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國立臺東大學 生命科學系 碩士論文

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Academic year: 2022

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國立臺東大學 生命科學系 碩士論文

Department of Life Science National Taitung University Master Thesis

指導教授:魏百祿 博士 Advisor: Bai-Luh Wei, Ph. D.

超臨界二氧化碳流體萃取台灣真柏最適條件及抗氧 化、抗菌活性探討

Study on the optimal condition of supercritical fluid extraction for Juniperus chinensis var. sargentii A.

Henry and its antioxidant and antimicrobial activity

研究生:林彥妏 撰 Student : Yan-Wen Lin 中華民國 105 年 1 月

January, 2016

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I

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II

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III

致謝

首先要感謝魏百祿老師這兩年半來的教導,在碩士的兩年半期間即使家事、

公事繁忙也會撥空指導我,幫助我完成此篇論文,真的萬分感謝。同時也要感謝 大仁科技大學食品科技系教授王進琦老師與臺東大學生命科學系副教授李俊霖 老師,非常感謝你們撥空審查我的計畫書及論文,並來到臺東口試,也感謝老師 們對我論文內的問題提供許多建議,讓此篇論文可以更加完善。

接著我要感謝提供我個方面幫助的各位,首先我要感謝蘇東方先生提供台灣 真柏的心材,讓我可以順利的進行實驗。感謝李俊霖老師在實驗上提供我操作上 的建議。感謝黃祥恩老師、林志輝老師和杏姊提供我實驗上所需的菌種、材料,

讓我能順利完成這篇論文。謝謝怡菁學姊在行政方面的大力幫忙,讓我能順利的 處理行政事務,真的是非常感謝你。謝謝嘉麒學長、書敏學長、拓羽學長、俊毅 學長在各方面給予我很多建議和鼓勵,不管是學業、實驗還是做報告,都給予我 相當大的幫助,真的是非常感謝你們。謝謝馨儀在我灰心喪志的時候鼓勵我,讓 我有動力繼續走下去,我能夠順利的完成碩士班的學業,妳是非常重要的關鍵人 物,真的是非常感謝妳推了我一把。謝謝蔡老師在我水深火熱時,幫我加油打氣。

謝謝德儀、怡倫、姚毅前、裕晨,在我需要人手幫忙的時候情義相挺,讓我減輕 了不少負擔,有你們這群小幫手讓我感到非常幸運。

求學過程雖然有笑容,但也有無數的心血和汗水,甚至也有迷惘,這裡我要 感謝我的家人總在我最需要幫助的時候拉我一把,讓我能堅定地走下去,真的是 非常感謝你們的支持與鼓勵,在此我將這本論文獻給你們。

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IV

中文摘要

近幾年相關研究中,從柏科圓柏屬植物所分離出的萃取物具有抗氧化和抗菌 等等生物活性,利於應用在醫療上用途,本實驗將以台灣真柏心材透過超臨界二 氧化碳流體萃取可萃取出萃取物,並以 HPLC 判定化合物的含量,以進行抗氧化 和抗菌的研究。將台灣真柏心材陰乾後磨粉後,以超臨界二氧化碳流體在不同條 件下進行萃取,實驗結果顯示最佳萃取溫度為 55 ℃,最佳萃取壓力為 250 bar,

最佳萃取共溶劑條件為甲醇 5 % 和 10 %;乙酸乙酯 5 % 和 30 % ;丙酮 25

% ;正己烷 25 %,將所得之萃取物進行 DPPH 自由基清除之抗氧化活性分析 和抗菌試驗。實驗結果顯示共溶劑萃取條件為丙酮 25 % 與丙酮 30 % 之 DPPH 自由基清除效果最佳,其 EC50 分別為 153 μg/mL 與 145 μg/mL。而抗菌試驗結 果顯示台灣真柏心材萃取物對白色念珠菌具有良好的抑菌功效。

關鍵字: 台灣真柏心材、超臨界二氧化碳流體萃取、抗氧化、抗菌

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V

Abstract

In recent years, the related research shows that the separated extracts of Juniperus L. ( Cupressaceae ) have many biological activities like antioxidant and antimicrobial, and conducive to use at medical purposes. In this work were extracted more completed compounds from Juniperus chinensis var. sargentii A. Henry by using supercritical carbon dioxide. Then identify the content of compounds with HPLC, and evaluated the antioxidant and antimicrobial potential of the extracts. After dried and milled the Juniperus chinensis var. sargentii A. Henry, extracting by different conditions of supercritical carbon dioxide. The result shows that the best extracted temperature is 55℃, the best extracted pressure is 250 bar, the best extracted condition of co-solvent is 5 % and 10 % methanol; 5 % and 30 % ethyl acetate; 25% acetone and 25% hexane. The extractions were accomplished to investigate the influence of antioxidant and antimicrobial potential. The best extracted condition of DPPH free radical scavenging activity is 25% and 30 % acetone, its EC50

value is 153 μg/mL and 145 μg/mL respectively. Antimicrobial testing results show that the extraction of Juniperus chinensis var. sargentii A. Henry has good antimicrobial activity to against Candida albicans.

Key word: Juniperus chinensis var. sargentii A. Henry, supercritical carbon dioxide, antioxidant, antimicrobial

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VI

目錄

前言………...1

第一章 文獻回顧………..………...2

第一節、台灣真柏………...2

第二節、超臨界流體萃取………...5

第三節、氧化壓力和抗氧化劑………..11

第四節、病原菌和天然抗菌劑………..14

第二章 實驗動機與實驗架構 ……….……….17

第一節、實驗動機與目的……….………..17

第二節、實驗架構……….………..17

第三章、實驗材料與方法………19

第一節、實驗材料……….…..19

第二節、實驗方法……….………..21

第四章、結果……….….….…29

第一節、超臨界流體萃取最佳萃取條件探討………...29

第二節、DPPH 自由基清除率探討………..45

第三節、抗菌效果探討……..…..………...59

第五章、討論………..….……65

第一節、超臨界流體萃取對台灣真柏心材萃取物成分之影響………65

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VII

第二節、不同超臨界流體萃取條件之台灣真柏心材萃取物 DPPH 自由基清 除率……….………..….………..66 第三節、不同超臨界流體萃取條件之台灣真柏心材萃取物抗菌效果………69 第六章、結論………..70 第七章、參考文獻………..71

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VIII

表目錄

表一、各種化學物質的臨界壓力、溫度和密度………..6

表二、液體,氣體和超臨界流體的密度,擴散係數和黏度比較………..8

表三、J. chinensis 木材所含之五種化合物之 DPPH 自由基清除效果………….13

表四、杜松精油紙碇擴散法之抗菌活性………..15

表五、萃取物之 HPLC 分析條件………24

表六、台灣真柏心材萃取物樣品編號………28

表七、壓力300 bar下不同溫度之超臨界萃取率………..29

表八、壓力300 bar下不同溫度之超臨界萃取物 HPLC 分析面積值………30

表九、溫度 55 ℃下不同壓力之超臨界萃取率………..……….31

表十、溫度 55 ℃下不同壓力之超臨界萃取物 HPLC 分析面積……….32

表十一、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 甲醇共溶劑之超臨界萃取 率……….. ………..……… 33

表十二、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 甲醇共溶劑之超臨界萃取物 HPLC 分析面積值………..…………35

