行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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※ 熱休克對胃腸道癌細胞catenin及上皮生長因子 ※
※ 接受體的影響 ※
※ The effects of heat shock to catenins and epider mal ※
※ gr owth factor r eceptor in gastr ointestinal cancer s ※
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計畫類別：■個別型計畫 □整合型計畫 計畫編號：NSC89－2314－B－038－054－
執行期間： 89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日
計畫主持人：謝茂志
共同主持人：吳秋文，余家利
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：台北醫學大學醫學系
中 華 民 國 90 年 10 月 31 日
熱休克對胃腸道癌細胞catenin及上皮生長因子 接受體的影響
The effects of heat shock to catenins and epider mal gr owth factor r eceptor in gastr ointestinal cancer s
計畫編號：NSC89-2314-B038-054 執行期限：89年8月1日 至 90年7月31日
主持人：謝茂志，台北醫學大學醫學系 共同主持人：吳秋文，台北榮民總醫院 共同主持人：余家利，台灣大學醫學院
一、中文摘要
利用胃癌細胞株對於受到熱休 克及上皮生長因子接受體的影響，其 catenin，E-cadherin 表現的改變做研 究，發現熱休克對於catenin的影響並 不顯著，但是上皮生長因子接受體對 於E-cadherin的影響卻呈現有意義的 差別。
二、英文摘要
Using three gastric cancer cell lines (SC-M1, NU-GC-3, AGS), the E-cadherin and catenin expression was detected under the treatments of heat shock and epidermal growth factore receptor. The catenin expressions were not significantly affected by heat shock treatment, but the concentration of soluble E-cadherin was significantly changed after the treatment of epidermal growth factor receptor.
三、緣由
Catenin 是 在 細 胞 內 與 E-cadherin 相 連 接 的 一 種 蛋 白 質 [1,2,3]。E-cadherin 廣泛存在於上胚 層來源的細胞中。 E-cadherin 與細 胞的形態分化皆有關係，其表現與癌 症轉移息息相關，更與癌症病患的預 後有關。E-cadherin 的功能與 catenin 的功能息息相關。愈來愈多的實驗證 據 顯 示 ， 上 皮 生 長 因 子 接 受 體
（EGFR）的磷酸化，透過與 beta- 或 gamma-catenin 的交互作用，與引 起 E-cadherin/catenin 複合體的不活 化有關。
我們先前的實驗已測知胃癌細 胞會表現E-cadherin。我們先前已測 知胃癌細胞表現 E-cadherin會受到 熱休克的影響而改變，最近更發現胃 癌細胞上catenin的表現也都不盡相 同。腹腔內高溫療法（熱休克的應用）
已被用來治療胃腸道癌合併腹腔內 轉移的病例。此種治療結果，可能有 部分原因是熱休克會改變胃腸道癌 細胞表面對於E-cadherin表現程度的 改變。我們假設熱休克也將改變胃腸 道 癌 細 胞 EGFR 及 catenin 的 表 現 程 度。在本研究中，我們去偵測胃腸道
癌 細 胞 中 的 E-cadherin, catenin, EGFR, phosphorylated tyrosine residues, EGFR-tyrosine kinase在熱休 克前後不同的表現程度。
四、材料及方法
我們同樣利用一個日本的人類 胃癌細胞株 NU-GC-3 [4]，一個中國 的人類胃癌細胞株 SC-M1 [5]，以及 一個美國的人類胃癌細胞株 AGS [6]
來作此研究。其中 NU-GC-3 是從肌 肉分離培養出來分化不良的轉移性 胃腺癌細胞，為多角形，培養於 1：
1 的 RPMI-1640 與 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Gibco)混 合液內含 10%的胎牛血清。SC-M1 則是從胃癌組織中所培養出來的胃 腺 癌 。 SC-M1 培 養 於 RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY)。AGS 則 是培養於 Ham’s F-10。以上的培養基 皆含有 10%的胎牛血清。這些細胞都 是培養在 37℃，5%CO2-95% air。
細胞的熱休克處理是將培養中 的細胞，連同培養皿一起加熱到 42.5
± 0.1℃ [7]並持續 30 分鐘，60 分鐘 及 120 分鐘不等，另有一組不經加熱 處理以作為對照組。加熱以後的細胞 以 2mM ethylenediaminetetraacetic acid（EDTA）溶液處理使其剝落，
並以 Trypan Blue 染色，並在顯微鏡 下觀察其存活率及計數。結果顯示經 加熱 30 分鐘，60 分鐘及 120 分鐘後 的細胞存活率分別為 96%，89%及 47%。因此對於熱休克處理後的細胞 觀察，我們認為 60 分鐘為最適當的 時間。
