H ), 7.20 (d, 2.5 Hz, 1 H), 7.25-7.34 (m, 3 H ), 7.64(s, 1 H ), 7.84 (d, J= 2.0 Hz, 1 H ), 8.09 (s, 1 H ).
13C NMR(500 MHz, CDCl3-d1) δ 27.46, 50.83, 55.03, 103.92, 105.63, 108.66, 110.92, 111.99, 112.77, 113.54, 116.69, 123.76, 126.83, 126.94, 127.60, 128.15, 128.99, 130.82, 131.71, 135.07, 135.83, 140.01, 142.98, 193.01 Benzyl5-(5-(5-nitro-1H-indole-3-carboxamido)-1H- indole-3-carboxamido)-1H-indole-3-carboxylate (9)
此重複了化合物 6 的合成方式.以預先合成的化合物 5, 濃縮再以二氯甲烷溶解待氣泡(二氧化碳),加入化合物 7(50 mg, 0.12mmol),經過過夜的時間後,經乾填(量多時 先以濾紙過濾) 以矽膠粉乾填再經管柱層析法過濾,
(沖提系統 乙酸乙酯:正己烷= 1:4)濃縮得到黃色 固體化合物9 (34mg, 46%)。
5-(5-(5-(5-nitro-1H-indole-3-carboxamido)-1H-indole-3- carboxamido)-1H-indole-3-carboxamido)-1H-indole-3- carboxylate (10)
在此重複了化合物 6 的合成方式.經乾填(量多時先以 濾紙過濾) 以矽膠乾填再經管柱層析法過濾,(沖提系 統 乙酸乙酯:正己烷= 1:4),濃縮得到黃棕色固體 化合物 10(31 mg, 46%)
致謝
本研究承蒙學校補助CN9617,在此特表謝意。
參考資料
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