表十三、以溫度 55 ℃和壓力 250 bar 下不同 % 乙酸乙酯共溶劑之超臨界萃取 率………..………36

表十四、以溫度 55 ℃和壓力 250 bar 下不同 % 乙酸乙酯共溶劑之超臨界萃取 物 HPLC 分析面積值….………..………..38

表十五、以溫度55 ℃ 和壓力250 bar 下不同 % 丙酮共溶劑之超臨界萃取率.39

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IX

表十六、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 丙酮共溶劑之超臨界萃取物

HPLC 分析面積值………41 表十七、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 正己烷共溶劑之超臨界萃取 率………..………..42 表十八、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 正己烷共溶劑之超臨界萃取物

HPLC 分析面積值………44 表十九、不同條件下超臨界二氧化碳流體萃取之台灣真柏心材萃取物抗菌活性篩 選結果………..………..61 表二十、不同條件下超臨界二氧化碳流體萃取之台灣真柏心材萃取物紙錠擴散法 結果………..…………..64 表二十一、不同超臨界流體萃取條件之台灣真柏心材萃取物之 HPLC 分析面積 值與 EC50 之比較……….68

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X

圖目錄

圖一、台灣真柏葉之外觀………3

圖二、台灣真柏實際樣本外觀………4

圖三、二氧化碳的超臨界狀態………7

圖四、實驗架構圖………..18

圖五、實驗植物前處理………..21

圖六、超臨界二氧化碳流體萃取部件………..23

圖七、壓力 300 bar 下不同溫度之超臨界萃取物 HPLC 分析 35-43 分鐘…..30

圖八、溫度 55 ℃ 下不同壓力之超臨界萃取物 HPLC 分析 32-44 分鐘……32

圖九、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 甲醇共溶劑之超臨界萃取物 HPLC 分析 ( a ) 32-42 分鐘 ( b ) 0-20 分鐘……….34

圖十、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 乙酸乙酯共溶劑之超臨界萃取 物 HPLC 分析 ( a ) 32-42 分鐘 ( b ) 0-20 分鐘………..37

圖十一、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 丙酮共溶劑之超臨界萃取物 HPLC 分析 ( a ) 31-44 分鐘 ( b ) 0-20 分鐘………..40

圖十二、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 正己烷共溶劑之超臨界萃取 物 HPLC 分析 32-42 分鐘………43

圖十三、以不同溫度條件下以 300 bar 萃取之反應 0-30 分鐘之 DPPH 自由基 清除率………45 圖十四、以不同壓力條件下以 55 ℃ 萃取之反應 0-30 分鐘之 DPPH 自由基清

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除率………46 圖十五、以不同 % 甲醇共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取反應 0-30 分鐘 之 DPPH 自由基清除率………..47 圖十六、以不同 % 乙酸乙酯共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取反應 0-30 分 鐘之 DPPH 自由基清除率………..48 圖十七、以不同 % 丙酮共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取反應 0-30 分鐘 之 DPPH 自由基清除率………..49 圖十八、以不同 % 正己烷共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取反應 0-30 分鐘 之 DPPH 自由基清除率………..50 圖十九、以不同 % 甲醇共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取之 0.5 mM DPPH 自由基清除率………51 圖二十、以不同 % 乙酸乙酯共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取之 0.5 mM DPPH 自由基清除率………52 圖二十一、以不同 % 丙酮共溶劑條件下以 55 ℃、 250 bar 萃取之 0.5 mM DPPH 自由基清除率………53 圖二十二、以 15 % 正己烷共溶劑條件下以 55 ℃、 250 bar 萃取之 0.5 mM DPPH 自由基清除率………54 圖二十三、不同條件下超臨界二氧化碳流體萃取之萃取物 DPPH 自由基清除率 之 EC50………58

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XII

圖二十四、不同溫度、壓力與共溶劑之超臨界二氧化碳流體萃取物對C. albicans 、

K. pneumoniae、 B. subtilis 之抑菌效果………60

圖二十五、不同溫度、壓力與共溶劑之超臨界二氧化碳流體萃取物對 C.

albicans 、 B. subtilis 之紙錠擴散法抑菌效果……….63

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1

前言

人類的壽命越長,人口逐漸老化,現在正在使用中的藥物對各種慢性病、癌 症及疑難雜症,在治療上除了愈來愈難治癒外,同時也伴隨著非常多的副作用,

使人們開始想以天然藥物來研發新的治療藥物,期望能治療現在藥物無法治好的 疑難雜症,同時也能減少藥物對身體的副作用。在早期研究中,中草藥中的天然 化合物具有減緩癌細胞生長和治療癌症的潛力 ( Montbriand, 2004 )。天然化合物 在結構上具有多樣性,而且在生物活性上也有表現特異性,所以天然化合物做為 藥物研發是非常具有潛力的。

近 幾 年 相 關 研 究 中 , 從 柏 科 圓 柏 屬 植 物 所 分 離 出 的 萃 取 物 具 有 抗 菌 ( Karaman, 2003; Pepeljnjak et al.,2005 ) 和抗氧化 ( Lim et al., 2002 ) 等等生物活 性,利於應用在醫療上用途,而台灣真柏心材其所含成分及功效尚未有人分析,

所以本實驗將以台灣真柏 Juniperus chinensis var. sargentii A. Henry 作為材料。

台灣真柏生長於海拔 1400 公尺,經人工馴化,栽培於平地。就型態上跟其 他圓柏屬的植物有所不同,最明顯特徵就是從原本的鱗片葉變異成了針狀葉,在 大陸東北、日本、韓國、蘇俄亦有分佈,其所含成分尚未有人分析,因此選擇台 灣真柏心材來進行研究料,透過超臨界二氧化碳萃取可萃取出萃取物,以進行抗 氧化和抗菌的研究,期望能應用在醫療用途上。

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2

第一章、文獻回顧

第一節、台灣真柏

柏科的圓柏屬 ( Juniperus ),為常綠性的喬木或灌木,果實的鱗片癒合而為 圓球狀的一體,靠鳥類或小型哺乳類採食傳播,異於一般松柏類常見的鱗片毬果 與風播性的帶翅種子。圓柏屬中包含 67 個種與 28 個變種,是裸子植物中的一 個多樣性相當高的分類群。本屬生育地的多樣性也非常可觀,由海平面一直到高 山的林木界線以上,甚至沙漠、石灰岩地、沼澤等。至於地理分佈上,則廣佈於 歐、亞、北美範圍,只有幾個種類例外性地分佈於非洲少數地區而已 ( Adams, 2004 )。

台灣真柏,為柏科的圓柏屬植物,學名為 Juniperus chinensis var. sargentii A.

Henry,生長於海拔 1400 公尺,經人工馴化,栽培於平地。形態特徵為常綠木匍 匐性矮灌木,樹幹的樹皮呈褐色向上生長,小枝作密叢狀向上斜展,葉型態有針 狀葉和鱗片葉兩種,鱗片葉為主,極少數針狀,葉為深綠色重疊鱗片呈繩狀,針 狀葉細短,通常交互對生或 3 葉輪生,長 3-6 mm,緊密排列,球果近球形,成 熟時褐色,有 2-3 粒種子,通常為雌雄異株,很少雌雄同株,可養成盆景或用於 綠化環境,觀賞價值極高 ( Adams, 2004 )。

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圖一、台灣真柏葉之外觀

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圖二、台灣真柏實際樣本外觀

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第二節、超臨界流體萃取

自然界物質通常具有固、液、氣三相,固相有一定的形狀和體積;液相雖有 一定的體積,卻無固定的形狀;氣相則無固定形狀,也無一定體積。任何自然界 的物質在不同的溫度與壓力下都會有類似的相變化,變化前後是具有不同特性的 相。每一種物質也都有其特定的溫度及壓力,稱為臨界壓力與臨界溫度如表一所 示,當未達臨界點前常可藉由溫度與壓力的增減使物質產生液相與氣相之間的轉 變,且相與相之間會有明顯的界面存在。但是一旦壓力到達或超過其臨界壓力且 溫度到達或超過其臨界溫度時,便不會有相變化,其性質既近似氣相但非氣相、

近似液相但也非液相,整個系統呈現一均勻狀態即此物質之超臨界流體 ( Super Critical Fluid, SCF ) ,而超臨界萃取 ( supercritical fluid extraction, SFE )技術 是利用二氧化碳的超臨界狀態來進行萃取,如圖三 ( 連和孫 , 2009 ) 所示。

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6

表一、各種化學物質的臨界壓力、溫度和密度( Reid et al., 1987 )

Table 1 Variety chemical substances of critical pressure, temperature and density.

