第四節 藥理試驗方法與材料
(一) 抗心律不整活性試驗方法 :
1.心肌收縮力與自發性收縮頻率之測量 :
成年大白鼠(WKY strain)重約 250-300 克，先腹腔注射 heparin (16mg/kg) 並以 pentobarbital sodium (50 mg/kg)麻醉; 而成年天竺鼠(Hartly strain )重約 200-300 克，先注射 heparin ( 16mg/kg )，兩種動物皆以頸椎分離( cervical dislocation )方式犧牲，迅速取出心臟於低溫含 1.8mM 鈣，置於通混合氣( 95
﹪O2 + 5﹪CO2 )之 Tyrode 溶液中，將左、右心房及右心室分離，心室肌則 修剪成約 4 mm × 6 mm 之長方形條塊。各組織一端以細絲線固定於電極底 部，置入內含 10 ml Tyrode 溶液充以混合氣的組織浴器(organ bath)中，溫度 維持 36+0.2℃，另一端則連接張力轉能器(force transducer, Type BG 25, Cleveland, Ohio, U.S.A)並經由記錄器( Gould Recorder RS 3400 )記錄等長收 縮張力。
標本給予適當靜止張力約 0.5- 1.0 克，待平衡後始進行實驗。左心房及 右心室肌標本以波寬 1 ms，兩倍閥值 ( threshold )方形波的電刺激強度， 頻 率 2 Hz 來引起收縮反應。右心房組織因內含竇房結節律組織，可記錄其自 律性收縮頻率及收縮力。各離體心肌標本至少平衡 30 分鐘後始進行實驗。
2.實驗用溶液組成:
( 1 )Tyrode 溶液( mM ):
< A > NaCl 137, KCl 5.4, MgCl2 1.1, CaCl2 1.8, NaHCO3 11.9, NaH2PO4 0.33, dextrose 11, 95 % O2 + 5 % CO2。
< B > NaCl 137, KCl 5.4, MgCl2 1.1, CaCl2 1.8, HEPES 10, 100 % O2 , 以 NaOH 滴定至 pH 7.4。
( 2 )酵素溶液:
無鈣 HEPES-buffered Tyrode 溶液含 collagenase (Sigma type I) 1 mg/ml 及 protease ( Sigma type XIV ) mg/ml。
( 3 )KB 溶液( mM ) :
KCl 86.1, NaCl 50, MgSO4 5, KH2PO4 301.1, EGTA 0.5, dextrose 20, pyruvic acid 5, succinic acid 5, creatine 5, taurine 20 polyvinylpyrrolidone ( PVP 40 ) 1.25, NaATP 5, 以 KOH 調至 pH 7.4。
( 4 )電極溶液( internal solution ) : < A >正常電極溶液( mM ) :
NaCl 10, KCl 120, MgATP 5, K2EGTA 5, cAMP 0.3, HEPES 10, dextrose 5.5, 以 KOH 滴定至 pH 7.4。
< B >含 Cs+電極溶液( mM ) :
CsCl 130, TEACl 15, K2EGTA 5, CAMP 0.03, HEPES 10, dextrose 5, 以 CsOH 滴定至 pH 7.4。
( 5 )低鈉 Tyrode 溶液( mM ) :
NaCl 1, HEPES 10, MgCl2 1.1, CaCl2 2, dextrose 11, choline chloride 122, 以 NaOH 滴定至 pH 7.4。
3.實驗用試劑:
Quinidine, Propranolol, 4-aminopyridine ( 4-AP ), (±) Verapamil, Lidocaine, Prazosin, Pyrilamine, Tetrodotoxin 皆購自 Sigma Chem. Co.
