Chart 226 EIMS (70 eV) spectrum of alkyl acetate (16)

十一、Fatty acid or ester 類化合物

Fatty acid or ester 類化合物廣佈於植物體內，在石斛中分到 5 個 此類化合物：alkyl acetate (16)、linoleic acid (13)、methyl and ethyl linolenates (3)和 octacosanyl hexadecanoate (2)；在臺灣金線連中，正 己烷的抽出物經 GC, GC/MS 檢測，結果如 Figure 4，主要以此類化 合物為主，在分離過程中，則有分離到化合物 linoleic acid (13)。

Alkyl acetate (16) 化學結構的決定

本化合物為白色油狀物，EIMS (Chart 226)顯示裂片有 m/z 336 [M-60]⁺，364 [M-60]⁺，392 [M-60]⁺和 420 [M-60]⁺，其它為直鏈烷基 的標準裂片。

Chart 226 EIMS (70 eV) spectrum of alkyl acetate (16)

氫譜(Chart 227)顯示δ0.68 (6H, t, J=6.4 Hz)為長鏈末端甲基之吸 收訊號，δ1.23 (br s)為長鏈 methylene 的吸收訊號，δ2.02 (3H, s)為 acetyl proton 的吸收訊號，δ4.03 (2H, t, J=7.6 Hz)為酯類(ester group) 旁 COOCH₂質子的吸收訊號。

碳譜(Chart 228)顯示δ14.1 為長鏈末端甲基碳的吸收訊號，δ 21.0- 32.0 為長鏈 methylenes 的吸收訊號，δ64.7 為酯類(ester group) 旁 COOCH2的吸收訊號，而δ171.2 為 acetyl carbon (C=O)的吸收訊 號。

綜合上述資料，確認此化合物為 alkyl acetate 的混合物，包含 tetracosyl、hexacosyl、octacosyl 和 triaconyl acetate。

Chart 227

(16)

Chart 228

(16)

Linoleic acid (13) 化學結構的決定

本化合物為淡黃色油狀物，經由 EIMS 光譜(Chart 229)顯示分 子量為 280。

IR 光譜(Chart 230)顯示在 3010 ㎝^-1為 C=C-H 的吸收 1712 為 carboxyl group (COOH)的吸收，2919 和 2856 為飽和碳氫(CH)的吸 收，1473、1445 和 1424 為雙鍵的吸收。

氫譜(Chart 232)顯示δ0.88 (3H, m)為末端甲基之吸收訊號，δ 1.25 (14H, br s)為 7 個 methylenes (CH₂)的吸收訊號，δ1.64 (2H, m)、

2.05 (4H, m)、2.35 (2H, t, J=7.5 Hz)和 2.77 (2H, t, J=5.7 Hz)分別為 H-3、H-8、H-14、H-2 和 H-11 的吸收訊號，而δ5.35 (4H, m)為 olefinic protons (H-9、H-10、H-12 和 H-13)的吸收訊號。

碳譜(Chart 233)顯示δ14.1 為末端甲基(C-18)的吸收訊號，δ 22.7-33.7 為 12 個 methylenes (CH2)的吸收訊號，δ 127.9、128.1、130.0 和 130.2 為 olefinic carbons 的吸收訊號，而δ180.3 為 carboxyl carbon 的吸收訊號。

綜合上述資料與文獻值⁽¹⁹⁶⁾比對，確認此化合物之結構為 9,12 (z,z)-octadecadienoic acid ，分子式為 C₁₈H₃₂O₂，又名為 linoleic acid。

其結構如下：

COOH CH

3 1 7 5

9

12 14 16

18

Chart 229 EIMS (70 eV) spectrum of linoleic acid (13)

Chart 230 IR spectrum of linoleic acid

Chart 231 UV spectrum of linoleic acid

Chart 232

Chart 233

Methyl and ethyl linolenates (3) 化學結構的決定

本化合物為淡黃色油狀物，經由 EIMS 顯示[M]⁺為 292 和 306。

IR 光譜(Chart 234)顯示在 2926 和 2863 cm^-1為飽和碳氫的吸收，

1710 cm^-1為 carbonyl group (C=O)的吸收，而 1256 cm^-1為醚基(C-O-C) 的吸收。

氫譜(Chart 235)顯示δ0.95 (t, J=7.5 Hz)為末端甲基之吸收訊 號，δ1.23 (t, J=7.2 Hz)和 4.10 (q, J=7.1 Hz)為 ethoxyl proton 的吸收 訊號，δ1.28 (br s)、1.60 (m)、2.02 (m)、2.26 (t, J=7.2, 7.6 Hz)和 2.28 (t, J=7.3, 7.7 Hz)為 methylenes (CH₂)的吸收訊號，δ 3.64 (s)為 methoxyl proton 的吸收訊號，而δ5.33 (m)為 olefinic protons 的吸收 訊號。

碳譜(Chart 236) 和 DEPT(Chart 237)顯示δ14.3 為 methyl (CH3) 的吸收訊號，δ20.5-30.0 為 methylenes (CH2)的吸收訊號，δ34.1 為 OCH2 的吸收訊號，δ 51.4 為 methoxyl (OCH3)的吸收訊號，δ127.1、

127.7、128.3、128.3、130.3 和 132.0 為 olefinic carbons 的吸收訊號，

而δ174.3 為 carboxyl carbon 的吸收訊號。

綜合上述資料與文獻⁽¹⁹⁷⁾比對，確認此化合物為 methyl linolenate 和 ethyl linolenate 的混合，分子式為 C₁₉H₃₂O₂和 C₂₀H₃₄O₂。其結構如 下：

COOR CH

3 1 7 5

9 12 15

18

R=CH₃ methyl linolenate R=C₂H₅ ethyl linolenate

Chart 234 IR spectrum of methyl and ethyl linolenate (3)

Chart 235

COOR CH₃ 3 1

7 5

9 12 15

18

R=CH₃ methyl linolenate R=C₂H₅ ethyl linolenate

Chart 236

Chart 237 DEPT135 spectrum of methyl and ethyl linolenate (3)

COOR CH

7 5

9 12 15

18

R=CH₃ methyl linolenate R=C₂H₅ ethyl linolenate

Octacosanyl hexadecanoate (2) 化學結構的決定

本化合物為白色油狀物，經由 EIMS 光譜(Chart 238)顯示分子 量為 648。

IR 光譜(Chart 239)顯示在 2920 和 2851 ㎝^-1為飽和碳氫的吸收，

1736 為酯類 carbonyl (C=O)的吸收，其它還有 1474、1187 和 716 等 吸收。

氫譜(Chart 240)顯示δ0.86 (6H, t, J=6.4 Hz)為 2 個末端甲基之吸 收訊號，δ1.23 (br s)為長鏈 methylenes (CH₂)的吸收訊號，δ2.27 (2H, t, J=7.5 Hz)為 carbonyl group 旁 CH₂COO 質子的吸收訊號，δ4.03 (2H, t, J=6.6 Hz)為酯類 ester group 旁 COOCH₂質子的吸收訊號。

碳譜(Chart 241)顯示δ14.1 為末端甲基碳的吸收訊號，δ22.7- 64.4 為 methylenes (CH2) 的吸收訊號，其中δ34.4 為 carbonyl group 旁 CH2COO 的吸收訊號，δ64.4 為酯類 ester group 旁 COOCH2的吸 收訊號，而δ174.0 為 carboxyl carbon (C=O)的吸收訊號。顯示為長 鏈酯類化合物，利用皂化反應(5% KOH/乙醇溶液) 4 小時後，得到 M⁺ 256 與 410 的化合物為 hexadecanoic acid 與 n-octacosanol，推定此 化合物為 16 個碳的酸與 18 個碳的醇所形成的酯類。

綜 合 上 述 資 料 與 文 獻 值⁽¹⁹⁸⁾比 對 ， 確 認 此 化 合 物 之 結 構 為 octacosanyl hexadecanoate，分子式為 C₄₄H₈₈O₂。其結構如下：

CH

(CH

)

CH

C O

OCH

(CH

)

CH

Chart 238 EIMS (70 eV) spectrum of octacosanyl hexadecanoate (2)

Chart 239 IR spectrum of octacosanyl hexadecanoate

CH

(CH

)

CH

C

O

OCH

(CH

)

CH

CH

(CH

)

CH

C O

OCH

(CH

)

CH

Chart 240

Chart 241

CH

(CH

)