( Reid et al., 1987 )

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圖三、二氧化碳的超臨界狀態

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超臨界流體的源起,是在 1822 年科學家首次報導了物質的臨界現象。19 世紀的化學家 Mendeleevn 曾針對高壓氣體的狀態進行了詳細的研究與討論。

1869 年 Andrews 提出超臨界現象與狀態。1879 年 Hannay 與 Hogarth 發現超臨界 流體的溶解能力極佳,預測超臨界流體會是一種可在工業上應用的極佳溶劑。

1962 年 Zosel 首次提出了超臨界萃取 ( supercritical fluid extraction, SFE )技 術,用於脫除咖啡豆中咖啡因的工業化製程。從此,超臨界萃取技術就成為眾人 矚目的新分離技術 ( 連和孫 , 2009 )。

在超臨界狀態下,物質的性質與特性會有所改變。一般而言,超臨界流體的 物理性質是介於氣、液相之間的,例如其黏度接近氣體而密度則接近液體如表二 所示,其擴散係數 ( diffusion coefficient ) 高於液體 10 至 100 倍以上。二氧化碳 氣體經加壓、加溫至超臨界狀態變成親有機性因而具有溶解有機物的能力,更具 備低表面張力、低黏度、高擴散性與高質傳效率的特性,同時因無色、無臭、無 毒、不產生光化學反應、未對環境造成汙染、易於回收再使用等優點,且因其密 度接近液體因而具有很好的媒合能力,使得超臨界流體容易進入萃取物中將溶質 帶出,具有絕佳的萃取效果,是目前超臨界萃取技術中極佳的溶劑。

表二、液體,氣體和超臨界流體的密度,擴散係數和黏度比較 ( Szekely, 2007 ) Table 2 Comparison of liquids, gases and supercritical fluids density

diffusion coefficient and viscosity. ( Szekely, 2007)

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超臨界流體萃取的基本原理是在高於臨界溫度和臨界壓力的條件下,用超臨 界流體溶解出所需的化學成分,然後降低流體溶液的壓力或升高流體溶液的溫 度,使溶解於超臨界流體中的溶質因其密度下降溶解度降低而析出,從而實現特 定溶質的萃取 ( 陳和王 , 2003 ) 。

超臨界二氧化碳流體萃取是用無毒、無殘留的二氧化碳代替水或有機溶劑作 萃取介質並在接近室溫的條件下萃取,只要簡單地改變溫度或壓力就可使溶質在 二氧化碳中的溶解度發生很大的改變,其最大優點在於可將萃取、分離和去除有 機溶劑等多個過程合而為一,簡化了萃取流程,進而提高生產效率,同時也減少 甚至不會對環境造成污染。從目前的研究結果來看,使用超臨界二氧化碳流體萃 取和傳統萃取方法相比,超臨界二氧化碳流體萃取具有許多獨特的優點。

(1)二氧化碳無色、無味、無毒,且通常條件下為氣體,無溶劑殘留問題,

作為萃取劑使用絕對安全健康。

(2)萃取流程簡單、操作步驟少、花費時間縮短,簡化了某些分離精製的 步驟,使生產週期縮短,進而提高效率。

(3)萃取時溫度接近室溫,整個萃取分離過程在黑暗中進行,對濕、熱、

光敏感的物質和芳香性物質的萃取特別合適,避免了傳統萃取過程中經常發生的 分解、沉澱等反應,能最大限度地保持化合物原有的特性,對藥效成分分析提供 較準確的結果。

(4)超臨界二氧化碳流體的萃取能力會隨溫度和壓力的改變而產生變化,

因此可以通過改變溫度和壓力來達成選擇性萃取分離。

(5)超臨界二氧化碳流體的溶解能力和滲透能力強、擴散速率快,且如是 在動態萃取條件下進行的,萃取物會不斷被二氧化碳帶出,使萃取化合物較完全。

(6)二氧化碳流體在萃取過程時不會改變溶質之外的任何成分。

(7)二氧化碳價格較低容易取得,其臨界溫度和臨界壓力低,操作上易於

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實現,並可循環使用,使產品的成本大為降低。

而植物中的揮發性芳香成分由精油和某些特殊香味的成分構成。精油的分離 一般使用水蒸氣蒸餾法,使精油和香味成分從植物組織中萃取出來。但應用傳統 的萃取方法,植物中部分不穩定的成分容易因熱變質,而有機溶劑殘留以及低沸 點頭香成分的損失也影響精油產品的香氣。因此,室溫操作的超臨界二氧化碳流 體萃取就成了傳統的萃取方法-水蒸氣蒸餾法和有機溶劑萃取法的最佳替代方 法。

芳香成分的二氧化碳流體萃取,一般使用液體二氧化碳或低壓下的超臨界二 氧化碳流體,所得到的萃取物主要成分為精油;若在超臨界條件下精油和香味成 分可同時被抽出,而且由於植物精油在超臨界二氧化碳流體中的溶解度很大,與 二氧化碳幾乎能完全互溶,因此精油可以完全從植物組織中被萃取出來,加上超 臨界二氧化碳流體對固體顆粒的滲透性很強,使萃取過程不但效率高,而且與傳 統的萃取方法相比具有較高的萃取率。

超臨界二氧化碳流體萃取技術作為一種新的萃取方法,可以起到高效率分離 或濃縮有效成分的作用。儘管超臨界二氧化碳流體萃取技術在應用過程中會遇到 設備一次性投資較大的問題,在操作成本上比傳統的水蒸氣蒸餾法和有機溶劑萃 取法都高,但在發展過程中仍表現出強大的競爭力,是因為它的產物在組成上具 有傳統方法無法比擬的優點。

(1)與水蒸氣蒸餾法相比,超臨界二氧化碳流體萃取產物具有較高的含氧 化合物含量和較低的單萜烴含量,而精油香氣的關鍵組分多是含氧化合物,單萜 烯烴一般對香氣的貢獻較小,並且容易氧化變質,從而影響精油品質。

(2)超臨界二氧化碳流體萃取法自始至終都在較低的溫度下進行,因此產 物中會含有較多的頭香成分。

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(3)超臨界二氧化碳流體能萃取出部分油脂,故產物中含有較多的底香成 分,有利於香氣的持久。雖然有機溶劑也能萃取出底香成分,但選擇性差,產物 油樹脂中往往含有大量雜質,如蠟、蛋白質、色素、樹脂等,影響其在各面的應 用。

(4)水蒸氣蒸餾因在高溫下進行,故有些成分會發生水解或其他反應,進 而影響了精油品質;有機溶劑萃取也存在類似情況,而超臨界二氧化碳流體萃取 法能有效防止精油中熱敏感性或穩定性較差的成分被破壞。

