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壹、、、、前言前言前言前言
一、海洋發光細菌（marine luminous bacteria）簡介
生物光（bioluminescence）是一種生物體發出光的現象。有許多 不同的生物體具有發光能力，包括細菌、真菌，以及動物（Łyżeń &
Węgrzyn, 2005）。在具有發光能力的生物中，某些細菌因帶有 lux 基 因而具有發出可見光的能力，這類細菌一般被歸類在一起，統稱為發 光細菌（bioluminescent bacteria）。發光細菌是數量最多、同時也是 分布最廣的發光生物（Meighen, 1994），且大多數生活在海洋環境中
（Wilson & Hastings, 1998），稱為海洋發光細菌（marine luminous bacteria）；偶爾也能在淡水、鹽水（brackish water），以及土壤中發 現其蹤跡。
已 發 現 的 17 種 發 光 細 菌 均 屬 於 丙 型 變 形 菌 綱
（Gammaproteobacteria），其中 14 種是海洋發光細菌。海洋發光細 菌中，9 種是弧菌科（Vibrionaceae）底下 Vibrio 屬的物種，3 種是屬 於 弧 菌 科 底 下 的 Photobacterium 屬 ； 另 有 2 種 是 異 單 胞 菌 科
（Alteromonadaceae）底 下 Shewanella 屬的物種。所有的 弧菌科
（Vibrionaceae）細菌皆為兼性厭氧細菌，Shewanella 屬的兩個物種 則為極端好氧細菌（MacDonell & Colwell, 1985）。
海洋發光細菌在海水中含量相當豐富，經常能從海水、海底沈積 物（sediment），或者是岩石碎屑（detritus）中分離出來；且不論是 在遠洋或近海均廣泛地分佈著（Reichelt & Baumann, 1973）。有些物 種 生 活 在海 洋 動物 的 身 體表 面 ，或 者 是 發光 魚 類、 頭 足 類動 物
（cephalopods）的特化器官之中。大多數的發光魚類具有自發光
（self-luminescent）的能力，但是一部份的硬骨魚類則是由於發光細
菌共生於其特化的發光器官中，而因此具有發光的能力。海洋發光細 菌在海水中的濃度並不高（每毫升約含有 0.01-40 個細胞），但在海 洋動物的特化發光器官中則可以維持相當高的數量（每克發光器官中 約含有 106-109 CFU）（Ramesh et al., 1990）。
二、海洋發光細菌的鑑定方法
在海洋發光細菌的生態或是其族群演化（phylogeny）方面的研 究上，種（speices）階層的分類是不可或缺的。傳統鑑定海洋發光細 菌的方法僅止於表型特徵﹙phenotypic characterization﹚的分析，雖然 可行但卻經常需要耗費較多時間，且經常因為細菌品系生化活性
﹙biochemical activities﹚的差異而使得其結果顯得模稜兩可。因此近 年來，分子技術也常被運用在海洋發光細菌的菌種鑑定上，例如以具 有 物 種 專 一 性 的 luxA 序 列 作 為 探 針 （ probes ） 進 行 雜 合 反 應
（hybridization）。分子技術確實增進了菌種鑑定的可信度，但也往 往有其受限的地方；以 luxA 探針進行雜合反應的方法而言，其主要 的限制在於即使在同種之間，luxA 基因也經常是呈現高度歧異性的。
雖然利用 luxA 探針進行雜合反應的方法在大多數的海洋發光細菌間 都 具 有 高 度 的 專 一 性 ， 能 夠 區 別 Phtobacterium leiognathi 、 P.
phosphoreum、 V. fischeri ， 以 及 V. harveyi ， 同 時亦 能鑑 定 出 V.
splendidus；然而，原本針對 V. harveyi 的探針卻會對於兩個相近的物 種 V. vulnificus 以及 V. orientalis 表現出交叉反應（cross-reactivity)
（Wimpee et al., 1991; Nealson et al., 1993）。
有鑑於此，一些更加新穎的分子技術陸續被使用來協助進行菌種 的鑑定。例如針對核糖體 RNA﹙ribosomal RNA, rRNA﹚基因的小次 單元進行定序的方法被利用來決定弧菌科的典型菌種間之親緣演化 關係；或是藉由比較 16S rRNA 基因序列來建構 Vibrio 屬與相近屬之
間的親緣演化樹（Kita-Tsukamoto et al., 1993; Ruimy, 1994）。近年來，
一種稱為擴增核糖體 DNA 限制性分析﹙Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis, ARDRA﹚的方法被應用在快速區別及鑑定海洋發 光細菌上，其原理在於利用五種限制酵素：EcoRI、DdeI、HhaI、HinfI，
以及 RsaI 去裁切經由聚合酶連鎖反應﹙polymerase chain reaction, PCR﹚的增幅作用加以放大後的 16S rRNA 基因，藉由不同菌種之裁 切產物在經過電泳後所獲得的光帶樣式（band patterns）彼此間有所 不同，而能清楚地區別 14 種已知的海洋發光細菌（Kita-Tsukamoto et al., 2006）。
