行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告 ※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告

※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※

Immunolocalization of PDGF- α,β, and TGF-β in the relevant immunol cascade of delay type hypersensitivity induced by PDCM

豬皮膠原蛋白膜所引發之延遲型免疫反應中 PDGF- α,β ，TGF- β 之定位研究

※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※

計畫類別：□個別型計畫　　□整合型計畫 計畫編號：NS89－2314－B－038－050

執行期間：89 年 08 月 01 日至 90 年 07 月 31 日

計畫主持人：呂炫 教授 共同主持人：吳銘芳 教授 周幸華 助理教授 吳金俊 兼任講師

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

中文摘要：請於五百字內就本計畫要點作一概述，並依本計畫性質自訂關鍵詞。關鍵詞：豬

皮膠原蛋白膜; 巨噬細胞; 血小板誘導生長因子;轉換生長因子; 牙周再生

最近幾年，我們曾就可吸收之豬皮膠原蛋白膜(PDCM)，進行有關 biocompatibility, biodegradation，及對 osteopromotion 之效果．結果顯示 PDCM 用戊二醛(GA)交鏈化 以後，仍可保持其 biocompatibility，biodegradation，與非細胞毒性的特質。同時由 相關之體液性及細胞性之免疫研究顯示，GA 交鏈化可降低 PDCM 之免疫生成性，

而且於短期內(10-14 天)可引發延遲型過敏反應(delayed type hypersensitivity, DTH)．

因此我們也逐漸描繪出 PDCM 引起細胞性免疫反應之模式圖。由於在此 DTH 中，

Macrophages 所扮演之功能，目前於相關文獻中尚未完全明瞭．因此本研究專題仍以 12 隻 S.D.rats 為實驗對象，分 7.10.14 天之標本獲取，以 ABC 染色法針對 PDGF- (Platelet-derived growth factor-α/β)及 TGF-β(transforming growth factor-β)於兩組植入 膜片知組織進行定位並設計 semi-quantitation 之方法，以觀察於 PDCM 與 e-

PTFE(positive control)及控制組表皮與結締組織周圍 (A,B,C zone)所引起之細胞性免 疫反應中 PDGF-α/β與 TGF−β之分佈強度，並以 Wilcoxon Rank Sum test 進行統計分 析。結果顯示於 PDGF- α/β 方面，無論是或控制組之 A,B,及 C 區域之比較，於 7 天，

10 天，或 14 天皆無統計上之差異(P>0.05)，但 PDCM 與 e-PTFE 比較於控制組，無 論 PDGF-α或 PDGF-β都非常接近 P<0.05 之邊緣。 而於 TGF-β方面，則於第 7 天之 結締組織與膜片之界面處，PDCM 與 e-PTFE 兩組皆會引起較強之免疫染色反應，而 於第 10 天與第 14 天，則 e-PTFE 組之 A 區域(表皮層)與膜片界面之 TGF-β免疫染色 強度，與控制組產生統計上之差異性(P<0.05)。本實驗之結果顯示 PDCM 與 e-PTFE 對表皮或結締組織皆會刺激引發 PDGF 與 TGF-β之產生，於 GTR technique 中可能間 接引起 osteoblast activity 與 fibroblast activity，尤以 e-PTFE 更會引起鈣化之機轉，

最後可導致牙周組織再生之結果。根據所知，雖然可吸收性膠原蛋白膜已應用於牙

周臨床多時，但至今並沒有一個明確之機轉來解釋膠原白膜與牙周組織的關係，因

此藉由此研究計劃，希望能提供學界一個合理確實的答案．

英文摘要：

請於五百字內就本計畫要點作一概述，並依本計畫性質自訂關鍵詞。

Keywords：PDCM; macrophages; PDGF-α/β;TGF-β; periodontal regeneration

We have conducted several studies that are associated with the properties of PDCM. It was

concluded that cross-linked PDCM is a biocompatible, bioresorbable, and non-cytotoxic material. In

the study of humoral immunity and cellular immunity induced by PDCM, it was suggested that the

cross-linking effect of GA might reduce the humoral immunogenicity of PDCM. The early wound

healing (10-14 days) of cellular activity adjacent to PDCM belongs to delay type hypersensitivity

(DTH). We propose an inferential model for explanation of cellular immunity induced by PDCM,

however, the role of macrophages in the sequential cascade of this model is still ambiguous. The

subsequent study is to implant PDCM into the intra-muscular space of hind legs of 12 rats (Spraque

Dawley) to elicit DTH activity. With ABC method, the immunolocalization of PDGF- α and PDGF-