CH

C O

OCH

(CH

)

CH

CH₃(CH₂)₁₃CH₂ C O

OCH₂(CH₂)₂₆CH₃

十二、Pyrimidine 類化合物

在連珠石斛中分離得到一個 pyrimidine 類之核酸化合物 uracil (34)，

這是首次於石斛屬植物中發現。

Uracil (34) 化學結構的決定

本化合物為無色針狀，經由 EIMS (Chart 242)顯示分子量為 m/z 112。

Chart 242 EIMS (70 eV) spectrum of uracil (34)

IR 光譜(Chart 243)在 3105 和 3040 cm^-1為 NH 的吸收，1716 和 1670 為 carbonyl C=O 的吸收。UV 光譜(Chart 244)在 206 和 259 nm (log ε：3.58 和 3.58)有最大吸收波長。

氫譜(Chart 245)顯示有 1 對不飽和質子(olefinic protons)的吸收訊 號，δ5.60 和 7.38，耦合常數 J=7.6 Hz，為 H-5 和 H-6。

碳譜(Chart 246)顯示有 4 個碳存在，δ101.7、143.6、153.6 和 167.4，其中δ101.7 和 143.6 為不飽和雙鍵 C-5 和 C-6，δ153.6 和 167.4 為 carbonyl carbon (CO)，C-2 和 C-4 的吸收訊號。

綜合上述資料，並與文獻⁽¹⁹⁹⁾比對，確定此化合物結構為 uracil，

分子式為 C4H₄N₂O₂。結構如下：

N N O

O H

H

2 4 5 6

Chart 243 IR spectrum of uracil (34)

Chart 244 UV spectrum of uracil (34)

Chart 245

Chart 246

十三、Sugar 類化合物

Ethyl â-D-glucopyranoside (44) 化學結構的決定

本 化 合 物 為 無 色 油 狀 物 ，positive FABMS (Chart 247) 顯 示 [M+Na]⁺在 m/z 231，[M+H]⁺在 m/z 209。

IR 光譜(Chart 248)在 3388 cm^-1 (broad)為 hydroxyls 的吸收，1076 cm^-1為醚基(C-O-C)的吸收。

氫譜(Chart 249)顯示在δ3.21-4.29 有吸收訊號，為類似糖(â-D- glucose)的吸收訊號，δ4.29 (1H, d, J=7.66 Hz)為糖上 H-1 的吸收訊 號，3.21 (1H, m)為 H-2 的吸收訊號，3.44 (2H, m)為 H-4 和 H-5 的吸 收訊號，3.65 (2H, m)和 3.93 (2H, m)為 H-6 和 H-7 的混合吸收訊號，

另外在δ1.25 (3H, t, J=7.10 Hz)為 1 甲基質子(H-8)的吸收訊號。COSY (Chart 250)顯示 H-1 和 H-2，H-5 和 H-6 以及 H-7 和 H-8 有相關。

碳譜(Chart 251)和 DEPT(Chart 252)及 HMQC(Chart 253)顯示有 8 個碳，包括 1 個 CH₃ (δ15.4)，2 個 OCH₂ (δ62.5 和 66.1)和 5 個 CH (δ 71.3、74.7、77.5、77.7 和 103.7)。再由 HMBC(Chart 254)可知 H-1 和 H-8 均與 C-7 (δ66.2)有長距離的相關，這說明了 1 號位置有 1 個 ethoxyl group。此外 H-2 與 C-3，H-3 和 H-5 與 C-4 也有相關。

綜合上述資料，並與文獻⁽²⁰⁰⁾比對，確定此化合物為 ethyl â-D- glucopyranoside，分子式為 C8H16O6。結構如下：

O

OCH

CH

OH

HOH

C HO

HO

7 8

3 2

4 5

6

Chart 247 positive FABMS spectrum of ethyl β-D-glucopyranoside (44)

Chart 248 IR spectrum of ethyl β-D-glucopyranoside

[M+H]⁺ [M+Na]⁺

O

OCH₂CH₃ OH

HOH₂C HO

HO ₃ ^{2 1} _{7 8}

4 5

6

Chart 249

Chart 250 COSY spectrum of ethyl β-D-glucopyranoside

Chart 251

Chart 252 DEPT spectrum of ethyl β-D-glucopyranoside (44)

Chart 253 HMQC spectrum of ethyl β-D-glucopyranoside (44)

Chart 254 HMBC spectrum of ethyl β-D-glucopyranoside (44)

十四、其它

Diethylene glycol (20) 化學結構的決定

本化合物為白色固體，氫譜(Chart 255)顯示在δ3.40 (br d, J=3.9 Hz)和 3.46 (br d, J=4.1 Hz)相互耦合，碳譜(Chart 256)顯示具有 2 支含 氧的吸收訊息δ60.7 和 72.5，經 DEPT(Chart 257)實驗顯示，此為 methylene group，而由 HMQC(Chart 258)顯示，可知此化合物碳氫的 關係。進一步的由文獻⁽²⁰¹⁾證實，本化合物為 diethylene glycol，此為 石斛屬植物首次分離。結構如下：

HOCH₂CH₂OCH₂CH₂OH

Chart 255

(20)

HOCH₂CH₂OCH₂CH₂OH

Chart 256

(20)

Chart 257 DEPT spectrum of diethylene glycol (20)

HOCH₂CH₂OCH₂CH₂OH

HOCH₂CH₂OCH₂CH₂OH

Chart 258 HMQC spectrum of diethylene glycol (20)

HOCH₂CH₂OCH₂CH₂OH

Anoectolide A

本化合物為無色油狀物，與化合物 3-hydroxybutanolide ⁽⁹⁵⁾具有類 似的結構。氫譜(Chart 259)顯示具有 9 個氫質子，碳譜(Chart 260)與 DEPT 實驗(Chart 263)顯示有 1 個 methyl (δ18.5 和 18.5)，2 個 methylenes (δ38.4 和 77.7)，2 個 methines (δ68.3 和 72.4)和 1 個四級 碳 (δ 179.1)， 其 中 δ 179.1 為 carbonyl 的 吸 收 訊 號 ， 比 化 合 物 3-hydroxybutanolide 多 2 個碳，經由 HMQC (Chart 264)和 COSY (Chart 261)光譜可推定為-OCH(CH₃)-的組合。HMBC (Chart 265)顯示 H-5 (δ 3.54)除了跟鄰位甲基的碳有長距離的關連外，並且與自己相對的碳有 關連，因此推定此化合物為雙體的結構。

FABMS 顯示本化合物具有 3-hydroxybutanolide 的離子裂片 m/z 103 (C4H7O3

+)，而且[M+H]⁺為 259，綜合上述(Table 44)推定本化合物 為 bi(3-O-ethoxybutanolide)，分子式為 C12H18O6，它是一個新的化合 物，命名為 anoectolide A。其結構如下：

O

O

O CH CH

CH

O O

O CH

1 2 3 4

5 6

Table 44. NMR spectral data of anoectolide A (42)

1

H

C COSY NOESY HMBC

1 C 179.1

2 CH2 2.83(dd, 17.8, 5.8) 2.36(d, 17.8)

38.4 H-2, H-3 H-2

H-2, H-3 H-2

C-1(J2), C-3(J2), C-4(J3) C-1(J2), C-3(J2), C-4(J3) 3 CH 4.56(m) 68.3 H-2, H-4 H-2, H-4 C-1(J3), C-4(J2) 4 CH2 4.43(dd, 10.0, 4.2)

4.21(d, 10.0)

77.7 H-4, H-3 H-4

H-3, H-4 H-4

C-1(J3), C-3(J2) C-1(J3), C-2(J3), C-3(J2) 5 CH 3.54(m) 72.4 H-6, H-7 H-6, H-7 C-3(J3), C-5(J2), C-6(J2)

6 CH3 1.13(d, 6.1) 18.5 H-5 H-5 C-5(J2)

Chart 259

Chart 260

O

O

O CH CH₃

CH

O O

O CH₃

1 2 3 4

5 6

O

O

O CH CH₃

CH

O O

O CH₃

1 2 3 4

5 6

O

O

O CH CH

CH

O O

O CH

1 2 3 4

5 6

Chart 261 COSY spectrum of anoectolide A (42)

Chart 262 NOESY spectrum of anoectolide A (42)

Chart 263 DEPT spectrum of anoectolide A (42)