三、海洋發光細菌在生態學研究上的應用
生物光系統在研究外來化學物質對於生物體的影響機制方面是 一項便利的工具。發光細菌及其由螢光酵素所催化的化學反應被視為 是生物體的最簡單模式﹙model﹚，因此適合應用在生物檢定﹙bioassay﹚
上，尤其是在生態學方面的研究﹙Kudryasheva, 2006﹚。
利用細菌發光特性而進行的毒性試驗，是藉由測量海洋發光細菌 Vibrio fischeri 的發光強度受到環境中污染物抑制的程度，來檢測環境 中污染物所可能導致的毒性（Ribo & Kaiser, 1987）。發光細菌的發 光能力與其代謝有關，因此只有能夠進行能量代謝的細菌才能夠進行 化學反應而發出光。當代謝為某種毒性物質所阻斷、甚至是完全停止 時，發光細菌的發光強度便隨之下降；此一現象被廣泛地應用在生態 毒理學﹙ecotoxicology﹚方面的試驗上。然而，使用 V. fischeri 所獲 得的試驗結果並不具有專一性，亦即被測試的環境樣本中的任何毒性 均會被偵測到，但是對於究竟是何種污染物而導致細菌發光強度的變 化卻不得而知（Tamminen & Virta, 2006）。因此近年來，對於毒性 物質具有專一性或是半專一性（semi-specific）的發光細菌品系陸續
地被開發出來，並應用於檢測數種特定的環境污染原上，例如有機物
（Applegate et al., 1998）、有機金屬化合物（Ivask et al., 2001）、無 機離子（Tauriainen et al., 1997）、氧化壓力（Belkin et al., 1996），
以及基因毒性（genotoxicity）（van der Lelie et al., 1997）等。這些試 驗都是藉由調控一種能夠專一辨識標的化合物的轉錄調節蛋白，來針 對報導基因，如 lux 操縱子（operon）這個帶有細菌發光系統基因的 部份進行其表現上的調控。當目標物存在時，它會和轉錄調節蛋白進 行反應並形成複合物，而後此一複合物則會進一步活化 lux 操縱子的 表現，因而使得細菌的發光強度增強。這一類方法與一般使用 V.
fischeri 進行試驗的不同之處，在於標的化合物即使是在濃度達到對 細菌具有毒性的程度之前，也會導致細菌發光強度的上升。在某些試 驗中，使用發光細菌能夠提供污染物質的相關資訊，同時還能估計標 的化合物的濃度；更重要的是，這類試驗能夠測量標的化合物的生物 可利用度（bioavailability），這在傳統化學方法中並不容易做到。以 檢測土壤中所含重金屬的毒性為例，傳統上需使用多種不同的化學萃 取物來進行一系列的萃取步驟，然後使用化學分析的方法來測定土壤 中的哪些成份對於生物是具有影響的。然而，要將從非生物性的試驗 系統中所獲得的結果應用在生物系統上，其可信度經常遭到質疑。因 此，利用發光細菌的發光特性作為生物感測器（biosensor）的試驗系 統便在遺傳工程的協助下被開發出來；其原理在於，將細菌抵抗重金 屬的機轉（metal resist mechanism）中具有轉錄活性的構成單元，與 發光細菌的 lux 基因構築在一起，則由此所獲得的轉殖細菌品系便能 夠用來檢測被污染的土壤中之重金屬毒性及其生物可利用度，這在評 估由毒性化合物所引起的環境風險時是相當重要的（Ehlers & Luthy, 2003; Semple et al., 2004; Tamminen & Virta, 2006）。
四、Photobacterium leiognathi 簡介
本研究中從透抽所分離出的三株海洋發光細菌品系，經鑑定後發 現皆為 Photobacterium leiognathi。Photobacterium 屬的細菌在顯微鏡 下呈現短桿狀，屬於革蘭氏陰性細菌，直徑約 0.8-1.3 µm，長度在 1.8-2.4 µm 之間。藉由一至三根無鞘極性鞭毛﹙unsheathed polar flagella﹚進行移動；有些種類不具移動能力。在有氧與無氧的環境中 皆可生長，不具備固氮的能力，亦不形成內孢子，適宜的生長溫度約 在 20°C 左右。Na+是 Photobacterium 屬細菌生長所必需，故不能生長 在以海水作為基底的培養基中，因為這類培養基中的 Na+已被等量的 K+所取代。
P. phosphoreum 與 P. leiognathi 的品系能夠發出藍綠色的光，其 發光的化學反應過程以及催化此一反應的螢光酵素﹙luciferase﹚與其 他的原核生物均相似。發光所涉及的化學反應包含了藉由氧分子還原 黃素單核苷酸﹙flavin mononucleotide, FMNH2﹚以及氧化一種長鏈脂 醛﹙aliphatic aldehyde﹚的過程﹙Baumann & Baumann, 1984﹚。
五、研究目的
不能自發光的海洋發光動物，其發光能力經常來自於體內共生的 海洋發光細菌。海洋發光動物所發出的可見光被認為具有許多不同的 功能，例如吸引獵物、逃避獵食者的追捕等﹙Nealson, 1979﹚；因此 海洋動物如何調控其體內共生的海洋細菌所發出的光便成為重要課 題。
由於在一般環境條件下，本研究中所分離出的三株發光細菌品系 的發光強度間具有明顯的落差。故本研究欲瞭解的是，在受到不同理
化因子的影響時，三株發光細菌品系的發光強度所受到的抑制或激發 程度是否亦可能有所不同，並進而影響共生之海洋動物的生態行為。
