行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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※ 利用高白血球介素-12,低轉形生長因子-乙 ※
※ 分泌之自體腫瘤疫苗行術後主動免疫治療 ※
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計畫類別：V 個別型計畫 □整合型計畫 計畫編號：NSC 89-2314-B-006-116
執行期間：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日 計畫主持人：泌尿科部 蔡宗欣
共同主持人：微免所 蕭璦莉 生化所 吳昭良
執行單位：國立成功大學 醫學院泌尿科部, 微免所與生化所 中華民國 90 年 10 月 31 日
Abstr act
Cancer therapy by surgery usually failed as a result of local recurrence and/or distant metastasis because of inadequate resection and micrometastasis. Postoperative enhancement of the specific tumoractivated host antitumor immunity was believed can abrogate these miserable sequelae
.
Interleukin-12 (IL-12) is a heterodimeric cytokine that plays an important role in the development of cellular immunity. It was known as natural killer cell stimulatory factor (NKSF) or cytotoxic lymphocyte maturation factor (CLMF).This cytokine is secreted by antigen-presenting cells (primarily macrophages and B cells) and appears can (1) enhance the cytolytic activity of a number of effector cells including T cells, natural killer (NK) cells, lymphokine activated killer (LAK) cells, and macrophages, (2) increase proliferation of activated NK and T cells,
(3) induce production of cytokines, such as interferon-γ, (4) stimulate the induction of Th1 cells, (5) upregulate a number of cell surface molecules, (6) inhibit IgE secretion, and (7) act as a synergistic factor for hemopoietic stem cells. Using the C3H/He-MBT-2 bladder tumor model and the constructed retroviral vector carrying mIL-12 cDNA (pCLNRX-IL12) to transfect wild type MBT-2 or low TGF-β secreting MBT-2/
TGF-β (-) #3 cell line, we intended to investigate if (1) MBT-2 or MBT-2 /TGF-β (-) #3 tumor cells infected with retroviral plasmid carrying mIL-12 cDNA [ MBT-2 / IL-12 or MBT-2 / TGF-β(-) #3 / IL-12] may produce adequate amount of IL-12, (2) the MHC class I and II molecules expression on the cell surface of them can be upgraded, (3) after treated with lethal dose X-ray irradiation [IRMBT-2 / IL-12, IRMBT-2 / TGF- β(-) #3 / IL-12 ] remain long enough metabolic active to serve as an autologous tumor vaccine, (4) the
immunostimulating effect of IRMBT-2/
IL-12 and IRMBT-2/TGF- β(-) #3/IL-12 on tumor bearing mice when immunized after tumor resection.
Key wor ds: Interleukin-12, Bladder cancer, Immunotherapy, TGF-β
中文摘要