(5)有機溶劑萃取都在不同程度上存在著有機溶劑殘留的問題,這與各國 日益嚴格的食品安全法規極難相容,因超臨界二氧化碳流體萃取不含有機溶劑殘 留問題,因此在天然香料工業中具有廣闊的應用前景。

第三節、氧化壓力和抗氧化劑

氧為維持生命所需要的物質,在生物體正常的生理代謝過程中,自由基多源 於粒線體電子傳遞鏈( electron transport chain )、過氧化酶( peroxidase )、細 胞色質 P-450( cytochrome P-450 )等系統下產生 ( Meier & Habermehl, 1990;

Halliwell & Aruoma, 1993 )。自由基之定義為任一分子或原子,以一個或一個以 上不成對電子的形式存在;許多活性氧物質 ( 如 O2-• 及 •OH ) 屬於自由基 ( free radical ),其電子軌域外層軌道上含有未配對的電子或原子團,因此其相當 活潑,會攻擊體內許多重要分子。

活性氧物質會傷害細胞或組織,導致許多疾病發生,如癌症、中風、高血壓、

風濕性關節炎、動脈粥狀硬化、缺血再灌流傷害和白內障等,在老化過程中,活 性氧物質同樣扮演著重要的角色 ( Halliwell & Aruoma, 1991 ) 。活性氧物質其 來源可分為外源及內生兩方面,外在來源可能為長時期曝露在具有電磁波、化學 毒物及輻射環境下,而誘導體內產生活性氧物質;內在來源除了生物體內氧化還 原反應 ( 主要來自於粒線體的電子傳遞鏈 )。O2-• 是人體中最先產生也是最

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多的一種自由基,O2-• 會與氫質子形成 HO2•,攻擊細胞膜上不飽和脂肪酸,而 引發脂質過氧化反應 ( Hicks & Gebicki, 1981 )。

另 •OH 是最活潑的自由基,相當不穩定,會攻擊粒線體的 DNA、細胞膜 上的不飽和脂肪酸和醣類,使得脂肪酸氧化,膜上的蛋白質結構也因此受到破 壞。當 •OH 在 DNA 附近時其不僅可能與 DNA 上的鹼基結合,也可能從中搶 奪氫質子,造成 DNA 結構的改變 ( Pryor, 1988 )。這些活性高、且帶有不成對 電子的自由基,其性質相當的不穩定,會再去奪取其他物質的電子,使自己原本 不成對的電子成對。而被奪取電子的物質也因此變得不穩定,為了自身結構的穩 定,就會再去奪取其他物質的電子,於是產生連鎖式反應,稱之為「自由基連鎖 反應」。

然而在人體生理維持正常的情況下,碰到細菌、黴菌或病毒等異物入侵時,

身體的防禦系統便會派出吞噬細胞來抵抗外敵,吞噬細胞經由酵素的催化,產生 了超氧陰離子自由基,用以清除細菌或受感染細胞,因此體內原本就存在一定量 的自由基 ( Harman, 1972 )。但隨著年齡的增加,體內老化的組織會產生更多自 由基物質,而體內對抗自由基的物質會減少,再加上日常生活中的一些環境因子 也會增加自由基的產生,如抽煙、喝酒、飲食失調、食品添加物、藥物、情緒、

壓力、環境污染、輻射和電磁波等,使得細胞失去對自由基的抵抗能力,並且降 低了細胞內抗氧化防禦系統的能力及酵素活性 ( Newton et al., 1989; Sohal & Allen, 1990 )。

隨著維生素 A、C 和 E 的發現,人們發現到抗氧化劑在生物體內所引起的生 化作用,相當重要 ( Jacob, 1996; Knight, 1998 ),透過微生素 E 防止脂質過氧化 的研究,得知抗氧化劑可作為還原劑,並且透過抗氧化劑與活性氧物質的反應,

來抑制活性氧物質對於細胞所產生的破壞,來達到抗氧化的效果,因此抗氧化劑 可以幫助人體降低活性氧所造成的傷害 ( Wolf, 2005; Halliwell et al., 1995 )。

前人研究顯示,圓柏屬植物心材具有良好的抗氧化效果,將木材以甲醇浸泡

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萃取,得到 quercetin, naringenin, taxifolin, aromadendrin 和 isoquercitrin 等化合 物。由表三可發現 quercetin 和 isoquercitrin 在半抑制濃度 ( IC50 ) 時分別只需用 2.3 和 7.2 μg/ml,比 BHA 人工抗氧化劑 ( BHA 的主要用途是在食品、食品包 裝、化妝品和石油產品中起到抗氧化劑和防腐劑作用 ) 的使用量還少,由此可 得知 quercetin 和 isoquercitrin 在 DPPH 自由基清除時所需的藥劑濃度比 BHA 低,一樣可以達到清除 50 % DPPH 自由基,可證明 quercetin 和 isoquercitrin 這兩樣黃酮類化合物是有良好的抗氧化效果,而其中又以 quercetin 效果為最佳 ( Lim et al., 2002 ) 。

表三、J. chinensis 木材所含之五種化合物之 DPPH 自由基清除效果 ( Lim et al., 2002 )

Table 3 Scavenging effects of the compounds 1-5 from the heartwood of J. chinensis on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ( DPPH ) radical. ( Lim et al., 2002 )

*The values indicate 50% decrease of DPPH radical and are the means of triplicate data.

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第四節、病原菌和天然抗菌劑

二十世紀抗生素及其他抗生物藥劑的發現及研發,治癒許多傳染病,也拯救 了無數的生命,對人類提供了極大的貢獻。由於過去二、三十年台灣經濟發展,

人民生活水準提升,各種藥物及抗生素快速的引進台灣。在無健全的醫療管理系 統管控抗生素之下,造成抗生素的濫用,再加上畜牧養殖業者為了促使飼養的動 物快速生長及避免瘟疫的發生,因此在飼料中添加大量的抗生素。伴隨這些普遍 使用抗生素的結果,自然造成台灣地區的細菌有極高比例的抗藥情形。

精油之抗菌活性最早應用於食品工業上,因其本身具有天然之芳香成分,常 應用為食品的香料,且其抗氧化性也可以防止食物的腐敗或變質。但在許多最近 之研究報告指出,精油之抗菌活性也可應用於醫藥方面。

前人研究顯示,圓柏屬植物的葉子和果實所萃取出的精油在抗菌上是有不錯 的效果的 ( Karaman, 2003; Pepeljnjak et al.,2005 ) ,由表四可發現圓柏屬植物果 實 所 萃 取 出 的 精 油 對 Bacillus cereus ATCC 11778, Shigella sonnei MFBF, Klebsiella oxytoca MFBF 和 Candida parapsilosis MFBF 有較顯著的抗菌效果,

由此可得知圓柏屬植物果實所萃取出的精油在抗菌上是非常具有發展潛力的 ( Pepeljnjak et al.,2005 )。

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表四、杜松精油紙碇擴散法之抗菌活性( Pepeljnjak et al., 2005 )

Table 4 Antimicrobial activity of the juniper essential oil by the diffusion method.

( Pepeljnjak et al., 2005 )

ATCC – American Type Culture Collection, Rockville, USA.

NCTC – National Collection of Type Cultures, London, Great Britain.

MFBF – number of strains from the Collection of microorganisms of the Department of Microbiology,

Faculty of Pharmacy and Biochemistry, University of Zagreb, Zagreb, Croatia.

AEø – microbicidal influence of aerosol.