Chart 264 HMQC spectrum of anoectolide A

O

O

O CH CH₃

CH

O O

O CH₃

1 2 3 4

5 6

Chart 265 HMBC spectrum of anoectolide A (42)

Anoectolide B

本化合物為無色油狀物，與化合物 3-hydroxybutanolide ⁽⁹⁵⁾具有類 似的結構。氫譜(Chart 266)顯示具有 7 個氫質子，碳譜(Chart 267)顯 示有 6 個碳原子，3 個 methylenes (δ29.8、38.5 和 77.7)，1 個 methines (δ68.4)和 2 個四級碳(δ176.2 和 179.1)，其中δ179.1 為 butanolide 的 carbonyl 吸收訊號。本化合物比化合物 3-hydroxybutanolide 多 2 個 碳，包括 1 個 methylenes (δ29.8)和 1 個 carbonyl (δ176.2)，初步推 定為-COCH₂-的組合。HMBC (Chart 269)顯示 methylenes (δ29.8)除了 跟鄰位 carbonyl (δ176.2)的碳有長距離的關連外，並且與自己相對的 碳有關連，因此推定此化合物為雙體的結構。

FABMS 顯示本化合物具有 3-hydroxybutanolide 的離子裂片 m/z 103 (C4H7O3

+)，而且[M+H]⁺為 287，綜合上述(Table 45)推定本化合物 為 bi(3-O-acetoxybutanolide)，分子式為 C12H14O8，它是一個新的化合 物，命名為 anoectolide B。其結構如下：

1 2 3 4

5 6

O O

O O C CH

O

CH

O O

O C

Table 45. NMR spectral data of anoectolide B (43)

1

H

C HMBC

1 C 179.1

2 CH₂ 2.81(dd, 17.8, 5.9) 2.35(d, 17.8)

38.5 C-1(J₂)

C-1(J₂), C-3(J₂), C-4(J₃) 3 CH 4.55(m) 68.4 C-1(J₃), C-4(J₂) 4 CH₂ 4.41dd, 10.0, 4.2)

4.21(d, 10.0)

77.7 C-3(J₂)

C-1(J₃), C-2(J₃), C-3(J₂)

5 C 176.2

6 CH 2.56(s) 29.8 C-5(J₂), C-6(J₂)

Chart 266

Chart 267

1 2 3 4

5 6

O O

O O C CH

O

CH

O O

O C

1 2 3 4

5 6

O O

O O C CH

O

CH

O O

O C

Chart 268 HMQC spectrum of anoectolide B (43)

Chart 269 HMBC spectrum of anoectolide B (43)

第二節 抗發炎及抗過敏之藥理活性

一、連珠石斛粗抽物之抗發炎及抗過敏試驗

1.嗜中性白血球去顆粒作用試驗

Table 46 顯示，連珠石斛正己烷粗抽物(DNH)、乙酸乙酯粗抽物 (DNE)和甲醇粗抽物(DNM)，其濃度在 10 ìg/mL 下，對於 fMLP 引發 嗜中性白血球釋放 â-glucuronidase 和 lysozyme 的體外試驗，均有顯 著抑制作用(P<0.01)，其中對嗜中性白血球釋放 â-glucuronidase 抑制 作用的 IC₅₀ 分別為 9.8、3.2 和 34.1 ìg/mL，對嗜中性白血球釋放 lysozyme 抑制作用的 IC₅₀分別為 14.8、2.6 和 43.7 ìg/mL。由此試驗 顯示，連珠石斛 3 種粗抽物的抗發炎活性，其大小依次為：連珠石斛 乙酸乙酯粗抽物(DNE)>連珠石斛正己烷粗抽物(DNH)>連珠石斛甲 醇粗抽物(DNM)。

Table 46. Effect of extracts of D. nakaharai on the release of β

Drugs ( µ g/mL) Percent Release

β -glucuronidase (%inh) lysozyme (%inh)

Control 25.4±1.0 -- 58.9±0.8 --

DNH (3) 16.4±0.6** 35.5±1.2 42.2±2.5 16.1±1.6

(10) 12.5 ± 0.6** 50.8 ± 1.5 33.1 ± 5.8** 35.1 ± 8.2 (30) 1.8±0.7** 92.9±2.8 3.0±1.2** 94.3±2.2

IC

9.8±0.1 µg/mL 14.8±1.1 µg/mL

DNE (3) 14.1±0.6** 44.5±1.2 27.3±1.1** 45.5±1.8 (10) 4.1±1.3** 84.2±5.2 7.7±1.8** 85.1±2.7 (30) 0.05±0.4** 99.9±1.7 -0.6±1.3** 101.6±2.8

IC

3.2±0.5 µg/mL 2.6±0.6 µg/mL

DNM (10) 18.4±2.4* 27.9±6.9 38.6±3.6* 23.6±2.3

(30) 10.3±0.9** 59.5±2.0 25.3±2.0** 49.9±0.8 (100) 3.6 ± 1.4** 86.1 ± 5.4 9.0 ± 3.0** 82.8 ± 5.0

IC

34.1±8.0 µg/mL 43.7±3.1 µg/mL

TFP (10 µ M) 28.7 ± 2.8 -10.9 ± 12.5 53.9 ± 2.7 -7.5 ± 4.8 (20µM) 14.6±1.8** 43.3±8.2 26.3±5.2** 48.4±4.5 (30µM) 9.9±1.5** 60.9±7.0 12.8±4.7** 74.9±8.6

IC

24.4±0.5 µM 22.8±0.5 µM

Neutrophil suspensions were preincubated at 37℃ with 0.5％ DMSO or test compounds for 3 min in the presence of cytochalasin B (5 µg/ml). Forty-five minutes after the addition of formylmethionyl- leucyl-phenyl-alanine (fMLP) (1 µM), the amount of β-glucuronidase and lysozyme in the supernatant were determined. Values are presented as mean ± S. E., N=3, * P<0.05, ** P<0.01.DNH: n-Hexane extract of D. nakaharai, DNE: Ethyl acetate extract of D. nakaharai, DNM: Methanol extract of D. nakaharai;

Trifluoperazine (TFP) (as positive control).

2.肥滿細胞去顆粒作用試驗

Table 47 顯示，連珠石斛正己烷粗抽物(DNH)對於 compound 48/80 引發肥滿細胞釋放 â-glucuronidase 和 histamine 的體外試驗，無 抑制作用，而連珠石斛乙酸乙酯粗抽物(DNE)在 30 ìg/mL 濃度下，

對於 compound 48/80 引發肥滿細胞釋放 â-glucuronidase 和 histamine 的體外試驗，有明顯抑制作用(P<0.01)，但是連珠石斛甲醇粗抽物 (DNM)對於 compound 48/80 引發肥滿細胞釋放 â-glucuronidase 的體 外試驗，需在 100 ìg/mL 濃度下，才有明顯的抑制作用。

Table 47. Effect of extracts of D.nakaharai on the release of β

Drugs (µg/mL) Percent Release

β-glucuronidase (%inh) histamine (%inh)

Control 32.6±1.1 -- 65.1±2.4 --

DNH (10) 30.4±1.7 6.8±2.3 56.9±3.8 12.7±2.6

(30) 29.6±0.4 8.8±4.3 57.8±2.8 11.2±2.5

DNE (10) 30.5±0.6 6.3±1.7 59.4±2.8 8.7±1.0

(30) 23.1±1.9** 29.3±4.3 45.6±3.9** 30.1±3.2 (100) 17.4±0.9** 46.6±3.6 31.8±1.2** 51.1±1.0

DNM (30) 30.4±0.7 6.4±4.0 64.0±3.9 1.8±2.2

(100) 24.9±0.7** 23.3±1.6 57.5±3.1 11.8±2.5 Mepacrine (10µM) 21.7±0.7** 33.1±4.2 55.7±2.0 14.8±2.9 (30 µ M) 9.7 ± 3.0** 70.4 ± 6.1 25.3 ± 2.4** 60.1 ± 3.0 (100µM) 0.8±0.5** 97.3±1.2 11.8±0.8** 82.0±1.4

IC

24.3±2.2 µM 43.8±1.9 µM

Mast cell suspensions were preincubated at 37℃ with 0.5％ DMSO or test compounds

for 3 min. Fifteen minutes after the addition of compound 48/80, the amount of

β-glucuronidase and histamine in the supernatant were determined. Values are presented

as mean ± S. E., N=3, * P<0.05, ** P<0.01; Mepacrine (as positive control).