β, and TGF-β in the implanted wound were semi-quantitively measured in order to ensure the

hypothetical model of the cellular immunity elicited by PDCM. The results indicate that, as

compared to control group, the secretion of PDGF-α and PDGF-β around PDCM or e-PTFE do not

show any significant difference (P>0.05) during 7,10,14 days specimens when the data were analysis

with Wilcoxon Rank Sum test, but the P value is marginal. On the day 7, the intensity of TGF-β

immunohistochemical stain of both PDCM and e-PTFE group showed significant difference to

controlled group in the connective tissue zone (zone B). On the day 10 and day 14, e-PTFE group

presented a stronger TGF-β intensity than that of control group. It appears that both PDFE and e-

PTFE may stimulate surrounding cells to secret PDGF-α/β and TGF-β in the epithelium and

connective tissue of early healing wound. They may indirectly cause osteoblast activity and

fibroblast activity and achieve new tissue regeneration in the long run..

研究計畫之背景及目的：

當前臨床牙周病治療的目標, 已由牙周囊袋的消除和阻止牙周炎 性反應的進行,進而希望達到預期牙周組織的再生, 和牙齒功能的重建。 到目前為止, 已有許多 專家學者嘗試以各種不同的治療方法, 試圖達到牙周重建 (periodontal reconstruction)的目的

1

。 然而根據組織學上牙周再生的條件, 多數的研究結果仍然未能達到預期的目標或一致的結

果。

自1980年以來﹐已有數種生醫材料使用於牙周導引再生手術( guided tissue regeneration, GTR)

中

﹐以促進牙根分叉病變或牙周骨下缺損之組織再生﹔如鐵弗龍膜片﹑微孔過濾膜片

(Millipore filter)﹑多聚合乳酸膜片(polylactic acid)﹑多聚合酯酸膜片(polyglycolic acid)﹐與膠原 蛋白膜片等等。由文獻回顧可知，已有數位學者將膠原蛋白膜片以活體實驗的方式植入動物之 牙周骨缺損區

，證實各種動物膠原蛋白膜片確有引導結締組織再生及部份阻擋表皮細胞沿 牙根表面向下生長的能力。膠原蛋白對於牙周組織之纖維母細胞具有趨向性﹐並於傷口中可提 供空間架構﹐供血小板之附著﹐並可促進纖維素與血塊之聚集與成形﹔再者﹐動物膠原蛋白膜 片屬生物可分解之物質﹐於GTR手術後﹐可省略第二次抽取膜片之程序﹐因此日漸被廣為採用。

8

。

Quetish等人

與Hyder等人

分別提出研究相關膠原蛋白膜之報告，Quetish等人以人類之牙周 韌帶纖維母細胞(human periodontal ligament fibroblasts, HPLF)、牙齦纖維母細胞(human gingival fibroblasts, HGF)與由人體胎盤萃取出之膠原蛋白共同培養，結果發現此二種細胞可在膜片周圍 以與之成垂直的方向生長至膜片上。而Hyder等人

則以HPLF、HGF與由牛隻萃取出之膠原蛋 白共同培養，結果顯示此二種細胞數目皆有明顯之增加。這些結果都說明了上述兩種膠原蛋白 於非活體實驗中﹐對人類之牙周細胞確實具有高度生物相容性。因此我們也經由非活體實驗，

證明經特殊製備之PDCM對人類之牙周與牙齦纖維母細胞不具細胞毒性﹔而且吾人可經由戊 二醛之濃度來控制PDCM之酵素分解抗性

。 鑒於以上的研究結果, 顯示PDCM於牙周再生的 過程中, 具有biological barrier的作用。

Leibovitch和Ross

於1976年即曾對傷口中之巨噬細胞所扮演之角色做過研究﹔ 他們發現 於組織痊癒初期, 活化的巨噬細胞對纖維芽細胞的增殖是不可或缺的。 於1981年, Martin et al.

才以生化方式, 肯定巨噬細胞會分泌一種生長素(macrophage derived growth factor; MDGF); 此 種生長素現已肯定是一種遇熱不安定, 無法透析的縮氨酸類物質。 此種生長素可促進多種間質 細胞, 如纖維芽細胞, 內皮細胞, 或平滑肌細胞的增殖。 Terranova et al.