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其中特別提到果實所萃取出的精油對 Klebsiella 屬和 Candida 屬有較顯著 的抗菌效果,而這兩屬的菌株是醫院常見的伺機性醫院內感染病原菌,它們在病 患免疫力低弱時容易引發多種併發症,進而導致病患死亡,是致死率相當高的病 原菌。

克雷伯氏菌屬( Klebsiella )是革蘭氏陰性菌,桿狀,是德國微生物學家 Edwin Klebs ( Ryan & Ray, 2004 )在 1887 年首次描述了克雷伯氏肺炎菌 ( Bagley, 1985 )。克雷伯氏菌在自然環境中普遍存在,它們在病患免疫力低弱時 容易造成肺炎、尿路感染、敗血症、腦膜炎、腹瀉和軟組織感染 等併發症 ( Podschun & Ullmann, 1998 )。然而除了院內感染之外,近年來社區型感染也漸 漸增加。在台灣的糖尿病病患中,克雷伯氏菌經常是造成肝膿瘍 ( liver abscess ) 的病源 ( Fang, 2004 )。克雷伯氏菌屬包含 12 個種,其中,克雷伯氏肺炎菌 ( Klebsiella pneumoniae ) 在臨床上是此菌屬中最重要的致病菌。

念珠菌屬 ( Candida ) Ascomycota 門、Endomycetes 綱、Saccharomycetales 目,是酵母菌,念珠菌症一般為 Candida 菌種,通常為白色念珠菌 ( Candida albicans ) 所引起之疾病。目前已經有超過 150 種念珠菌被記載,其中僅有九 種菌種被認為對人具有病原性,包括為已知人類伺機性病原菌 C. albicans, C.

dubliniensis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. lusitaniae, C. parapsilosis, C. pseudotropicalis, 和 C. tropicalis。在病患免疫力低弱時,念珠菌就會大量繁 殖,引起臨床併發症狀。絕大多數引起口腔、食道、黏膜感染,嚴重時會造成侵 犯性或全身性感染。念珠菌已是院內感染菌血症之重要致病菌之一,且死亡率高 達 40-60 % ( 蔡等 , 2013 )。

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第二章、實驗動機與實驗架構

第一節、實驗動機與目的

現在正在使用中的藥物對各種疾病,在治療上除了愈來愈難治癒外,同時也 伴隨著非常多的副作用,使人們開始想以天然藥物來研發新的治療藥物,期望能 治療現在藥物無法治好的疑難雜症,同時也能減少藥物對身體的副作用。

近幾年相關研究中,從柏科圓柏屬植物所分離出的萃取物具有抗氧化 ( Lim et al., 2002 ) 和抗菌 ( Karaman, 2003; Pepeljnjak et al.,2005 ) 等等生物活性,研究 結果顯示圓柏屬植物所萃取出的化合物對於抗氧化和抗菌都有不錯的成果,而台 灣真柏心材其所含成分尚未有人分析,因此選擇台灣真柏心材來進行研究材料,

期望透過超臨界二氧化碳萃取可萃取出萃取物,以進行抗氧化和抗菌的研究,期 望能應用在醫療用途上。

第二節、實驗架構

本實驗架構如圖四所示。先以不同壓力、溫度和共溶劑以超臨界二氧化碳流 體進行萃取,獲得不同萃取條件下之真柏超臨界萃取物萃取率,再進行高效能液 相層析儀 ( HPLC ) 進行成分分析,得到萃取物所含之化合物含量,最後進 行抗氧化和抗菌活性,測試不同超臨界二氧化碳流體萃取條件下是否會對抗氧化 和抗菌活性造成影響。

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圖四、實驗架構圖

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第三章、實驗材料與方法

第一節、實驗材料 一、儀器設備

1. 實驗室級超臨界流體萃取系統 ( Supercritical Fluid Extraction System ) Applied Separations, USA

2. 空氣壓縮機 ( Air compressor ) JW-2025,竣幃企業有限公司, Taiwan 3. 冷卻水循環裝置 ( Cooling Water Circulators ) CA2000, EYELA, Japan 4. 真空減壓濃縮機 ( Rotary evaporatoes ) Rotary Vacuum EvaporatorN-1000V, EYELA, Japan

5. 恆溫水浴槽 ( Water bath ) FirstTek scientific, Taipei, Taiwan

6. 電子分析天平 ( High precision electronic balance ) TB-2150D DENVER, USA 7. 針頭式過濾器 ( 0.22 µm syringe filter nylon membrane ) ChromTech Co.

8. 抽氣過濾器 ( Exhaust filter ) ASPIRATOR A-3S, EYELA, Japan

9. 純水製造機 ( Ultrapure water system ) RO-1070, PA-E Machinery Industrial CO., Taichung, Taiwan

10. 高效能液相層析儀 ( High performance liquid chromatography, HPLC ) Model L-2130, Hitachi Co., Tokyo, Japan

11. HPLC 自動取樣器 ( Autosampler ) Model L-2200, Hitachi Co., Tokyo, Japan 12. HPLC 偵測器 ( Diode Array Detector ) Model L-2455 DAD, Hitachi Co., Tokyo, Japan

13. HPLC 層析管柱 ( column ) RP-18 GP 250-4.6 ( 5 μm ), Kanto Chemical Co., Tokyo, Japan

14. 酵素免疫分析儀 ( Enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA ) Sunrise, Tecan Trading AG, Switzerland

15. 滅菌釜 ( Autoclave ) Model ss-320, Tomy CO., Tokyo, Japan

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16. 震盪培養箱 ( Shaking Incubators ) LM-570R

17. 超音波震盪洗淨機 ( Ultrasonic steri-cleaner ) 敦華電子材料有限公司,

LEO-S1424, Taiwan

18. 熱風烘箱 ( Forced convection oven ) DK63, Yamato, Japan

二、藥品試劑

1. CO2 購自 臺東蒙恩氣體行

2.乙腈 ( Acetonitrile ) 由 Honeywell Co 製造

3. Hexane 、 Methanol 、 Ethyl acetate 、Acetone 由 Merck Co. ( Darmstadat, Germany ) 製造

4. 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl ( DPPH ) 由 Sigma Chemical Co, ( St. Louis, MO, USA ) 製造

5. Dimethyl sulfoxide ( DMSO ) 由 Sigma Chemical Co, ( St. Louis, MO, USA ) 製 造

三、培養基成分

1. Mueller-Hinton broth 由 Sigma Chemical Co, ( St. Louis, MO, USA ) 製造 2. Agar powder 由 HiMedia Co. ( Mumbai, India ) 製造

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第二節、實驗方法

第一部分 實驗植物前處理

將取自嘉義市的台灣真柏,心材陰乾後,磨粉後就可得到粉末 9.19 公斤,

以此進行接下來的超臨界流體萃取。

圖五、實驗植物前處理

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第二部分 超臨界二氧化碳流體萃取 1.超臨界二氧化碳流體萃取步驟

將萃取槽裝入 10 公克樣品後放置入烘箱中,將萃取槽的入口和出口連接管 的連接頭旋緊後以萃取槽固定架固定,打開烘箱和 C&C 組件的加熱開關並設 定烘箱和 C&C 組件的溫度,確認所有閥皆關閉,待烘箱和 C&C 組件的溫度 皆已達到並穩定維持後打開入口閥,開啟並設定共溶劑幫浦流速並開始打入共溶 劑,關閉共溶劑幫浦,開啟加壓幫浦開關並設定壓力值後加壓,讓幫浦增壓至設 定值,靜態萃取 30 分鐘後打開出口閥,使超臨界流體將萃取物流至收集管中,