對於 EGF 之處理，則先以無血
清之培養液培養 36 小時後，再加入 200 ng/ml 之 EGF 於 37 ℃ ， 5%CO2-95% air 中處理 10 分鐘，再
將 細 胞 以 2mM
ethylenediaminetetraacetic acid
（EDTA）溶液處理使其剝落取下。
上述各種條件處理後的細胞溶 液以 1.5 毫升，0.125M Tris buffer, pH 6.8, 2% （ w/v ） SDS, 5% （ v/v ） 2-mercaptoethanol ， 10% （ w/v ） glycerol，0.001%（w/v）bromophenol blue 的 Laemmli sample solution [8]溶 解，加熱 100℃，三分鐘，再經過超 高速離心 100,000 g，4℃之下一小 時，收集上清液。先將上清液定量後 取 10 ?g 的 濃 度 以 作 為 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）電泳分 析 [9]。並將電泳分析後之蛋白轉移 至 nitrocellulose membrane 。 此 nitrocellulose membrane 先以 5% 脫 脂牛奶加上 Tris buffer saline 一小時 來阻斷（blocking）非專一性的結合，
之後以 PBS 沖洗三次，再以 primary antibody（如上所述的各種抗體）作 用一小時。以 PBS 沖洗三次後，再 以 經 horseradish peroxidase 結 合
（HRP-conjugated）的 goat anti-mouse 或 anti-rat IgG 作用一小時。以 PBS 沖 洗 三 次 後 ， 以 enhanced chemiluminescence（ECL; Amersham, Aylesbury, UK）方法曝光於 X 光片 上顯示出來。
另外，於熱休克及 EGF 處理結 束後，收集細胞培養的上清液來測定 可溶性 E-cadherin。可溶性 E-cadherin 之測量乃依據市面上所購得的三層 式酵素連結免疫分析套件（Zymed Laboratories Inc., San Francisco,
USA），其中含有兩種老鼠（mouse）
抗人體 E-cadherin 不同表位（epitope）
的 單 株 抗 體 。 利 用 山 葵 過 氧 化 脢
（horseradish peroxidase, HRP）標誌 在次級抗體上，可決定人體可溶性 E-cadherin 之濃度。在波長 450nm 時，利用 ELISA 讀取器，可讀取其 透光度，並利用波長 630nm 作為矯 正。每一個樣本至少都做雙重以上的 檢驗，並取其平均值為測量濃度。
所有的胃癌病患都依照日本胃 癌研究學會 [10] 所推薦的胃切除 手術（全胃切除或次全胃切除）以及 淋巴結廓清術來進行手術。將癌組織 及非癌之胃粘膜成對取下。所有的標 本都在收集後便保存於－80℃，一直 到取出使用。
五、結果
胃癌細胞株經熱休克處理後之 E-cadherin，在西方墨點法之下，有 明顯之增強表現之現象（圖一），而 alpha-catenin （圖二）、beta-catenin
（圖三）、gamma-catenin（圖四）則 無明顯之變化。
然而，經過上皮生長激素接受 體的影響之下，對此三種胃癌細胞株 來測定可溶性 E-cadherin 之表現，卻 可發現 E-cadherin 的濃度可受到影 響而降低（表一）。
六、討論
Catenin 是 E-cadherin 所 連 結 的 功能性蛋白質，因此推測catenin可以 影響E-cadherin的表現。然而從我們 的初步結果顯示，在熱休克的影響下 似乎catenin並沒有對E-cadherin有直
接的關係（圖二、圖三、圖四）。但 是 當 我 們 進 一 步 測 定 可 溶 性 E-cadherin 與上皮生長激素接受體 之 間 的 關 係 時 ， 卻 可 發 現 可 溶 性 E-cadherin 的濃度確實會受到影響 而減少（表一）。El-Bahrawy [11]提 到第一行的生長因素接受體與其他 的 分 子 作 用 ， 經 由 tyrosine phosphorylation 而 影 響 catenin 的 功 能。任何生化學上的改變或基因突變 上的改變，都有可能間接影響catenin 的功能而導致細胞的不正常生長及 分化[12，13，14]。Shiozaki更指出，
一 但 上 皮 生 長 因 素 接 受 體 受 到 刺 激，將抑制E-cadherin的表現而導致 癌細胞的轉移及侵襲性[12]。而在我 們的實驗結果顯示，受到生長因素接 受體的處理後，胃癌細胞培養上清液 中 的 可 溶 性 E-cadherin 濃 度 ， 在 SC-M1及AGS兩種細胞接呈現有意 義的降低。在胃癌病患的血清中，較 高的可溶性E-cadherin濃度表示預後 不 佳 ， 亦 即 容 易 有 癌 轉 移 的 現 象 [15]。NU-GC-3細胞的培養上清液中 的 可 溶 性 E-cadherin 亦 有 減 少 的 趨 向，只是為達到有意義的差別。這結 果顯示上皮生長激素接受體是會影 響到癌細胞E-cadherin的表現，只是 程度的大小而已。
我們首度發現在胃癌細胞中，
E-cadherin的表現會受到上皮生長因 素 接 受 體 的 影 響 ， 而 且 以 可 溶 性 E-cadherin的影響最顯著。進一步的 澄清，需要對於catenin，上皮生長因 素接受體，tyrosine phosphorylation以 及可溶性E-cadherin之間的複雜關係 做進一步的探討。
七、參考資料
1. Reynolds AB, Daniel J, McCrea PD, Wheelock MJ, Wu J, Zhang Z.
Identification of a new catenin: the tyrosine kinase substrate p120cas associates with E-cadherin complex.