於最近(1988)亦曾提 出生化上細胞外間質和縮氨酸類生長素可能對牙周間質細胞之增殖和再附著於牙本質表面,有 正面的促進作用。由免疫學之觀點解釋，本研究PDCM周圍所產生之macrophages於DTH反應中 可能是扮演抗原呈現細胞（Antigen presenting cell, APC）的角色

。這些巨噬細胞於急性期 可能會釋放出某些cytokines，如TNF-α，PGE2，IL-1等等; 於慢性期則可刺激fibroblasts之增生 與膠原蛋白之生成，釋放PDGF(platelet derived growth factor)，可強效促進fibroblasts之增生，

而釋放TGF (transforming growth factor)，則可增強fibroblasts製造膠原蛋白，促進傷口之癒合。

因 此本研究專題仍以 12 隻 S.D.rats 為實驗對象，分 7.10.14 天之標本，以 ABC 染色法針對

PDGF(Platelet-derived growth factor)及 TGF−β(transforming growth factor-β)進行定位，以觀察於

PDCM 與 e-PTFE(positive control)周圍所引起之細胞性免疫反應，以確立上述模式圖羅輯之推

演中，PDCM 會引起 MHC class II complex reaction，並朝 Th1 cellular reaction 發展，最後可能

導致 osteoblasts 與 fibroblasts 活動升高，有助於牙周組織再生之結果。

PDCM

APC

Type2 Type2 CD

₄ ⁺

₈ ⁺

Type1 Type1 CD

₄ ⁺

₈ ⁺

(7-10 days after PDCM implantation)

1L-2, 1FN-

r

DTH

B-cell suppression MØ TGF

PDGF

Fibroblast Activity Osteoblast

Activity

Suppression

Of DTH

B-cell helper expansion

Destruction

(CD11b⁺, eg MØ , PMN) MHC ClassII-TCR

結果與討論

圖一、 顯示無論於手術植入後 7 天，10 天，14 天，PDCM 組與 ePTFE 組於 A zone (表 皮組織)， B zone (界面結締組織)， 與 C zone (非界面結締組織) 之 PDGF-α免疫染 色強度皆無統計上之差異(Wilcoxon Rank Sum test, P>0.05)。

圖二、

於手術植入後 7 天，10 天，14 天，PDCM 組與 ePTFE 組於 A zone (表皮組 織)， B zone (界面結締組織)， 與 C zone (非界面結締組織) 之 PDGF-β免疫染色強度

PDGF-α

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

7-A 7-B 7-C 10-A 10-B 10-C 14-A 14-B 14-C Rank Sum

Control PDCM ePTFE

PDGF-β

0 1 2 3 4 5 6 7 8

7-A 7-B 7-C 10-A 10-B 10-C 14-A 14-B 14-C Rank Sum

Control PDCM ePTFE

圖三、 於第 7 天之結締組織與膜片之界面處，PDCM 與 e-PTFE 兩組皆會引起較強之 免疫染色反應，而於第 10 天與第 14 天，則 e-PTFE 組之 A 區域(表皮層)與膜片界面 之 TGF-β免疫染色強度，與控制組產生統計上之差異性(P<0.05，indicated as *and#)。

討論

我們於 1994 年起﹐針對豬皮膠原蛋白膜(porcine dermal collagen membrane, PDCM) 進 行一連串的試驗

。在先遣之活體實驗中發現：雖然我們用各種不同濃度之戊二 醛（glutaldehyde, GA）（0.01%, 0.05%, 3.0%）來促進 PDCM 交鏈化﹐並重複以磷酸氫 鈉緩衝液(phosphate-buffered saline, PBS)沖洗後﹐再將這種 PDCM 植入白鼠腿部深層 肌肉組織，結果顯示交鏈化之 PDCM 於生物體中﹐具有相當之相容性。PDCM 可能 刺激炎性細胞分泌生長因子，促進局部未分化之間質細胞開始進一步分化增殖產生纖

維結締組織，因此形成類似瘢痕組織之纖維囊，以終止炎性反應之進行

。而在另一

個動物實驗中﹐我們以掃瞄式電子顯微鏡觀察經交鏈化後 PDCM 之表面結構﹐結果 顯示海綿狀之膠原蛋白膜呈現四種不同類形之結構﹐GA 濃度愈高﹐則 PDCM 表面纖 維狀或孔狀結構愈少。而且交鏈程度較高的 PDCM﹐具較佳之骨質導引再生作用

（guided bone regeneration, GBR）。

TG F-β1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

7-A 7-B 7-C 10-A 10-B 10-C 14-A 14-B 14-C

Rank Sum Control PDCM ePTFE

# * *

*

進傷口之癒合。於本研究中，我們即發現PDCM於傷口早期之癒合中，確實會引發結 締組織之T細胞或巨噬細胞產生PDGF-α與PDGF-β ，可於傷口中激發強烈之纖維母細 胞增生；而對於TGF-β 之分泌，則會增強膠原蛋白之合成，有助於guided tissue regeneration中，促進牙周再生。

我們所製作的豬皮膠原蛋白膜片內所含的膠原蛋白多屬於第一型膠原蛋白，基於未來 的臨床應用之考量，研究本膠原蛋白膜片所引發之細胞性免疫反應是本實驗重點之一.