二、DNE-I~DNE-VI 之抗發炎及抗過敏試驗

經由上述實驗結果，得知連珠石斛乙酸乙酯粗抽物(DNE)對抗發 炎及抗過敏活性有較佳的作用，進一步對連珠石斛乙酸乙酯粗抽物 (DNE)再做分離。DNE 再經 Sephadex LH-20 管柱層析分離，利用薄 層層析(TLC)比較合併為 6 個部分 DNE-I~DNE-VI (Scheme 15)，再進 行抗發炎及抗過敏活性試驗。

1.嗜中性白血球去顆粒作用試驗

Table 48 顯示，DNE-I~DNE-VI 濃度在 10 ìg/mL 下，對於 fMLP 引發嗜中性白血球釋放 â-glucuronidase 和 lysozyme 的體外試驗，均 有顯著抑制作用(P<0.01)，其中對嗜中性白血球釋放 â-glucuronidase 抑制作用的 IC₅₀分別為 10.1、4.0、1.9、1.4、9.2 和 40.0 ìg/mL，對 嗜中性白血球釋放 lysozyme 抑制作用的 IC₅₀分別為 12.7、2.8、1.5、

1.4、4.5 和 38.6 ìg/mL。由此試驗分別顯示其抗發炎活性。(對嗜中性 白血球釋放 â-glucu- ronidase 抑制作用的活性大小依次為：DNE-IV，

DNE-III，DNE-II DNE- V，DNE-I > DNE-VI；對嗜中性白血球釋放 lysozyme 抑制作用的活性大小依次為：DNE-IV，DNE-III，DNE-II，

DNE-V DNE-I > DNE-VI。) 2.肥滿細胞去顆粒作用試驗

Table 49 顯示， DNE-I~DNE-VI 在 30 ìg/mL 濃度下，對於 compound 48/80 引發肥滿細胞釋放 â-glucuronidase 和 histamine 的體 外試驗，均有明顯抑制作用(P<0.01)，其中 DNE-I~DNE-V 對肥滿細 胞釋放 â-glucuronidase 抑制作用的 IC50分別為 46.3、33.0、34.1、34.7 和 36.5 ìg/mL，而 DNE-II~DNE-V 對肥滿細胞釋放 histamine 抑制作 用的 IC₅₀分別為 35.9、34.3、31.7 和 36.1 ìg/mL。由此試驗分別顯示 其抗過敏活性。(對肥滿細胞釋放 â-glucuronidase 和 histamine 抑制作 用的活性大小依次為：DNE-II，DNE-III，DNE-IV，DNE-V> DNE-I，

DNE-VI。)

Table 48. Effect of the ethyl acetate extract of D. nakaharai on the release

β

Drugs (µg/mL) Percent Release

β-glucuronidase (%inh) lysozyme (%inh)

Control 28.5±1.1 -- 42.8±2.8 --

DNE-I (3) 18.7±1.0** 33.8±6.0 29.5±0.6** 30.4±5.0 (10) 12.8±0.6** 54.6±3.6 23.3±3.5** 44.7±9.7 (30) 5.9±1.0** 79.1±3.8 7.1±1.9** 83.2±4.7

IC

10.1±2.6 µg/mL 12.7±3.3 µg/mL

DNE-II (1) 20.5±1.7** 27.7±6.6 28.1±1.8** 33.8±6.2 (3) 14.9±0.6** 47.3±3.9 22.1±5.0** 47.5±12.9 (10) 4.0 ± 0.3** 85.7 ± 1.7 6.4 ± 2.6** 84.6 ± 6.3

IC

4.0±0.5 µg/mL 2.8±1.5 µg/mL

DNE-III (0.3) 21.9±0.4** 22.5±2.9 34.3±3.0** 19.2±8.6 (1) 17.9±0.7** 36.9±3.7 25.0±4.8** 41.1±11.8 (3) 9.0±1.5** 68.3±5.3 10.1±2.4** 76.8±4.9

IC

1.9±0.2 µg/mL 1.5±0.3 µg/mL

DNE-IV (0.3) 17.9±1.5** 36.5±6.5 28.1±3.2** 33.9±8.5 (1) 15.5±1.2** 45.0±5.7 24.1±4.4** 42.8±11.6 (3) 7.9±2.0** 71.6±7.9 9.4±5.0** 77.1±11.9

IC

1.4±0.5 µg/mL 1.4±0.6 µg/mL

DNE-V (1) 21.4±1.48** 24.3±6.7 30.1±3.0** 28.8±9.2 (3) 19.7 ± 0.3** 30.6 ± 3.0 23.8 ± 4.0** 44.2 ± 9.4 (10) 13.4±0.9** 52.3±5.0 5.7±5.2** 86.1±12.4

IC

9.2±1.3 µg/mL 4.5±1.7 µg/mL

DNE-VI (10) 20.9±1.3** 26.1±6.0 33.9±2.2** 20.3±6.1 (30) 17.7±1.0** 37.8±4.6 22.8±4.0** 46.0±10.3 (100) -0.5±2.6** 101.6±6.0 -0.9±1.9** 101.9±3.0

IC

40.0±3.0 µg/mL 38.6±6.0 µg/mL

TFP (3µM) 23.5±0.8 16.8±2.2 38.7±5.3 8.9±1.9

(10µM) 15.1±1.6** 44.9±8.6 29.7±6.8 28.0±6.1 (30 µ M) 3.2 ± 0.7** 88.6 ± 2.7 1.3 ± 2.2** 96.9 ± 4.1

IC

14.2±0.7 µM 16.0±0.9 µM

Neutrophil suspensions were preincubated at 37 ℃ with 0.5％ DMSO or test compounds

for 3 min in the presence of cytochalasin B (5 µg/mL). Forty-five minutes after the addition

of formylmethionyl- leucyl-phenyl-alanine (fMLP) (1 µM), the amount of β -glucuronidase

and lysozyme in the supernatant were determined. Values are presented as mean ± S. E.,

N=3, * P<0.05, ** P<0.01; Trifluoperazine (TFP) (as positive control).

Table 49. Effect of the ethyl acetate extract of D. nakaharai on the

β

Drugs (µg/mL) Percent Release

β -glucuronidase (%inh) histamine (%inh)

Control 55.8±0.3 -- 72.9±2.0 --

DNE-I (10) 41.3±1.1** 26.1±1.6 71.1±0.3 2.3±2.9 (30) 29.9±2.2** 46.5±3.8 61.8±1.1** 15.2±2.7 (100) 12.4 ± 1.5** 77.8 ± 2.9 44.9 ± 4.5** 38.4 ± 6.3

IC

46.3±2.5 µg/mL

DNE-II (10) 43.3±0.4** 22.4±1.2 60.7±1.1** 16.7±1.5 (30) 16.2±1.1** 71.0±2.0 25.1±1.1** 65.6±1.5 (100) 4.0±0.4** 92.8±0.7 0.9±0.6** 98.6±0.9

IC

33.0±0.3 µg/mL 35.9±0.8 µg/mL

DNE-III (10) 41.5±1.8** 25.6±2.9 60.9±2.5** 16.5±2.4 (30) 20.5±1.7** 63.2±3.2 21.0±1.9** 71.2±1.9 (100) 6.3±0.6** 88.6±1.0 0.2±0.4** 99.7±0.5

IC

34.1 ± 2.3 µ g/mL 34.3 ± 1.2 µ g/mL

DNE-IV (10) 42.3±0.5** 24.2±0.6 59.1±2.0** 18.8±2.7 (30) 17.5±1.1** 68.7±1.9 14.8±2.2** 79.8±2.6 (100) 7.9±0.3** 85.7±0.6 0.1±0.5** 99.8±0.7

IC

34.7±0.7 µg/mL 31.7±1.4 µg/mL

DNE-V (10) 43.4±3.8** 18.7±6.4 62.9±1.9* 13.5±4.5 (30) 17.2±3.5** 69.2±6.2 16.3±5.7** 77.2±8.1 (100) 5.9±1.0** 89.4±2.0 2.6±0.9** 96.3±1.3

IC

36.5±4.6 µg/mL 36.1±2.4 µg/mL

DNE-VI (30) 45.1±1.4** 19.2±2.7 61.1±4.4** 16.4±3.7 (100) 36.1±2.3** 35.3±3.9 53.5±2.6** 26.4±5.4 Mepacrine (10 µ M) 35.2 ± 1.7** 36.7 ± 2.4 52.5 ± 3.4** 29.3 ± 3.9 (30µM) 28.2±0.9** 48.9±2.2 40.5±2.4** 45.5±2.9 (100µM) 5.6±0.4** 89.7±0.9 10.8±1.3** 85.5±1.7

IC

32.5±1.7 µM 40.8±4.3 µM

Mast cell suspensions were preincubated at 37 ℃ with 0.5％ DMSO or test compounds

for 3 min. Fifteen minutes after the addition of compound 48/80, the amount of

β-glucuronidase and histamine in the supernatant were determined. Values are presented

as mean ± S. E., N=3, * P<0.05, ** P<0.01; Mepacrine (as positive control).