Mol Cell Biol 1994; 14: 8333-8342.
2. Shibamoto S, Hayakawa M, Taceuchi K et al. Association of p120, a tyrosine kinase substrate, with E-cadherin / catenin complexes.
J Cell Biol 1995; 128: 949-957.
3. Aghib DF, McCrea PD. The E-cadherin complex contains the src substrate p120. Exp Cell Res 1995;
218: 359-369.
4. Akiyama S, Amo H, Watanabe T, Matsuyama M, Sakamoto J, Imaizumi M, Icgihashi H, Kondo T, Takagi H. Characteristics of three human gastric cancer cell lines, NU-GC-2, NU-GC-3 and NU-GC-4.
Jpn J Surg 1988; 4: 438-446.
5. King LD, Meng CL, Han SH, Ding MJ, Chang JM, Chen JK, Shen KL.
Study of monoclonal antibody by Chinese gastric cancer cell lines (In Chinese). J Med Sci 1987; 8: 17-25.
6. Barranco SC, Townsend CM, Casartelli C JR, Macik BG, Burger NL, Boerwinkle WR and Gourley
WK. Establishment and
characterization of an in vitro model system for human adenocarcinoma of the stomach. Cancer Res 1983;
43: 1703-1709.
7. Teicher BA, Kowal CD, Kennedy KA and Sartorelli AC. Enhancement by hyperthermia of the in vitro cytotoxicity of mitomycin C toward hypoxic tumor cells. Cancer Res 1981; 41: 1096-1099.
8. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacterophage T4.
Nature(Lond.), 227: 680-685, 1970.
9. Dunn MJ. Gel Electrophoresis:
proteins. Bios Scientific Publishers Limited, Oxford, UK. 1993.
10. Japanese Research Society of Gastric Cancer (JRSGC). Japanese classification of gastric carcinoma.
Kanehara & Co., Ltd., Tokyo, 1995.
11. El-Bahrawy MA, Pignatelli M.
E-cadherin and catenins: molecules with versatile roles in normal and neoplastic epithelial cell biology.
Microscopy Research & Technique.
1998; 43(3): 224-232, Nov 1.
12. Shiozaki H, Kadowaki T, Dokey Y, et al. Effect of epidermal growth factor on cadherin-mediated adhesion in a human oesophageal cancer cell line. Br J Cancer 1995;
71: 250-258.
13. Takayama T, Shiozaki H, Doki Y, et al. Aberrant expression and phosphorylation of ?-catenin in human colorectal cancer. Br J Cancer 1998; 77: 605-613.
14. Ilyas M, Tomlinson IPM, Rowan A, Pignatelli M, Bodmer WF. ?-Catenin mutations in cell lines established from colorectal tumors. Proc Natl
Acad Sci USA 1997;
94:10330-10334.
15. Katayama M, Hirai S, Kamihagi K, Nakagawa K, Tasumoto M, Kato I.
Soluble E-cadherin fragments increased in circulation of cancer patients. Br J Cancer 1994; 69:
580-555.
圖一、E-cadher in在胃癌細胞株的表 現。1：正常培養下。2：熱休克以 後。
左：SC-M1；右：NU-GC-3。
圖二、Alpha-catenin在胃癌細胞株 的表現。S:SC-M1，N:NU-GC-3。1：
正常培養下。2：熱休克30分鐘以 後。3：熱休克60分鐘以後。
圖三、Beta-catenin在胃癌細胞株的 表現。C：contr ol，S:SC-M1，A：
AGS，N:NU-GC-3。1：正常培養下。
2：熱休克30分鐘以後。3：熱休克 60分鐘以後。
圖四、Gamma-catenin在胃癌細胞株 的表現。C：contr ol，S:SC-M1，A：
AGS，N:NU-GC-3。1：正常培養下。
2：熱休克30分鐘以後。3：熱休克
60分鐘以後。
表一、 胃癌細胞株經過熱休克處理
（42.5℃，30分鐘，60分鐘，120分 鐘）前、後以及EGFR處理後的培養 上清液中，可溶性E-cadher in濃度 (ng / ml)的比較。
Treatment SC-M1 NU-GC-3 AGS
37°C 215.4 ±
3.43
151.6 ± 3.49
94.2 ± 1.41 42.5°C, 30
min.
234.8 ± 2.94
164.4 ± 2.56
94.5 ± 0.92
p 0.014 0.106 0.824
42.5°C, 60 min.
396.5 ± 4.21
197.2 ± 1.26
93.8 ± 2.57
p <0.001 0.001 0.902
42.5°C, 120 min.
329.4 ± 6.25
180.9 ± 1.92
92.3 ± 2.06
p 0.001 0.019 0.407
EGFR
168.0 ± 13.57
162.8 ± 2.16
65.1 ± 3.21
p 0.0315 0.0794 0.0139
p: 與 37℃之下比較。