U.S.A。除 4-AP, Prazosin, Pyrilamine 及 TTX 以去離子水為溶劑外，其餘 藥品皆以 dimethyl sulfoxide ( DMSO )為溶劑作 stock solution。在對照組 實驗 DMSO 不超過 0.1％對實驗結果無明顯作用。
4.實驗數據的統計:
實驗數據以平均值± 標準誤差 ( Mean± S.E )表示。而實驗組與對 組間之差異，以 Student′s-test 加以評估。
(二)抗血小板凝集活性試驗方法:
1.血小板凝集引發劑之製備
(1) Thrombin :購自 Park Davis Co. USA; 溶解於 50% (v/v) glycerol，製備成 100 NIH units/ml 之 stock solution。
(2)Arachidonic acid (AA): 購自 Sigma Chem. Co. USA; 以去離子水溶解，使 濃度成為 100 mM。
(3)Collagen (Type I bovine Achilles tendon): 購自 Sigma Chem. Co. USA; 溶 於 25 mM 醋酸水溶液中，於 4 °C 研磨成均勻的懸浮液，以 l mM/ml 的 濃度分裝，於- 70 °C 中貯存，使用前再解凍研磨均勻，使濃度成為 10 mg/ml。
(4)Platelet-activating factor (PAF): 購自 Sigma Chem. Co. USA; 溶於 chloroform 中，使用前以 0.9 % NaCl 稀釋，使濃度成為 2ng/ml。
2.血小板懸浮液之製備
從兔子耳靜脈抽出血液，與 100mM EDTA 以 l:14 (VN)的比例混合，
使 EDTA 之最終濃度為 6mM，在室溫下立即以 90g 離心 10 分鐘，取出上層 富含血小板之血漿(platelet-rich plasma)，再將其以 500g 離心 10 分鐘，除去 血漿後，將下層血小板(platelet pellets)以含有 EDTA(2 mM)及 Bovin serum albumin(3.5 mg/ml)的 Tyrode’s solution (calcium free)清洗之，在相同轉速(500
g)下離心 10 分鐘，所得之血小板以不含有 EDTA 之 Tyrode's solution 清洗 之，再於相同之條件下離心後，取血小板層，將其懸浮於 Tyrode's solution，
其組成如下(mM) : NaCl (136.8), KCl (2.8), NaHCO3(11.9), MgCl2(1.1), NaH2PO4(0.33), CaCl2 (l.0) and glucose (11.2) ; 並以 Coulter counter (Model ZM)計數，調整血小板數約為 4.5 × 108 platelets/ml，最後加 1 mM 鈣離子(Ca2+) 放置 30 分鐘進行實驗。
3.血小板凝集之試驗
利用混濁度法(turbidimetric method)之原理來測定凝集程度80，並以 dual-Channel Lumiaggregometer (Model 1020, PayLon, Canada)測定之。將血 小板懸浮液 0.4 毫升加入經 Silicone 包衣的小玻璃管中，並以小磁棒做每分 鐘 900 轉(900 rpm)的攪拌，若未特別說明，均在加入測試之化合物三分鐘 後，再加入凝集引發劑，經六分鐘後觀察結果。為了排除溶媒(DMSO)影響，
在血小板溶液的濃度為 0.5%。全部反應過程皆在 37 °C 下進行，凝集程度 的表示方法如下81。
凝集 % = [(A1-A2) / (A1-Ab)] ×100 %
A1 : 加入凝集引發劑前的吸光度 A2 : 加入凝集引發劑後的吸光度 Ab : Tyrode's solution 的吸光度
(三)抗發炎活性試驗方法:
1.嗜中性白血球懸浮液之製備
大白鼠(Sprague Dawley, 300-350 g)以 pentobarbital (60 mg/kg) 腹腔注 射麻醉後，從腹腔大動脈抽取血液(以 100 mM EDTA 當抗凝劑)，與 dextran 混合後在試管中靜置使紅血球沈澱。取上清液離心(400g) 10 分鐘，丟棄大 部份上清液，將沈澱細胞懸浮液輕輕加至含有 Ficoll-Hypage 的試管中，離 心(500g) 30 分鐘82。將沈澱細胞懸浮在 Hanks′, balanced salt solution (HBSS) (含有 10 mM N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES), pH 7.4, 4 mM NaHCO3)，離心(700 g) 10 分鐘，並以低張 NaCl solution (0.05%) 使沈澱細胞中剩餘的紅血球破裂，以去除紅血球83,84 ;再用含有 0.25% bovine serum albumin(BSA)之高張 NaCl solution (1.75%)清洗並調整至等張，使細胞 懸浮於 HESS 中( l × 107cells/ml)，即可製備純度及存活力均大於 95% 的嗜 中性白血球懸浮液。
2.實驗方法
(A) Neutrophil degranulation method
(1) β -glucuronidase 釋放反應之測定85
將嗜中性白血球細胞懸浮液分別與 DMSO 或檢品溶液於 37 °C 培養三分 鐘後，個別加入 fMLP (1 µM)與之作用，經 45 分鐘後，加入冰浴過之
Tyrode′ssolution 中止反應，混合液經離心(1000g) 10 分鐘後取出上清液，
利用上清液中之 β-glucuronidase 與 phenolphthalein-β-D-glucuronide 反應 後，經由分光光度計在 550nrn 測量其中所含的 β-glucuronidase。
(2) Lysozyme 釋放反應之測定86。
同β-glucuronidase 釋放反應之處理後，將所得含 lysozyme 之上清液，利 用 Micrococcus lysodeikticus 細胞作為受質，在分光光度計 450 nm 下測 量。
β-glucuronidase 及 lysozyme 的釋放表示如下 :