三、臺灣金線連粗抽物之抗發炎及抗過敏試驗

1.嗜中性白血球去顆粒作用試驗

Table 50 顯示，臺灣金線連正己烷粗抽物(Af-H)和乙酸乙酯粗抽 物(Af-E)，其濃度在 10 ìg/mL 之下，對於 fMLP 引發嗜中性白血球釋 放 â-glucuronidase 和 lysozyme 的體外試驗，均有顯著抑制作用 (P<0.01)，其中臺灣金線連正己烷粗抽物(Af-H)對嗜中性白血球釋放 â-glucuroni- dase 抑制作用的 IC₅₀為 5.3 ìg/mL，對嗜中性白血球釋放 lysozyme 抑制作用的 IC₅₀分別為 5.7 ìg/mL；臺灣金線連乙酸乙酯粗 抽物(Af-E)對嗜中性白血球釋放 â-glucuronidase 抑制作用的 IC50 為 13.4 ìg/mL；而臺灣金線連甲醇粗抽物(Af-M)要在 30 ìg/mL 濃度下，

對 fMLP 引發嗜中性白血球釋放 â-glucuronidase 和 lysozyme 的體外 試驗，才有抑制作用。由此試驗顯示，臺灣金線連可能具有抗發炎活 性，以正己烷粗抽物(Af-H)最好，其次乙酸乙酯粗抽物(Af-E)，而甲 醇粗抽物(Af-M)較差。

Table 50. Effect of extracts of A. formosanus on the release of β

Drugs (µg/mL) Percent Release

β -glucuronidase (%inh) lysozyme (%inh)

Control 32.9±0.5 -- 57.1±1.1 --

Af-H (1) 24.5±0.7** 25.7±1.4 47.2±2.5 17.3±3.0

(3) 21.1±0.8** 36.1±2.5 42.6±3.5* 25.5±5.3 (10) 7.5±0.9** 77.2±2.5 9.2±2.4** 84.0±4.0

IC

5.3±0.3 µg/mL 5.7±0.5 µg/mL

Af-E (3) 21.2±1.5** 35.7±3.7 39.1±4.2* 31.7±6.2 (10) 16.5±0.7** 49.7±3.1 33.9±1.6** 40.6±1.7 (30) 10.7 ± 0.6** 67.7 ± 1.5 28.8 ± 2.5** 49.5 ± 3.5

IC

13.4±0.4 µg/mL

Af-M (10) 25.0±1.0** 24.1±2.4 45.3±2.6 20.7±3.4 (30) 19.5±1.0** 40.9±3.0 40.9±2.6* 28.4±2.0 TFP (10µM) 36.4±2.8 -10.9±12.5 61.2±2.7 -7.5±4.8

(20µM) 18.5±1.8** 43.3±8.2 29.9±5.2** 48.4±4.5 (30µM) 12.5±1.5** 60.9±7.0 14.6±4.7** 74.9±8.6

IC

24.4±0.5 µM 22.8±0.5 µM

Neutrophil suspensions were preincubated at 37 ℃ with 0.5％ DMSO or test compounds

for 3 min in the presence of cytochalasin B (5 µg/mL). Forty-five minutes after the

addition of formylmethionyl- leucyl-phenyl-alanine (fMLP) (1 µM), the amount of

β-glucuronidase and lysozyme in the supernatant were determined. Values are presented

as mean ± S. E., N=3, * P<0.05, ** P<0.01.Af-H: n-Hexane extract of A. formosanus,

2.肥滿細胞去顆粒作用試驗

Table 51 顯示，臺灣金線連三種粗抽物對於 compound 48/80 引發 肥滿細胞釋放 â-glucuronidase 和 histamine 的體外試驗，抑制作用不 佳。

Table 51. Effect of extracts of A. formosanus on the Release of β

Drugs (µg/mL) Percent Release

β -glucuronidase (%inh) histamine (%inh)

Control 37.0±2.6 -- 53.4±2.8 --

Af-H (30) 26.8±0.6** 27.4±1.4 45.9±1.2 14.0±3.5 Af-E (30) 27.0±1.2** 26.7±5.1 43.5±0.9 18.5±0.8 (100) 26.2±0.6** 29.2±1.3 38.1±0.1** 28.6±1.4

Af-M (30) 31.4±0.4 14.8±3.8 49.8±2.4 6.6±6.2

(100) 33.0±2.0 11.0±2.5 51.7±2.7 3.1±6.3 Mepacrine (10µM) 24.6±0.7** 33.1±4.2 45.7±2.0 14.8±2.9 (20µM) 11.0±3.0** 70.4±6.1 20.7±2.4** 60.1±3.0 (30µM) 0.9±0.5** 97.3±1.2 9.7±0.8** 82.0±1.4

IC

24.3±2.2 µM 43.8±1.9 µM

Mast cell suspensions were preincubated at 37 ℃ with 0.5 ％ DMSO or test compounds for 3 min. Fifteen minutes after the addition of compound 48/80, the amount β -glucuronidase and histamine in the supernatant were determined. Values are presented as mean ± S. E., N=3, * P<0.05, ** P<0.01; Mepacrine (as positive control).

四、化合物之抗發炎及抗過敏試驗

由石斛、連珠石斛與臺灣金線連分離得到的化合物，進行抗發炎 及抗過敏活性試驗，其結果顯示於 Table 52 至 Table 60.

1. Denbinobin (11)抗發炎及抗過敏試驗

Denbinobin (11)在 1 ìM 濃度下，對於 LPS 於刺激巨噬細胞株 RAW 264.7 釋放 TNF-á 和 PGE₂ 之抑制試驗，有顯著的抑制作用 (P<0.01)，其抑制率分別為 62 和 43 %，但是在相同的條件下，對刺 激細胞釋放 NO 之抑制試驗，並無影響。而對於 LPS 及 IFN-ã 刺激小 神經膠總細胞株 N9 釋放 TNF-á 和 Nitrite 的作用，其抑制率分別為 70 和 44 %。此外，在 30 ìM 濃度下，對於 compound 48/80 引發肥滿 細胞釋放 â-glucuroni- dase 和 histamine 的體外試驗，亦有明顯抑制作 用(P<0.01)，其抑制率分別為 40 和 39 %。

2. Vanillin (38)抗發炎及抗過敏試驗

Vanillin (38)在 30 ìM 濃度下，對於 fMLP 和 PMA 引發嗜中性白 血球釋放超氧自由基(superoxide anion)的抑制試驗，具有抑制作用，

其抑制率分別為 38 和 52 %，其中對 PMA 引發嗜中性白血球釋放超 氧自由基抑制效果較佳，IC₅₀為 24.4 ìM。

3. p-Anisaldehyde (4)抗發炎及抗過敏試驗

p-Anisaldehyde (4)在 10-30 ìM 濃度下，對於 fMLP 引發嗜中性白 血球釋放超氧自由基的抑制試驗，有弱的抑制作用。

4. Nakaharain (25)抗發炎及抗過敏試驗

實驗顯示 nakaharain (25)無好的抗發炎和抗過敏活性。

5. 2,5-Dihydroxy-3,4-dimethoxyphenanthrene (28)抗發炎及抗 過敏試驗

2,5-Dihydroxy-3,4-dimethoxyphenanthrene (28)在 30 ìM 濃度下，

對於 fMLP 引發嗜中性白血球釋放 â-glucuronidase 和 lysozyme 的體 外試驗，均具有抑制作用，其中對於嗜中性白血球釋放 â-glucuronidase 的 IC₅₀ 為 20.5 ìM。 對 於 compound 48/80 引 發 肥 滿 細 胞 釋 放 â-glucuronidase 和 histamine 的體外試驗，有弱的抑制作用。對於 fMLP 引發嗜中性白血球釋放超氧自由基的抑制試驗，其 IC₅₀為 20.7 ìM。