洩壓收集完畢後關閉出口閥,關掉所有開關並打開烘箱的門,打開排放閥排除剩 餘壓力。關閉所有閥門及電源,清洗萃取管柱,所有組件如圖六所示。

2.超臨界二氧化碳流體萃取單因子條件探討

本研究主要為靜態萃取法 ( steady-state extraction ) ,主要步驟是將超臨界 流體加壓封入萃取槽後做靜置萃取一段時間,待系統達平衡後再打開閥門將萃取 物沖出並同時與溶劑分離。操作變因為萃取溫度、萃取壓力與共溶劑濃度三項,

首先於 300 bar 分別以 35 、 40 、 45 、 50 、 55 ℃ 進行最適萃取溫度的 篩選,已知最適萃取溫度後以 150 、 200 、 250 、 300 、 350 bar 進行最適 萃取壓力的篩選,再以最適溫度及壓力進行甲醇、丙酮、乙酸乙酯和正己烷以 5 、 10 、15 、 20 、 25 、 30 % 進行最適共溶劑濃度篩選,共溶劑添加量以管柱 容積為主,本實驗所使用管柱容積為 30 mL ,因此 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 共溶劑添加量分別為 1.5 、 3 、 4.5 、 6 、 7.5 、 9 mL。

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圖六、超臨界二氧化碳流體萃取部件

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第三部分 成分分析 1. HPLC 分析

以 HPLC 測定超臨界二氧化碳流體萃取之萃取物, HPLC 條件如表六所 示。HPLC 所使用之機組為 Hitachi model L-2130 Intelligent pump system 搭配 Hitachi model L-2200 Autosampler 和 Hitachi model L-2455 Diode Array Detector,偵測波長設定為 230 nm,其中 HPLC 所使用之管柱為 RP-18 GP 250-4.6 ( 5 μm ),其流速設定為 1 mL/min。

表五、萃取物之 HPLC 分析條件

Table 5. The sample analysis conditions of HPLC

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第四部分 DPPH自由基清除率試驗

以 DPPH 自由基清除效應作為指標,將樣品 ( 最終濃度為 2.5 mg/mL ) 與 DPPH 甲醇溶液濃度為 0.1 mM 及 0.5 mM 於 96 孔盤中混合作用後,於室溫下 避光靜置 30 min,於分光光度計波長 517 nm 下偵測其吸光值,測試超臨界流 體萃取在不同的萃取條件,是否會影響 DPPH 自由基之清除率。

此實驗以維他命 C 作為對照組。清除力 ( scavenging activity % ) 計算公式 為: ( scavenging effects ) =[1-( OD sample/OD control )]*100 %。將不同濃度樣品之 清除力經 EXCEL 分析後得檢量線。 EC50 ( concentration for 50 % of maximal effect ) 定義為清除 50 % DPPH 自由基之樣品濃度。

1. DPPH 自由基清除預測試

取 0.0985 g DPPH 溶與甲醇配置成 50 mL 的 5 mM DPPH 甲醇溶液,再稀 釋成濃度 0.1 mM。取 100 μl DPPH 甲醇溶液及 100 μl 不同條件之超臨界流體萃 取物混合均勻,於室溫反應 0-30 分鐘後,以波長 517 nm 測吸光值,每個樣品 皆三重複。

2. DPPH 自由基清除試驗

取 0.0985 g DPPH 溶與甲醇配置成 50 mL 的 5 mM DPPH 甲醇溶液,再稀 釋成濃度 0.5 mM。取 100 μl DPPH 甲醇溶液及 100 μl 不同條件之超臨界流體萃 取物混合均勻,於室溫反應 0-30 分鐘後,以波長 517 nm 測吸光值,每個樣品 皆四重複。

3. DPPH 自由基清除率濃度效應測試

取 0.0985 g DPPH 溶與甲醇配置成 50 mL 的 5 mM DPPH 甲醇溶液,再稀 釋成濃度 0.5 mM。取 100 μl DPPH 甲醇溶液及 100 μl 不同濃度之萃取物,濃

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度分別為 1000 μg/mL 、 500 μg/mL 、 250 μg/mL 、 125 μg/mL 混合均勻,於 室溫反應 0-60 分鐘後,以波長 517 nm 測吸光值,每個樣品皆四重複。

第五部分 抗菌試驗 1.菌種選擇

過去研究顯示圓柏屬植物葉子和果實精油在對 Klebsiella 屬和 Candida 屬 在抗菌上是有不錯的效果的 ( Karaman, 2003; Pepeljnjak et al.,2005 ) ,為測試台 灣真柏心材萃取出的萃取物是否也具有相似的效果,因此將選擇 Klebsiella 屬和 Candida 屬的代表性菌株克雷伯氏肺炎菌 ( Klebsiella pneumoniae ) 和白色念珠 菌 ( Candida albicans )來做為抗菌的實驗菌株。同時為了解台灣真柏心材萃 取出的萃取物對 Bacillus 屬的菌株是否也具備抗菌效果,因此將選擇 Bacillus subtilis 作為實驗菌株來進行抗菌實驗,K. pneumoniae 和 C. albicans 由臺東大 學生命科學系林志輝老師提供,B. subtilis 由臺東大學生命科學系黃祥恩老師提 供。

2.菌種培養

將培養後的 K. pneumoniae、C. albicans 和 B. subtilis 的平面培養基,以 loop 取一菌落分別接入 5 mL 之 MH broth 中,培養溫度為 37 ℃ 震盪培養 10 小時後,使菌液 OD 值為 0.4 以進行抗菌實驗。

3.樣品製備

將不同溫度、壓力與共溶劑之超臨界二氧化碳流體萃取物以 DMSO 回溶,

以最終濃度為 100 mg/mL 進行樣品製備,將樣品進行編號如表六所示。

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4.抗菌試驗點測試

將培養好的液態菌取 100 µL 塗抹至 MH 培養基上,將菌液塗抹至乾後取 樣品 2 µL 的萃取物和 DMSO 點在 MH 培養基上,放至 37 ℃ 培養箱中培養 8-10 小時後,觀察樣品是否有抑菌效果。

5.抗菌試驗紙錠擴散法

將培養好的液態菌取 100 µL 塗抹至 MH 培養基上,將菌液塗抹至乾後取 樣品 20 µL 的萃取物和 20 µL DMSO 加在紙錠上,使其濃度為 1 mg/disk ,在 放到 MH 培養基上,放至 37 ℃ 培養箱中培養 8-10 小時後,觀察樣品是否有 抑菌效果, n.d 代表無抑菌效果,9-10 mm 代表輕度抑菌效果,11-15 mm 代表 中度抑菌效果,16 mm 以上代表高度抑菌效果。

第六部分 生物統計之方法

所有試驗皆進行三重複,實驗結果以平均值 ± 標準誤差 ( mean ± SD ) 表 示。以 Microsoft excel 進行數據計算。

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表六、台灣真柏心材萃取物樣品編號

Table 6. Juniperus chinensis var. sargentii A. Henry heartwood extract sample number.

共溶劑 % 代號:A 為甲醇,B 為乙酸乙酯,C 為丙酮,D 為正己烷。

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第四章、結果

第一節、超臨界流體萃取最佳萃取條件探討 1. 最適萃取溫度篩選結果

實驗結果顯示壓力固定為 300 bar 分別以 35 、 40 、 45 、 50 、 55 ℃ 進行最適萃取溫度的篩選,結果得到最高萃取率條件為 40 ℃、300 bar,萃取率 為 1.7 %,其他條件之萃取率無太大差異如表七所示,再將其以 HPLC 進行分析,

取 10 µL 樣品濃度為 2.5 mg/mL 之樣品進行測試,結果得到 55 ℃、300 bar 時主 要成分含量較多如圖七、表八所示,以成分含量來看可知 55 ℃為最適萃取溫度。

表七、壓力 300 bar 下不同溫度之超臨界萃取率

Table 7 The supercritical carbon dioxide extraction efficiency of pressure 300 bar and different temperatures.