我們也曾選 取 a n t i - r a t C D 4 , a n t i - r a t C D 8 , 及 a n t i - r a t C D 1 1 b 等 單 株 抗 體 ， 利 用 A v i d i n - B i o t i n P e r o x i d a s e C o m p l e x M e t h o d ( A B C M e t h o d ) ， 於 不 同 之 時 間 觀 察 3 % c r o s s - l i n k e d P D C M 於 組 織 中 所 引 發 之 c e l l u l a r i m m u n o g e n e c i t y, 結果顯示 P D C M 會 引 發 d e l a y t y p e h y p e r s e n s i t i v i t y， 整 個 炎 症 反 應 也 以 C D 4

T 細 胞 為 主 ﹐於 植 入 後 第 七 天 與 第 十 天 時 細 胞 數 目 達 到 顛 峰 ﹐ 而 且 C D 4 : C D 8 比 率 亦 接 近 2 : 1 。 P D C M 所 引 起 之 細 胞 性 免 疫 反 應 以 C D 4

T 細 胞 主 導 ， 而 且 由 活 躍 之 巨 噬 細 胞 活 動 看 來 , 其 所 引 起 之 免 疫 反 應 可 能 比 較 類 似 t y p e I V c e l l - m e d i a t e d i m m u n e r e a c t i o n

。 本 研 究 之 P D C M 引 發 P D G F - α / β 與 T G F - β 之 產 生 ， 也 印 證 P D C M 會 激 發 巨 噬 細 胞 於 d e l a y t y p e h y p e r s e n s i t i v i t y 中 促 進 f i b r o s i s 。

計 畫 成 果 自 評

一般用免疫染色來標示 cytokine 或 growth factor 之研究，多用敘述性方式來表達結 果，而本研究擬定一套標準，並凝聚四位研究生之合作，以獨特之半量化方式，完成 資料之收集與分析，實屬不易；對未來 PDCM 之 Th1/Th2 cytokine profile 研究亦立下 一個模式，也對於 PDCM 未來之臨床實驗，投下一個正數。感謝國科會提供研究經 費，使本研究能圓滿完成。

Reference:

1. Ratcliff, PA. Periodontal therapy-Reviews of the literature.

In world workshop in periodontics. Ramfjord SP, Kerr SH Ash MM., p 227. Ann Arbor. AAP 1986.

2. Polson, AM, Caton J. Factors influencing periodontal repair and regeneration. J.

Periodontol 53(10): 617, 1982.

3. Tanner MG, Solt CW, Vuddhakanok S. An evaluation of new attachment formation using a microfibrillar collagen barrier. J Periodontol 59: 524-530, 1988.

4. Magnusson I, Batich C, Collins BR. New attachment formation following controlled tissue regeneration using biodegradable membranes. J Periodontol 59:1-6, 1988.

5. Pitaru S, Tal H, Soldinger M, Grosskopf A, Noff M. Partial regeneration of periodontal tissue using collagen barriers initial obsverations in the canine. J Periodontol 59:380- 386, 1988.

6. Pitaru S, Tal H, Soldinger M, Azar-avidan O, Noff M. Collagen membranes prevent the apical migration of epithelium during periodontal wound healing. J Periodontal Res 22:331-333, 1987.

7. Lu H-K, Chen, C-Y. A study of biocompatibility and biodegradation of porcine dermal collagen. Chin Dent J, 153:150-159, 1996.

8. Lu H-K, Wu, K-J. The effect of porcine dermal collagen membrane on the

healing of bony defects in guided bone regeneration technique. Chin Dent J

biocompatibility, resorption and penetration characteristics of human collagen graft material. J Clin Periodontol 18:305-311, 1991.

10. Hyder PR, Dowell P, Singh G, Dolby AE. Freeze-dried, cross-linked bovine type I collagen: Analysis of properties. J Periodontol 63:182-186, 1992.

11. Lu H-K,Lin F-P, Wu M-F. In vitro tests of porcine dermal collagen membranes biocompatibility and enzymatic degradation rate. Chin Dent J 17(1):15-22, 1998.

12. Leibovitch, S.J., Ross, R.: A macrophage dependent factor that stimulates the proliferation of fibroblasts in vitro. Am. J. Pathol. 78:71, 1975.

13. Martin, B.M., Gimbron, M.A. Jr, Unanue, E.R., and Cotran, R.S.:

Stimulation of nonlymphoid mesenchymal cell proliferation by a macrophage-derived growth factor, J. Immunol 126:1510, 1981.

14. Terranova, V.P., and Wikesjo, U.M.E.: Extracellular matrices and polypeptide growth factors as mediators of functions of cells of periodontium. J Periodontal 58:6:371, 1987.

15. Wu M-F, Lu H-K, Wang C-K. Assays of histopathologic change induced by porcine

dermal collagen membrane by using S.D. rats animal model. J Chin Soc Vet Sci ;24

(4):251-256, 1998.