另外對於 LPS 於刺激巨噬細胞株 RAW 264.7 釋放 NO 之抑制試驗，

則較弱。此外在較低濃度 10 ìM 時，對於 PMA 引發嗜中性白血球釋 放超氧自由基的抑制試驗，有 38 %的抑制作用。而對於 LPS 及 IFN-ã 刺激小神經膠總細胞株 N9 釋放 TNF-á 之抑制試驗，則較弱。綜合上 述試驗得知，28 對嗜中性白血球有抑制效果。

6. Vitexin (37)抗發炎及抗過敏試驗

Vitexin (37)在 30 ìM 濃度下，對於 fMLP 引發嗜中性白血球釋放 â-glucuronidase 和 lysozyme 的體外試驗，均具有抑制作用，其抑制率 分別為 42 和 38 %。此外在低濃度 1 ìM 下，對於 fMLP 引發嗜中性 白血球釋放超氧自由基的抑制試驗，具顯著的抑制作用，其抑制率為 33 %。綜合上述試驗得知，37 對嗜中性白血球所引發的發炎可能有 抑制效果。

7. Protocatechuic acid (33)抗發炎及抗過敏試驗

Protocatechuic acid (33)在 30 ìM 濃度下，對於 fMLP 引發嗜中性 白血球釋放 â-glucuronidase 和 lysozyme 的體外試驗，均具有抑制作 用，其抑制率分別為 33 和 36 %。此外在 10 ìM 濃度下，對於 fMLP 引發嗜中性白血球釋放超氧自由基的抑制試驗，具顯著的抑制作用，

其抑制率為 44 %。綜合上述試驗得知，33 對嗜中性白血球所引發的 發炎可能有抑制效果。

8. Uracil (34)抗發炎及抗過敏試驗

Uracil (34)在 30 ìM 濃度下，對於 fMLP 引發嗜中性白血球釋放 â-glucuronidase 和 lysozyme 的體外試驗，均具有抑制作用，其抑制率 分別為 35 和 32 %。而對於 fMLP 引發嗜中性白血球釋放超氧自由基 的抑制試驗，在較低濃度 3 ìM 下，即具顯著的抑制作用，其 IC50為 21.3 ìM。綜合上述試驗得知，34 對嗜中性白血球所引發的發炎可能 有抑制效果。

9. trans-â-Carotene (23)抗發炎及抗過敏試驗

trans-â-Carotene (23)在 30 ìM 濃度下，對於 fMLP 引發嗜中性白 血球釋放 â-glucuronidase 和 lysozyme 的體外試驗，具有抑制作用，

其抑制率分別為 25 和 38 %。

10. Linoleic acid 抗發炎及抗過敏試驗

Linoleic acid (13) 對 於 fMLP 引 發 嗜 中 性 白 血 球 釋 放 â-glucuronidase 和 lysozyme 的體外試驗，均具顯著抑制作用，IC50分 別為 18.4 和 19.8 ìM。

11. Pheophytin a (6)抗發炎及抗過敏試驗

Pheophytin a (6)在低濃度 10 ìM 下，對於 fMLP 引發嗜中性白血 球釋放 â-glucuronidase 和 lysozyme 的體外試驗，均具有抑制作用，

其抑制率分別為 25 和 40 %，但是較高濃度 30 ìM 下，其抑制作用減 弱為 16 和 32 %。此外在 30 ìM 濃度下，對於 LPS 於刺激巨噬細胞 株 RAW 264.7 釋放 TNF-á 之抑制試驗，具有 26 %抑制作用。這說明

6 可能具有弱的抗發炎活性。

Table 52. Effect of compounds on the release of β

Compounds (

M) Percent Release

β-glucuronidase (%inh)

lysozyme (%inh)

Control 26.4

0.8 -- 33.1

0.9 --

11

(10) 34.6

2.8 -30.8

7.4 40.9

5.8 -22.7

14.9

(30) 31.4±1.8 -18.7±3.7 36.4±4.8 -9.3±11.8

TFP (3) 29.2±2.8 -10.9±12.5 35.5±2.7 -7.5±4.8

(10) 14.8

1.8** 43.3

8.2 17.3

5.2** 48.4

4.5 (30) 10.0

1.5** 60.9

7.0 8.5

4.7** 74.9

8.6

IC

24.4±0.5 µM 22.8±0.5 µM

Control 32.5±0.4 -- 48.2±3.0 --

4

(10) 27.9

0.8 14.1

1.5 44.1

3.1 8.2

5.1

(30) 27.8

0.4 14.6

0.2 44.4

2.3 7.8

1.0

12

(10) 28.4±0.9 12.7±2.1 45.2±2.9 6.1±0.1

(30) 27.5±0.9 15.4±1.6 45.2±2.7 5.9±2.3

25

(10) 28.4

0.6 12.7

0.7 43.8

2.5 9.1

1.0

(30) 27.5

1.2 15.4

2.9 40.6

2.5 15.6

0.3

28

(3) 28.5±0.5 12.2±2.2 51.0±2.5 -6.0±1.6

(10) 23.8±0.8** 26.5±3.7 45.0±0.9 5.9±4.9 (30) 9.7

0.1** 70.2

0.8 26.5

0.7** 44.8

1.9

IC

20.5

0.7

M

33

(10) 25.4±1.3* 21.9±3.0 36.5±0.7 23.6±5.4

(30) 21.8±0.4** 32.9±2.3 30.3±1.3** 36.4±6.3

34

(10) 25.6

0.5* 21.1

1.2 39.7

1.5 16.7

7.8

(30) 21.3

1.6** 34.5

4.2 32.4

2.6** 31.8

9.0

37

(10) 22.5±0.9** 30.8±2.0 35.1±2.6* 27.1±2.6

(30) 18.9±0.3** 41.7±1.2 29.6±0.9** 38.2±2.1 TFP (3) 37.8

1.3 -14.6

12.7 56.7

4.0 -17.6

11.5

(10) 24.9

1.3** 21.3

11.4 39.4

1.9 17.5

3.1 (30) 3.7±0.4** 87.8±3.4 1.1±1.6** 97.3±4.9

IC

18.9±2.1 µM 18.3±0.9 µM

Control 22.0

0.4 -- 40.0

1.7 --

6

(10) 16.6

0.2* 24.5

2.2 24.2

3.4** 39.8

6.9

(30) 18.5±0.7 15.9±2.6 27.3±4.3** 32.4±7.9

13

(3) 16.5±0.6* 25.2±1.4 37.6±1.0 5.7±3.8

(10) 13.9

0.8** 37.1

2.3 31.5

1.4* 20.7

5.3 (30) 4.3

0.7** 80.8

2.9 7.3

4.0** 81.0

10.3

IC

18.4±2.7 µM 19.8±2.3 µM

23

(10) 20.4±0.5 7.4±1.0 34.1±2.4 14.7±5.4

(30) 16.4

0.1** 25.3

1.6 25.1

3.9** 37.7

8.1

TFP (3) 25.1

2.5 -14.5

7.2 40.4

1.8 -1.3

1.5

(10) 13.9±3.6** 36.8±6.2 34.9±2.6 12.7±1.2 (20) 5.8±2.1** 73.6±3.6 10.4±3.2** 74.3±5.1

IC

14.4

0.8

M 15.5

0.6

M

Neutrophil suspensions were preincubated at 37 ℃ with 0.5％ DMSO or test compounds

for 3 min in the presence of cytochalasin B (5 µg/mL). Forty-five minutes after the addition

of formylmethionyl- leucyl-phenyl-alanine (fMLP) (1 µM), the amount of β-glucuronidase

Table 53. Effect of compounds on the release of β

Compounds (µM) Percent Release

β -glucuronidase (%inh) histamine (%inh)

Control 29.5±1.1 -- 47.6±1.3 --

11 (10) 19.5 ± 2.3** 33.4 ± 5.4 33.1 ± 2.1** 30.5 ± 2.6 (30) 17.6±0.9** 40.2±2.1 29.1±0.5** 38.8±1.4 mepacrine (10) 19.5±0.7** 33.1±4.2 40.7±2.0 14.8±2.9 (30) 8.7±3.0** 70.4±6.1 18.4±2.4** 60.1±3.0 (100) 0.7±0.5** 97.3±1.2 8.6±0.8** 82.0±1.4