在本實驗中我們欲嘗試利用基因 治療之方式以攜帶 murine IL-12 cDNA 之 Retroviral vector (pCLNRX-IL12)來 改造 wild type MBT-2 與另一株我們實 驗 室 過 去 經 antisense TGF-β oligoneucleotide 改造之一株老鼠腫瘤 株[MBT-2/TGF-β(-)#3]，如此我們可獲 得兩株高 IL-12 但不同 TGF-β分泌量 之 細 胞株 合 併原 來 未 經 基 因 改 造 之 wild type MBT-2 腫瘤細胞, 然後以 6000 rads X-光放射處理這三株細胞後 再分別以之作為基因改造之自體腫瘤 疫苗(Autologous tumor vaccine)，皮下 注射於 D17TBM, 然後再測試老鼠之 特異性抗腫瘤免疫力十是否有明顯有 意義之增強，藉以提供未來臨床應用 時參考用。透過本實驗之結果，可以 使我們嘹解是否能夠藉基因改造之策 略將腫瘤細胞中對免疫抗癌之不利因 子減少或抑制，相對地將有利免疫抗 癌之因子加以增強。藉此改善並提昇 自體腫瘤疫苗之免疫刺激效果，來克 服目前癌症主動免疫治療常見之瓶頸, 作為將來臨床應之理論基礎,由於本實 驗 首 先 需 先 構 築 一 攜 帶 老 鼠 IL-12 cDNA 之 retroviral plasmid vector 以便 將其所攜帶之老鼠 IL-12 cDNA 送入我 們 本 實 驗 之 Target cells, wild type MBT-2, MBT-2/TGF-β (-)#3 中, 然後 利 用 這 retroviral plamid vector pCLNRX 內 具 有 之 reporter gene
(neomycin resistant gene)之特性篩選出 mIL-12 cDNA 成 功 integrade 進 入 Target cell 之 clones 然後再一方面測試 這些經篩選所獲得之 clones 之 IL-12 與 TGF-β之分泌量, 另一方面再利用 以前我們常用之動物膀胱癌模式(Day 17 TBM in C3H/He-MBT-2)來測試所 欲知曉之免疫刺激反應以為將來臨床 應用時之理論基礎。
關鍵詞: 自體腫瘤疫苗, 白血球介素 -12, 轉形生長因子-乙
計劃緣由與目的
白 血 球 介 素 -12 [Interleukin-12 (IL-12)]是一種由許多種不同之細胞，
包括吞噬細胞(macrophage)與 B 淋巴 球 ， 所 分 泌 之 多 功 能 之 細 胞 介 素 (cytokine)，根據文獻報告顯示它具有 許多功能包括：(1)它可刺激自然殺手 細胞[Natural Killer (NK) cells]，淋巴激 素 活 化 殺 手 細 胞 [Lymphokine Activated Killer (LAK) cells]，吞噬細胞 與 細 胞 毒 殺 T 淋 巴 球 [Cytotoxic T Lymphocytes (CTL)]的繁殖並增強其 毒殺力 (2) 它可引發其他細胞介素的 分泌，如：使 NK 與 T 細胞產生干擾 素-γ [Interferon-γ]，(3)它可誘發第一型 助手 T 細胞[Th1(Helper T cell)]並刺激 其功能，(4)它可提昇許多細胞膜表面 物質的表現，如：MHC class I 抗原，
(5) 它 可 以 是 骨 髓 造 血 幹 母 細 胞 之 synergistic 因子。在一些其他動物腫瘤 模式實驗中，也已應証了 IL-12 具有抑 制腫瘤生長及轉移之效，更重要的是 它對已長成之腫瘤同樣亦具有療效，
而且全身性給予 IL-12 注射時亦未見 有重大副作用。而這些 IL-12 所發揮之 抗腫瘤效果，經更進一步研究後被發 現其實是起因於 IL-12 可以增強腫瘤
宿 主 體內 之 免疫 系 統 ， 主 要 是 透 過 CD8+ T 淋巴球，而非 NK 細胞 或 CD4+ T 細胞所達成。 研究發現使用 IL-12 可預防 T 細胞失去活力(T cell anergy)的發生，且有活化 MHC 不限制 之細胞毒殺作用。由於實驗結果顯示 IL-12 治療之腫瘤抑制作用於接種腫瘤 並手術切除之老鼠比未接腫瘤之老鼠 較強，因此我們認為於腫瘤宿主手術 切除腫瘤後，IL-12 治療可以進一步增 強其體內之特異性抗腫瘤免疫力而達 到腫瘤根治的目的。 TGF-β 已被証實 是 一 種 很 強 的 immune suppression factor [1,2.]、成長中之腫瘤細胞會藉分 泌包括 TGF-β 在內的一些免疫抑制 因子、成功地規避腫瘤宿主體內之抗 癌免疫反應、進而達到腫瘤細胞成長 存活之結果。因此如果能有效地抑制 腫瘤細胞分泌 TGF-β 相信可以大大 改善腫瘤宿主體內之特異性抗腫瘤免 疫反應。
根據一些國外文獻報告顯示，人 體膀胱癌的腫瘤細胞之 Transforming growth factor-β1(TGFβ1)的分泌量較正 常之膀胱表皮細胞有偏高的趨勢。這 點與我們上述之動物膀胱癌模式十分 類似。在過去幾年之實驗中[3,4]，我們 已經證明 MBT-2 老鼠膀胱癌細胞也會 分泌 TGF-β 來抑制腫瘤宿主體內之 抗癌免疫力，而且即使接受致死劑量 (6000Rads)之 X-光放射處理後它們仍 會維持 Metabolic active 而持續分泌 TGF-β達四天。接著我們利用反轉錄病 毒 載 體 (retroviral vector) 攜 帶 一 段 TGFβ antisense oligonucleotide，送入 MBT-2 腫瘤細胞之 genome 後，利用 這段 oligonucleotide 去降低或阻斷腫 瘤細胞 TGFβ的分泌，結果發現當腫瘤
細胞其 TGFβ的分泌減低後，其 in vitro 之 proliferation activity 與 in vivo 之 tumorigenecity 兩者均明顯地且有意義 地降低[5]。
研究方法與步驟:
動物：inbred female C3H/He Mice 4-6 week of age. 腫 瘤 細 胞 株 ： MBT-2 (Murine bladder tumor)，這是一種由簡 稱為 FANFT 這種化學致癌物質，於 C3H/He Mice 膀胱所 induce 出的膀胱 移 形 性 上 皮 癌 (Transitional cell carcinoma) 細 胞 培 養 基 ： Complete Medium(CM): RPMI1640 +10% FCS (Fetal Calf Serum ) + 0.1 mM nonessential a.a. + 1mM sod. Pyruvate + 2.0 mM Glutamine + 50 mM 2-Mercaptoethanol. (1) 建 造 一 攜 帶 murine IL-12 cDNA 之 retroviral plasmid vector (pCLNRX-IL12) : 將 IL-12 clone into pCLNRX retroviral expression vector (RetroMax, IMGENEX)-à pCLNRX-IL12.