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圖七、壓力 300 bar 下不同溫度之超臨界萃取物 HPLC 分析 35-43 分鐘 紅色為 35 ℃;黃色為 40 ℃;綠色為 45 ℃;藍色為 50 ℃;紫色為 55 ℃

表八、壓力 300 bar 下不同溫度之超臨界萃取物 HPLC 分析面積值

Table 8 The supercritical carbon dioxide HPLC analysis area value of pressure 300 bar and different temperatures.

-為 HPLC 分析結果無面積值。

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2. 最適萃取壓力篩選結果

將最適萃取溫度 55 ℃ 以 150 、 200 、 250 、 300 、 350 bar 進行最 適萃取壓力的篩選,結果顯示條件為 55 ℃、300 bar 得到最高萃取率,萃取率 為 1.43 %,條件為 55 ℃、150 bar 得到最低萃取率,萃取率為 0.79 % 如表九 所示,再將其以 HPLC 進行分析,取 10 µL 樣品濃度為 2.5 mg/mL 之樣品進行測 試,結果得到 55 ℃、250 bar 時主要成分含量較多如圖八、表十所示,以成分 含量來看可知 250 bar 為最適萃取壓力。

表九、溫度 55 ℃下不同壓力之超臨界萃取率

Table 9 The supercritical carbon dioxide extraction efficiency of temperature 55 ℃ and different pressures.

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圖八、溫度 55 ℃ 下不同壓力之超臨界萃取物 HPLC 分析 32-44 分鐘 紅色為 150 bar ; 黃色為 200 bar ; 綠色為 250 bar ; 藍色為 300 bar ; 紫色為 350 bar

表十、溫度 55 ℃ 下不同壓力之超臨界萃取物 HPLC 分析面積值

Table 10 The supercritical carbon dioxide HPLC analysis area value of temperature 55 ℃ and different pressures.

-為 HPLC 分析結果無面積值。

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3. 甲醇共溶劑最適濃度篩選結果

將最適萃取溫度 55 ℃ 及壓力 250 bar 以甲醇 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 進行甲醇共溶劑最適濃度篩選,結果顯示條件為 55 ℃、250 bar 時甲醇 共溶劑 20 % 得到最高萃取率,萃取率分別為 5.32 %,條件為 55 ℃、 250 bar 甲醇共溶劑 5 % 得到最低萃取率,萃取率為 1.07 % 如表十一所示,再將其以 HPLC 進行分析,取 10 µ L 樣品濃度為 2.5 mg/mL 之樣品進行測試,結果得到甲 醇共溶劑在 2-6 分鐘時比無共溶劑萃取物多出一些微量成分,甲醇共溶劑 5 % 在 2-6 分鐘時微量成分含量較多,甲醇共溶劑 10 % 在 35-40 分鐘時主要成分含量 較多如圖九、表十二所示,因此以成分含量來看可知甲醇共溶劑 5 % 和 10 % 為 甲醇最適共溶劑濃度。

表十一、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 甲醇共溶劑之超臨界萃取率 Table 11 The supercritical carbon dioxide extraction efficiency of temperature 55 ℃ and pressures 250 bar different % Methanol cosolvent.

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圖九、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 甲醇共溶劑之超臨界萃取物 HPLC 分析 ( a ) 32-42 分鐘 ( b ) 0-20 分鐘

紅色為 0 %;黃色為 5 %;綠色為 10 %;藍色為 15 %;紫色為 20 %;橘色為 25 %;白色為 30 %

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表十二、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 甲醇共溶劑之超臨界萃取物 HPLC 分析面積值

Table 12 The supercritical carbon dioxide HPLC analysis area value of temperature 55 ℃ and pressures 250 bar different % Methanol cosolvent.

-為 HPLC 分析結果無面積值。

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4. 乙酸乙酯共溶劑最適濃度篩選結果

將最適萃取溫度 55 ℃ 及壓力 250 bar 以乙酸乙酯 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 進行乙酸乙酯共溶劑最適濃度篩選,結果顯示條件為 55 ℃ 、 250 bar 時乙酸乙酯 10 % 得到最高萃取率,萃取率分別為 3.36 %,條件為 55 ℃ 、 250 bar 乙酸乙酯 5 % 得到最低萃取率,萃取率為 1.07 % 如表十三所示,再將 其以 HPLC 進行分析,取 10 µL 樣品濃度為 2.5 mg/mL 之樣品進行測試,結果 得到乙酸乙酯共溶劑在 2-6 分鐘時比無共溶劑萃取物多出一些微量成分,乙酸乙 酯共溶劑 30 % 在 2-6 分鐘時微量成分含量較多,乙酸乙酯共溶劑 5 % 在 35-40 分鐘時主要成分含量較多如圖十、表十四所示,以成分含量來看可知乙酸乙酯共 溶劑 5 % 和 30 % 為乙酸乙酯最適共溶劑濃度。

表十三、以溫度 55 ℃和壓力 250 bar 下不同 % 乙酸乙酯共溶劑之超臨界萃取 率

Table 13 The supercritical carbon dioxide extraction efficiency of temperature 55 ℃ and pressures 250 bar different % Ethyl acetate cosolvent.

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圖十、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 %乙酸乙酯共溶劑之超臨界萃取物 HPLC 分析 ( a ) 32-42 分鐘 ( b ) 0-20 分鐘

紅色為 0 %;黃色為 5 %;綠色為 10 %;藍色為 15 %;紫色為 20 %;橘色為 25 %;白色為 30 %

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表十四、以溫度 55 ℃和壓力 250 bar 下不同 % 乙酸乙酯共溶劑之超臨界萃取 物 HPLC 分析面積值

Table 14 The supercritical carbon dioxide HPLC analysis area value of temperature 55 ℃ and pressures 250 bar different % Ethyl acetate cosolvent.

-為 HPLC 分析結果無面積值。

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5. 丙酮共溶劑最適濃度篩選結果

將最適萃取溫度 55 ℃ 及壓力 250 bar 以丙酮 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 進行丙酮共溶劑最適共溶劑濃度篩選,結果顯示條件為 55 ℃ 、 250 bar 時丙酮 30 % 得到最高萃取率,萃取率分別為 5.22 %,條件為 55 ℃ 、 250 bar 丙酮 5 % 得到最低萃取率,萃取率為 2.57 % 如表十五所示,再將其以 HPLC 進 行分析,取 10 µL 樣品濃度為 2.5 mg/mL 之樣品進行測試,結果得到丙酮共溶劑 在 2-6 分鐘時比無共溶劑萃取物多出一些微量成分,丙酮共溶劑 25 和 30 % 在 2-6 分鐘時微量成分含量較多,丙酮共溶劑 5 % 在 35-40 分鐘時主要成分含量較 多如圖十一、表十六所示,以成分含量來看可知丙酮共溶劑 5 % 、 25 % 和 30

% 為丙酮最適共溶劑濃度。

表十五、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 丙酮共溶劑之超臨界萃取率 Table 15 The supercritical carbon dioxide extraction efficiency of temperature 55 ℃ and pressures 250 bar different % Acetone cosolvent.