IC

24.3±2.2

M 43.8±1.9

M

Control 43.2±1.6 -- 56.6±2.0 --

4 (10) 39.1±4.1 9.9±6.2 48.5±4.8 14.6±6.6

(30) 38.8±0.5 10.2±2.4 48.5±2.1 14.5±1.4

12 (10) 42.6±0.5 1.2±3.3 51.5±4.2 9.2±5.51

(30) 37.4±2.3 13.6±2.3 45.1±2.5* 20.3±2.0 25 (10) 38.1 ± 1.3 11.7 ± 1.3 49.5 ± 2.2 12.7 ± 1.4 (30) 34.9±2.3 19.2±2.3 45.7±2.5* 19.4±1.6 28 (10) 41.6 ± 1.9 3.6 ± 1.8 52.2 ± 2.0 7.8 ± 1.4

(30) 30.1±2.0** 30.5±3.3 44.4±2.9* 21.7±2.6

33 (10) 42.7±2.5 1.3±2.2 51.1±3.1 9.9±3.2

(30) 38.2±1.7 11.3±4.3 44.6±3.0* 21.3±2.5

34 (10) 38.4±3.0 11.4±4.7 49.1±5.6 13.7±7.3

(30) 38.4±0.9 10.7±5.4 46.5±2.5 18.0±1.5

37 (10) 40.4±2.5 6.3±6.4 47.6±3.6 16.2±3.6

(30) 39.3±1.6 8.9±3.6 46.5±3.6 18.2±3.4 mepacrine (10) 29.9±0.6** 31.9±2.1 52.6±2.7** 24.6±4.1 (30) 18.2 ± 1.1** 57.8 ± 2.9 31.6 ± 3.4** 43.5 ± 4.2 (100) 5.9±0.8** 86.0±2.1 12.1±1.2** 78.2±1.4

IC

32.2±3.6

M 48.5±3.8

M

Control 21.2±0.1 -- 40.2±0.6 --

6 (10) 22.3±1.4 -5.1±6.6 38.3±1.3 4.6±4.1

(30) 22.8±1.7 -7.4±7.6 42.3±0.3 -5.3±2.4

13 (10) 21.1±0.3 0.5±1.1 34.0±1.1 15.3±3.1

(30) 18.7±0.3 12.0±1.1 41.2±0.6 -2.7±2.9

23 (10) 20.1±0.8 5.2±4.2 34.6±0.6 13.7±2.8

(30) 19.0±0.5 10.3±2.2 33.8±0.7 15.9±0.6 mepacrine (10) 16.2±1.5* 23.7±3.5 33.6±2.4 16.6±2.9 (30) 12.0 ± 1.1** 42.9 ± 2.9 25.7 ± 3.6** 35.8 ± 6.0 (100) 1.3±0.7** 93.7±1.9 4.4±1.3** 88.8±2.3

IC

42.0 ± 3.5

M 50.2 ± 4.5

M

Mast cell suspensions were preincubated at 37 ℃ with 0.5％ DMSO or test compounds for 3 min. Fifteen minutes after the addition of compound 48/80, the amount of β-glucuronidase and histamine activities in the supernatant were determined.

Values are presented as mean ± S. E., N=3, * P<0.05, ** P<0.01; mepacrine (as

positive control).

Table 54. The inhibitory effect of compounds on the superoxide

Compounds (

M) Superoxide Formation

nmol/10

cells/30 min (%inh) N

Control 2.39±0.28 -- 3

11 (3)

3.14

0.39 -31.6

9.8 3

(10) 3.42

0.46* -43.5

12.7 3

(30) 3.62±0.46** -52.7±17.8 3

TFP (3) 2.47±0.46 -3.2±5.9 3

(10) 0.72

0.08** 68.6

2.5 3

(30) 0.23

0.01** 88.5

3.3 3

IC

14.0±0.4 µM

Control 1.83±0.05 3

4

(10) 1.33

0.15* 27.7

6.3 3

(30) 1.33

0.14* 27.7

5.5 3

12

(10) 1.31±0.20* 28.9±9.0 3

(30) 1.15±0.24** 37.6±11.3 3

25

(10) 1.55

0.12 15.6

4.2 3

(30) 1.79

0.13 2.4

4.5 3

28

(3) 1.48±0.14 18.7±9.3 3

(10) 1.08±0.12** 40.8±7.2 3

(30) 0.75

0.08** 58.7

5.2 3

IC

20.7

3.6

M

33

(3) 1.15±0.18** 37.7±8.1 3

(10) 1.03±0.15** 43.9±6.5 3

34

(3) 1.15

0.04** 37.2

2.5 3

(10) 1.02

0.03** 44.1

3.2 3

(30) 0.82±0.06** 55.0±3.2 3

37

(1) 1.24±0.20** 32.7±8.7 3

(3) 1.06

0.13** 42.5

5.3 3

IC

21.3

4.3

M

TFP (3) 2.50±0.42 -30.2±11.7 3

(10) 1.09±0.28 40.5±11.1 3

(30) 0.11

0.06** 93.6

3.3 3

IC

12.9

1.0

M

Control 2.81±0.19 -- 3

6

(10) 2.46±0.13 11.8±6.6 3

(30) 2.47

0.16 11.2

8.2 3

13

(10) 2.83

0.02 -1.5

6.2 3

(30) 3.00±0.11 -7.4±3.3 3

23

(10) 2.87±0.16 -3.7±12.3 3

(30) 2.86

0.18 -3.3

12.3 3

TFP (3) 2.22

0.22 20.5

5.3 3

(10) 1.56±0.16** 42.9±2.8 3

(30) 0.05±0.02** 98.2±0.9 3

IC

13.0

0.3

M

Neutrophil suspensions were preincubated at 37 ℃ with 0.5％ DMSO or test compounds

for 3 min in the presence of cytochalasin B (5 µg/mL). Fifteen minutes after the addition of

fMLP (0.3

M), the absorbance of supernatant was determined at 550 nm. Values are

Table 55. The inhibitory effect of compounds on the superoxide

Drugs (µM) Superoxide Formation

nmol/10

cells/30 min (% inh) N

Control 2.35±0.01 -- 3

11 (10) 2.33±0.15 0.7±5.8 3

(30) 2.56±0.06 -8.8±2.7 3

TFP (3) 1.49±0.15** 36.4±1.6 3

(10) 0.64 ± 0.14** 73.1 ± 3.3 3

(30) 0.20±0.24** 91.1±2.7 3

IC

6.9 ± 0.7

M

Control 2.81±0.17 -- 3

4 (10) 2.45±0.27 13.5±5.3 3

(30) 2.17±0.41 23.7±13.4 3

12 (3) 2.20±0.12 21.3±3.7 3

(10) 1.50±0.12** 46.6±4.1 3

(30) 1.36±0.16** 51.8±5.5 3

IC

24.4±5.5

M

25 (10) 2.52±0.18 10.2±5.8 3

(30) 2.50±0.30 10.5±11.2 3

28 (10) 1.74±0.09** 37.7±5.4 3

(30) 2.14 ± 0.22 23.6 ± 8.5 3

33 (3) 2.66±0.19 4.1±11.0 3

(10) 2.45±0.18 11.9±9.5 3

34 (10) 1.50±0.09 9.3±10.4 3

(30) 2.30±0.14 16.1±13.7 3

37 (1) 2.52±0.25 8.7±13.5 3

(3) 2.36±0.28 14.2±14.2 3

TFP (3) 2.13±0.04 23.7±3.5 3

(10) 0.56±0.08** 79.2±4.3 3

(30) 0.22 ± 0.09** 91.9 ± 4.3 3

IC

9.7±1.1

Control 3.02 ± 0.20 -- 3

6 (10) 2.67±0.22 11.4±5.2 3

(30) 2.76±0.34 8.8±8.5 3

13 (10) 2.64±0.17 12.4±4.2 3

(30) 3.98±0.45 -38.3±3.3 3

23 (10) 2.68±0.24 10.0±11.1 3

(30) 2.83±0.23 6.4±2.7 3

TFP (3) 2.02±0.19** 32.5±8.6 3

(10) 0.74±0.15** 74.9±5.7 3

(30) 0.07±0.03** 97.6±0.9 3

IC

6.8±2.3

Neutrophils were pretreated with DMSO (as control) or test compounds at 37 ℃

for 3 min before stimulation with 3 nM of PMA for 15 min, the absorbance of

supernatant was determined at 550 nm. Values are expressed as means ± S. E.,

N=3.* P<0.05, ** P<0.01; Trifluoperazine (TFP) (as positive control).

