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運送去氧核醣核酸之融合蛋白及運送方法

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Academic year: 2021

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【19】中華民國      【12】專利公報  (B)

【11】證書號數:I370176 【45】公告日: 中華民國 101 (2012) 年 08 月 11 日 【51】Int. Cl.: C12N15/64 (2006.01) 發明     全 15 頁  【54】名  稱:運送去氧核醣核酸之融合蛋白及運送方法

FUSION PROTEIN FOR DELIVERING DEOXYRIBONUCLEIC ACID AND METHOD FOR DELIVERING

【21】申請案號:095102842 【22】申請日: 中華民國 95 (2006) 年 01 月 25 日 【11】公開編號:200728467 【43】公開日期: 中華民國 96 (2007) 年 08 月 01 日 【72】發 明 人: 陳宗嶽 (TW) CHEN, TZONG YUEH;黃馨怡 (TW) HUANG, SHIN I

【71】申 請 人: 國立成功大學 NATIONAL CHENG KUNG

UNIVERSITY 臺南市東區大學路 1 號 【74】代 理 人: 陳長文 【56】參考文獻: 林素卿(指導教授:陳宗嶽), 開發核酸穿透式運輸系統, 國立成功大學生物科技研 究所碩士論文, 2003.

MC Morris et al, Combination of a new generation of PNAs with a peptide-based carrier enables efficient targeting of cell cycle progression, Vol. 11, p 757-764, 2004.

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-10. 一種運送去氧核醣核酸至細胞之方法,其包含下列步驟:(a)混合欲運送之去氧核醣核酸 及根據請求項 1 至 8 中任一項之融合蛋白,使該欲運送之去氧核醣核酸與該融合蛋白結 合並形成一去氧核醣核酸-蛋白複合體;及(b)將步驟(a)之去氧核醣核酸-蛋白複合體與細 胞共同培養,以容該去氧核醣核酸-蛋白複合體將該欲運送之去氧核醣核酸運送至該細胞 內。 11. 根據請求項 10 之方法,其中步驟(a)中該欲運送之去氧核醣核酸與該融合蛋白係於該細胞 培養液中混合。 12. 根據請求項 10 之方法,其中步驟(a)中融合蛋白與去氧核醣核酸莫耳濃度比(Y)和欲運送 之去氧核醣核酸大小(kb)(X)之關係為:Y=3.0838X2 -14.922X+22.011。 13. 根據請求項 10 之方法,其中步驟(a)中融合蛋白與去氧核醣核酸莫耳濃度比為 10 至 20。 14. 根據請求項 13 之方法,其中步驟(a)中融合蛋白與去氧核醣核酸莫耳濃度比為 15。 15. 根據請求項 11 之方法,其中細胞培養液中另包含濃度約為 0.05mM 之金屬螯合劑。 16. 根據請求項 10 之方法,其中該細胞係源自脊椎動物。 17. 根據請求項 16 之方法,其中該脊椎動物係選自由哺乳動 物及魚所組成之群。 18. 根據請求項 17 之方法,其中該哺乳動物係選自由鼠、猴及人所組成之群。 19. 一種製造根據請求項 1 至 8 中任一項之融合蛋白之方法,其包含下列步驟:(a)構築一核 酸分子,其包含編碼該蛋白質傳遞部分及編碼該去氧核醣核酸結合部分之序列,其中該 蛋白質傳遞部分包含具有序列辨識編號 2 胺基酸序列之胜肽片段;及該去氧核醣核酸結 合部分包含拓樸異構酶之胺基端 200 個胺基酸序列中具有核配置訊號區域之胜肽片段, 其中該去氧核醣核酸結合部分具有選自由序列辨識編號 3、序列辨識編號 4、序列辨識編 號 5、序列辨識編號 6 及序列辨識編號 7 所組成之群之胺基酸序列;(b)將步驟(a)之核酸 分子轉殖入一宿主,且利用該宿主表現該融合蛋白;及(c)自步驟(b)之宿主純化該融合蛋 白。 20. 根據請求項 19 之方法,其中該宿主係為細菌。 圖式簡單說明 圖 1 為質體構築示意圖;(1)Pep-1-TP;(2)Pep-2-TP;(3)TOPN;(4)Pep-1-TP;及 (5)Pep-2-TP。 圖 2 為根據本發明之融合蛋白表現之聚丙烯胺膠電泳圖。 圖 3 為根據本發明之融合蛋白表現之西方墨點圖。

圖 4 為 Pep-1-TP 結合質體之測試結果圖;(a)Pep-1-TP 和 pCMV-Mx-EGFP-N1 之結合;(b)BSA 和 pCMV-Mx-EGFP-N1 之結合;C 為 pCMV-Mx-EGFP-N1;Mr 為 DNA 標示;ProK 表示蛋白酶 K;阿拉伯數字表示 Pep-1-TP 和 CMV-Mx-EGFP-N1 混 合時的莫耳比例。

圖 5 為 Pep-1-TP 結合大小質體之測試結果圖;(a)Pep-1-TP 和 pBSK+ (3.0kb)之結 合;(b)Pep-1-TP 和 pEGF-N1(4.7kb)之結合;(c)Pep-1-TP 和 pCMV-Mx-EGFP-N1 (8kb)之結合;C 為 pCMV-Mx-EGFP-N1;Mr 為 DNA 標示;ProK 表示蛋白酶 K;阿拉 伯數字表示 Pep-1-TP 和 CMV-Mx-EGFP-N1 混合時的莫耳比例。

圖 6 為 COS7 細胞株中 Pep-1-TP 與質體之莫耳濃度比與傳送之測試結果圖;(a)為控制 組;(b)為商用脂質體傳送 pEGFP-N1 之對照組;(c)、(g)、(h)、(i)為不同莫耳比例之 Pep- 1-TP 和 pEGFP-N1 混合;(d)、(e)、(f)則是(a)、(b)、(c)在 OD488nm 下的情形。

圖 7 為添加金屬螯合劑與傳送效率之測試結果圖;(a)不添加;(b)添加 0.05mM EDTA。 圖 8 為 Pep-1-TP 之保存及穩定度之測試結果圖;(a)第三週;(b)第八週。

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數據

圖 9 為 Pep-1-TP 結合質體經 37℃處理 24 小時後之測試結果圖;(a)1 小時;(b)24 小 時;C 為 pCMV-Mx-EGFP-N1;PC 為未經處理的 Pep-1-TP 與 pCMV-Mx-EGFP-

參考文獻

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