release % = (release elicited by secretagogue − spontaneous release) /total content] ×100
(total content 是將細胞懸浮於 Triton X-l00 後所測量之值)
(B) Superoxide formation method
(1) Superoxide anion 釋放反應之測定
將含嗜中性白血球之細胞懸浮液(2×106 cells/ml)以及 ferricytochrome c (0.5mg/ml)的比色槽，置於 37 °C 恆溫的雙光束分光光譜儀中預熱 3 分 鐘，再將 fMLP (0.3 µM)加入此檢品溶液中 30 分鐘，對照組比色槽另含 有 6.6 µg/ml 的 superoxide dismutase (SOD)。加入測試之化合物後，在 550 nm 下測定 SOD 可抑制的 ferricytochrome c 吸光值之變化 87。在
dihydroxyfumaric acid (DHF)自發氧化反應之測量，比色槽中含 0.891 mM DHF 及 0.274mM nitrobule tetrazolium(NBT)，對照組比色槽另外含有 6.6 µg/ml 的 SOD。加入測試之化合物後，在 560 nm 下測定 SOD 可抑制的 NBT 吸光值之變化88。
(四)抗過敏活性試驗方法
1.肥大細胞懸浮液之製備
大鼠經頸部放血後(exsanguinated rats; Sprague-Dawley, 250~300 g)，
10ml 含肝素之 Tyrode's 溶液( Tyrode's sol'n A)注入鼠腹腔內，按摩 1-2 分鐘 並取出腹腔溶液，經 38 % 牛血清蛋白溶液離心，沉澱細胞經清洗後，以 Tyrode's sol'n B 懸浮成每毫升 1-l.5×106個細胞89,90，並測定細胞存活率91。 2.實驗方法
(A) Mast cell degranulation method
(1)組織胺(Histamine)釋放反應之測定 92
將此肥大細胞懸浮液分別與 DMSO 或檢品溶液於 37 °C 培養 3 分鐘，個 別加入 compound 48/80 (10 mg/ml)與之作用，經 15 分鐘後，加入冰浴過 之 Tyrode's solution 中止反應，混合液經離心(1000g)十分鐘後取出上清 液，利用上清液中所含之組織胺與 o-phthaldehyde 聚合後以螢光分光光 度計在 350/450nm 處測量組織胺含量。
*Compound 48/80 : a polymer of N-(p-methoxhenylethy)methylamine with formaldehyde
(2) β-glucuronidase 釋放反應之測定
同 histamine 釋放反應，將所得含 β-glucuronidase 之上清液，利用 phenolphthalein-β-D-glucuronide 作為受質，以分光光度計在 550nm 下測 量所含之 β-glucuronidase
Histamine 及 β-glucuronidase 的釋放表示如下 :
Release % =(releases elicited by secretagogue − spontaneous release) /total content]×100
(total content 是將細胞懸浮於 Triton X-100 後所測量之值)
(五) NO (nitric oxide) 及 TNF-α 實驗方法:
1.材料
(1) Iscove's Modified Dulbecco's Medium 與牛胚胎血清 (fetal bovine serum, FBS) : 購自 Gibco BRL (Gaithersburg)
(2) TNF-α酵素免疫分析(enzyme immunoassay, EIA) kit : 購自 Genzyme Co.(MA)
(3)老鼠干擾素-γ(mouse interferon-γ，IFN-γ) : 購自 R&D Systems(MN) (4)RAW 264.7 mouse macrophage-like cell line : 購自 American Type Culture Collection, MD.
(5)Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)與犢牛胚胎血清(fetal calf serum): 購自 Gibco BRL (Gaithersburg)
(6)其餘試藥皆購自 Sigma(St. Louis, MO.)
2.細胞培養與前處理93
Murine microglial cell lines N9 係以含有 2 % FBS 與抗生素之 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 培養; 在前處理的部分，首先將細胞與代測藥物 於 37°C 混合一小時，之後再以 100 ng/ml 的 LPS(Escherichia coli, serotype
0111:B4)加 100 U/ml IFN-γ刺激 24 小時，最後保存於-70°C 下，需要時才 取出。
RAW 264.7 mouse macrophage-like cell line 則以含有 5% fetal calf
serum、100 units/ml penicillin 與 100µg/ml streptomycin 之 DMEM 培養在前 處理的部分，首先將細胞與代測藥物於 37°C 混合一小時，之後再以 100 ng/ml 的 LPS(Escherichia coli, serotype 0111:B4)刺激 24 小時，最後保存於-70°C 下，需要時才取出。
3. NO 之測定94
依序將 40µl 5 mM 的 sulfanilamide、10µl 2M HCl 及 20µl 40mM
naphthylethylenediamine 加入 150µl 培養基中，於室溫下混合 10 分鐘後，以 microplate 計數器在 550nrn 下測其吸光度。一氧化氮標準曲線則以 NaNO2
於相同條件下所求得。
4.TNF-α之測定
培養基中的 TNF-α 測定係使用 TNF-α enzyme immunoassay (EIA) kit，
依照廠商提供之操作步驟進行測定。