Table 56. The inhibitory effect of compounds on the nitrite

Drugs (µM) Nitrite accumulation

µM (% inh) N

Control 46.6±0.4 -- 3

11 (1) 40.4±1.0 13.4±2.1 3

L-NAME (0.1mM) 35.9±1.0** 23.0±2.1 3

(0.3mM) 27.8±0.6** 40.3±1.2 3

(1mM) 18.6±0.9** 60.2±1.9 3

IC

0.68±0.01 mM

Control 46.9±0.1 -- 3

4 (10) 49.6±0.5 -5.8±1.2 3

(30) 47.0±0.1 -0.3±0.2 3

12 (10) 50.5±0.3 -7.7±0.7 3

(30) 49.2 ± 0.6 -5.0 ± 1.4 3

25 (10) 47.5±0.5 -1.2±1.2 3

(30) 45.8±0.6 2.3±1.3 3

28 (10) 47.5±0.3 -1.2±0.8 3

(30) 34.5±0.9** 26.4±1.9 3

33 (10) 49.1±0.3 -4.7±0.6 3

(30) 47.9±0.6 -2.0±1.4 3

34 (10) 48.9±0.4 -4.2±0.8 3

(30) 49.1±0.8 -4.7±1.7 3

37 (10) 49.3±0.6 -5.1±1.2 3

(30) 48.9±0.2 -4.2±0.4 3

1400W (0.1) 46.9 ± 0.2 -0.1 ± 0.5 3

(1) 31.0±0.4** 33.8±0.9 3

(10) 15.3±0.1** 33.8±0.9 3

IC

6.1±0.06 µM

Control 59.2±1.0 -- 3

6 (10) 57.9±2.0 2.1±3.4 3

(30) 58.3±1.8 1.5±3.0 3

13 (10) 56.3±1.1 4.9±1.8 3

(30) 50.6±0.8** 14.5±1.4 3

23 (10) 52.2±1.0* 11.8±1.8 3

(30) 48.9±1.2** 17.4±2.0 3

L-NAME (0.1mM) 48.4 ± 0.4** 18.3 ± 0.6 3

(0.3mM) 38.2±0.4** 35.4±0.7 3

(1mM) 25.1 ± 1.5** 57.4 ± 2.5 3

IC

0.72±0.06 mM

RAW 264.7 cells were pretreated with DMSO (as control) or test compounds at 37

℃ for 1 h before stimulation with 1 µ g/mL of LPS for 24 h. Values are expressed

as means ± S. E., N=3.* P<0.05, ** P<0.01; N

-Nitro-L-Arginine methylether

(L-NAME) and N-(3-Aminomethyl)benzylacetamidine, 2HCl (1400W) (as positive

control).

Table 57. The inhibitory effect of compounds on the nitrite

Drugs ( µ M) Nitrite accumulation

µM (% inh) N

Control 52.1±1.4 -- 4

11 (0.3) 52.0±1.1 0.1±2.2 4

(1) 43.7±0.3 16.1±0.5 4

(3) 28.8±1.0** 44.6±2.0 4

L-NAME (0.1mM) 42.6±1.0 18.3±3.1 3

(0.3mM) 21.1±0.4** 59.6±1.1 3

(1mM) 6.4±0.3** 87.7±1.1 3

IC

0.40±0.01 mM

Control 37.5±0.3 -- 3

4 (10) 38.1±0.2 -1.5±0.5 3

(30) 37.6±0.8 -0.2±2.3 3

12 (10) 39.4±0.7 -4.9±2.0 3

(30) 37.9±0.6 -1.1±1.8 3

25 (10) 35.3±0.5 5.9±1.4 3

(30) 32.1±0.6** 14.5±1.6 3

28 (10) 38.5±0.7 -2.7±1.8 3

(30) 36.8±0.8 1.7±2.2 3

33 (10) 39.3±0.5 -4.5±1.5 3

(30) 38.6±0.4 -2.7±1.2 3

34 (10) 37.8±0.7 -0.8±1.8 3

(30) 37.2±0.1 0.8±0.5 3

37 (10) 37.4±0.4 0.2±1.2 3

(30) 38.5±0.4 -2.5±1.1 3

1400W (0.1) 35.9±1.0 4.1±2.8 3

(1) 26.6±0.3** 29.1±0.9 3

(10) 13.0±0.1** 65.3±0.4 3

IC

6.6±0.1 µM

Control 46.3±0.5 -- 4

6 (10) 45.3±2.3 2.0±5.0 3

(30) 49.4±1.5 -6.8±3.4 3

13 (10) 47.6±0.6 -2.8±1.3 3

(30) 45.0±0.5 2.8±1.0 3

23 (10) 46.4±0.6 -0.3±1.4 3

(30) 46.9±0.2 -1.3±0.5 3

L-NAME (0.1mM) 40.2±1.3** 12.9±2.5 3

(0.3mM) 29.2±0.3** 36.2±0.6 3

(1mM) 22.5±0.4** 50.6±0.9 3

IC

0.84±0.01 mM

N9 cells were pretreated with DMSO (as control) or test compounds at 37 ℃ for 1 h before stimulation with 10 ng/mL of LPS plus 10 unit/mL of IFN-ã for 24 h.

Values are expressed as means ± S. E., N=3-4.* P<0.05, ** P<0.01; N

-Nitro-L-

Arginine methylether (L-NAME) and N-(3-Aminomethyl)benzylacetamidine, 2HCl

(1400W) (as positive control).

Table 58. The inhibitory effect of compounds on the TNF-á

Drugs (µM) % inhibition N

4 (30) -14.5±1.7 3

6 (30) 26.1 ± 3.8* 3

11 (1) 61.6±9.6** 3

12 (30) -8.3±0.4 3

13 (30) 15.3±2.9 3

23 (30) -1.1±2.4 3

25 (30) 7.4±1.6 3

28 (30) -48.2±5.7** 3

33 (30) -9.0±0.7 3

34 (30) 10.5±1.5 3

37 (30) -2.5 ± 3.8 3

dexamethasone (0.1) 22.0±4.2* 3

(1) 41.0±4.7** 3

(10) 49.9±1.7** 3

RAW 264.7 cells were pretreated with DMSO (as control) or test compounds at 37

℃ for 1 h before stimulation with 1 µ g/mL of LPS for 24 h. Values are expressed as means ± S. E., N=3.* P<0.05, ** P<0.01; dexamethasone (as positive control).

Table 59. The inhibitory effect of compounds on the TNF-á formation

Drugs (µM) % inhibition N

4 (30) -8.1±3.4 3

6 (30) 12.3±4.3 3

11 (3) 70.8±3.0** 3

12 (30) -2.2±0.5 3

13 (30) 15.0±2.3 3

23 (30) -2.2±3.9 3

25 (30) 25.4±2.5** 3

28 (10) 23.8 ± 9.1* 3

33 (30) -21.2±4.9 3

34 (30) -20.6±5.3 3

37 (30) -33.2±5.8* 3

dexamethasone (0.01) 20.1±6.1* 3

(0.1) 74.3±3.1** 3

(10) 82.0±3.8** 3

IC

0.25±0.14 µM

N9 cells were pretreated with DMSO (as control) or test compounds at 37 ℃ for 1 h before stimulation with 10 ng/mL of LPS plus 10 unit/ml of IFN-ã for 24 h.

Values are expressed as means ± S. E., N=3.* P<0.05, ** P<0.01; dexamethasone

Table 60. The inhibitory effect of compounds on the PGE

Drugs (µM) % inhibition N

6 (3) -1.5±1.8 3

11 (1) 43.5±50* 3

13 (3) -2.5 ± 0.3 3

23 (3) 6.1±1.2 3

dexamethasone (10nM) 37.5±14.2* 3

(30nM) 76.7±3.6** 3

(100nM) 98.4±0.2** 3

IC

29.7± 4.8 nM

RAW 264.7 cells were pretreated with DMSO (as control) or test compounds at 37 ℃

for 1 h before stimulation with 1 µ g/mL of LPS for 24 h. Values are expressed as

means ± S. E., N=3.* P<0.05, ** P<0.01; dexamethasone (as positive control).