IL-12 pCLNRX
pCLNRX-IL12 CMV RU5
Neo
RSV IL-12
LTR SV40
pBR322 Ori
Amp
(2) Cotransfection of pCLNRX-IL12 and pCL-Eco (packaging vector) into 293 cells
(3) 目 前 已 產 生 約 五 個 stable clones (可穩定產生帶有 IL-12 gene 的 helper virus-free, retrovirus)並收集 很 多含 有 retrovirus (帶有 IL-12 gene ) 的 supernatant,用這些含有很多含 有 retrovirus ( 帶 有 IL-12 gene ) 的 supernatant 來感染 MBT-2 (wild type ) and MBT-2 / TGF-β (-) # 3 cell lines, 爾後 用含有 G418 的 medium 來篩選 總共做了兩次 均無法獲得 帶有 IL-12 gene 的 MBT-2 或 MBT-2/ TGF-β (-)
#3. 將 pCLNRX-IL-12 transformation into DH5 alpha host cells 經 過 overnight incubation, 以 大 量 抽 取 plasmid DNA ,以便用 electroporation 的方式將 pCLNRX-IL12 送入 MBT-2 或 MBT-2/ TGF-β (-) # 3 內 . 將 pCLNRXIL12 用 electroporation 的方 式送入 MBT-2 或 MBT-2/TGF-β (-) # 3 內 (2000µF, 200V, 129 Ω) 目前仍用 含 G418 的 medium 篩選中
結果:
由於實驗實際操作時,我們遇上困 難,一直無法順利將以前所 construct 攜 帶 mIL-12 之 plamid retroviral vector 送 入 MBT-2 細胞中, 所以改用目前之方 法 以 electroporation 的 方 式 送 入 MBT-2 與 MBT-2/ TGF-β(-) # 3 內¸一
但這步驟能成功篩選出 MBT-2/IL-12, MBT-2/ TGF-β(−)/IL-12, 這兩種所欲 測試之細胞株後連同 wild type MBT-2 腫瘤細胞,再經致死劑量放射處理後作 為腫瘤疫苗,就可再繼續進行前所設計 之 in vivo 與 in vitro study.屆時再補上 完整之成果報告¸以目前進度最困難之 部份已經接近完成所以可能再三-四個 月應該就可完成
參考文獻:
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Burlington, D.B., Lane, H.C. and Fauci, A.S.: Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J. Immunol., 136: 39216, 1986.
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Cyclophosphamide and Autologous Tumor Vaccine in Murine Bladder MBT-2 Bladder Cancer. J. Urol.
151:1680-1686, 1994.
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6. Tzong-Shin Tzai, Chao-Liang Wu , Li-Ling Liu, Ai-Li Shiau,: Postoperative immunization with TGF-β antisense oligonucleotide modified autologus tumor vaccine enhances the antitumor immunity of tumor bearing mice by upgrading the expressions of MHC class I antigen and Fas. Anticancer Res.
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7. Tzong-Shin Tzai, Ai-Li Shiau, Chao-Liang Wu, Yuh-Shyan Tsai:
Postoperative administration of Interleukin-12 significantly enhances the anti-tumor immune response of MBT-2 bladder cancer bearing mice. Proc. Natl.
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