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圖十一、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 丙酮共溶劑之超臨界萃取物 HPLC 分析 ( a ) 31-44 分鐘 ( b ) 0-20 分鐘

紅色為 0 %;黃色為 5 %;綠色為 10 %;藍色為 15 %;紫色為 20 %;橘色為 25 %;白色為 30 %

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表十六、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 丙酮共溶劑之超臨界萃取物 HPLC 分析面積值

Table 16 The supercritical carbon dioxide HPLC analysis area value of temperature 55 ℃ and pressures 250 bar different % Acetone cosolvent.

-為 HPLC 分析結果無面積值。

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6. 正己烷共溶劑最適濃度篩選結果

將最適萃取溫度 55 ℃ 及壓力 250 bar 以正己烷 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 進行正己烷共溶劑最適共溶劑濃度篩選,結果顯示條件為 55 ℃、

250 bar 時正己烷 30 % 得到最高萃取率,萃取率分別為 2.04 %,條件為 55 ℃、

250 bar 正己烷 5 % 得到最低萃取率,萃取率為 1.01 % 如表十七所示,再將其 以 HPLC 進行分析,取 10 µL 樣品濃度為 2.5 mg/mL 之樣品進行測試,結果得 到正己烷共溶劑在 2-6 分鐘時無多出微量成分,正己烷共溶劑 25 % 在 35-40 分 鐘時主要成分含量較多如圖十二、表十八所示,以成分含量來看可知正己烷共溶 劑 25 % 為正己烷最適共溶劑濃度。

表十七、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 正己烷共溶劑之超臨界萃取率 Table 17 The supercritical carbon dioxide extraction efficiency of temperature 55 ℃ and pressures 250 bar different % n-Hexane cosolvent.

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圖十二、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 正己烷共溶劑之超臨界萃取 物 HPLC 分析 32-42 分鐘

紅色為 0 %;黃色為 5 %;綠色為 10 %;藍色為 15 %;紫色為 20 %;橘色為 25 %;白色為 30 %

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表十八、以溫度 55 ℃ 和壓力 250 bar 下不同 % 正己烷共溶劑之超臨界萃取物 HPLC 分析面積值

Table 18 The supercritical carbon dioxide HPLC analysis area value of temperature 55 ℃ and pressures 250 bar different % n-Hexane cosolvent.

-為 HPLC 分析結果無面積值。

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第二節、DPPH 自由基清除率探討

1. 不同條件下超臨界二氧化碳流體萃取之台灣真柏心材萃取物 DPPH 自由基 清除預測試結果

不同條件下超臨界二氧化碳流體萃取之台灣真柏心材萃取物 DPPH 自由基 清除預測試結果如圖十三、十四、十五、十六、十七、十八所示。圖十三為不同 溫度條件下以 300 bar 萃取之抗氧化結果,結果顯示於室溫反應 30 分鐘後,以 溫度 35 、 40 、 45 、 50 、 55 ℃ 萃取之萃取物於最終濃度 2.5 mg/mL 時,

其 DPPH 自由基清除率分別為 62 % 、 60 % 、 68 % 、 65 % 和 80 %,

其中以 55 ℃ 萃取之萃取物 DPPH 自由基清除效應在 30 分鐘時結果最為顯著。

圖十三、以不同溫度條件下以 300 bar 萃取之反應 0-30 分鐘之 DPPH 自由基 清除率

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46

圖十四為不同壓力條件下溫度 55 ℃ 萃取之抗氧化結果,結果顯示於室溫 反應 30 分鐘後,以壓力 150 、 200 、 250 、 300 、 350 bar 萃取之萃取物 於最終濃度 2.5 mg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 71 % 、 72 % 、 90 % 、 80 % 和 66 %,其中以 55 ℃、250 bar 萃取之萃取物 DPPH 自由 基清除效應在 10 分鐘時結果最為顯著。

圖十四、以不同壓力條件下以 55 ℃ 萃取之反應 0-30 分鐘之 DPPH 自由基清 除率

(60)

47

圖十五為最適萃取溫度 55 ℃ 及壓力 250 bar 以甲醇 0 、 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 之萃取物抗氧化結果,結果顯示於室溫反應 30 分鐘後,以 甲醇共溶劑 0 、 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 萃取之萃取物於最終濃 度 2.5 mg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 90 % 、 79 % 、 85 % 、 87 % 、 84 % 、 84 % 和 85 %,其 DPPH 自由基清除效應在 0 分鐘時自 由基清除率就有高達 50 % ,因此正式測試時甲醇共溶劑 0 、 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 之萃取物都將進行測試。

圖十五、以不同 % 甲醇共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取反應 0-30 分鐘 之 DPPH 自由基清除率

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圖十六為最適萃取溫度 55 ℃ 及壓力 250 bar 以乙酸乙酯 0 、 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 之萃取物抗氧化結果,結果顯示於室溫反應 30 分鐘 後,以乙酸乙酯共溶劑 0 、 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 萃取之萃取 物於最終濃度 2.5 mg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 90 % 、 87 % 、 91 % 、 93 % 、 92 % 、 92 % 和 86 %,以反應 30 分鐘來看其 DPPH 自 由基清除效應無太大差異。在 0 分鐘時乙酸乙酯共溶劑 0 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 自由基清除率就有高達 50 % 的樣品,因此正式測試時只選擇乙酸 乙酯共溶劑 0 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 之萃取物進行測試。

圖十六、以不同 % 乙酸乙酯共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取反應 0-30 分 鐘之 DPPH 自由基清除率

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49

圖十七為最適萃取溫度 55 ℃ 及壓力 250 bar 以丙酮 0 、 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 之萃取物抗氧化結果,結果顯示於室溫反應 30 分鐘後,以 丙酮共溶劑 0 、 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 萃取之萃取物於最終濃 度 2.5 mg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 90 % 、 89 % 、 88 % 、 88 % 、 87 % 、80 % 和 77 %,以反應 30 分鐘來看其 DPPH 自由基清除 效應無太大差異,在 0 分鐘時丙酮共溶劑 0 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 自由基清除率就有高達 50 %,因此正式測試時選擇丙酮共溶劑 0 、 10 、 15 、 20 、 25 、30 % 之萃取物進行測試。

圖十七、以不同 % 丙酮共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取反應 0-30 分鐘 之 DPPH 自由基清除率

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50

圖十八為最適萃取溫度 55 ℃ 及壓力 250 bar 以正己烷 0 、 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 之萃取物抗氧化結果,結果顯示於室溫反應 30 分鐘 後,以正己烷共溶劑 0 、 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 萃取之萃取物 於最終濃度 2.5 mg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 90 % 、 75 % 、 79 % 、 83 % 、 82 % 、77 % 和 77 %,以反應 30 分鐘來看,正己烷共 溶劑萃取之萃取物其 DPPH 自由基清除效應比其他三種共溶劑差,因此正式測 試時只選擇正己烷共溶劑 15 % 之萃取物進行測試。

圖十八、以不同 % 正己烷共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取反應 0-30 分鐘 之 DPPH 自由基清除率

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51

2. 不同條件下超臨界二氧化碳流體萃取之萃取物 DPPH 自由基清除試驗結果 不同條件下超臨界二氧化碳流體萃取之萃取物 DPPH 自由基清除試驗結果 如圖十九、二十、二十一、二十二所示。圖十九是以不同 % 甲醇共溶劑條件下 以 55℃ 、250bar 萃取之 DPPH 自由基清除預測試結果進行進一步測試。 DPPH 甲醇溶液濃度為 0.5 mM,甲醇共溶劑 0 、 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30

% 之萃取物最終濃度為 2.5 mg/mL,結果顯示於室溫反應 30 分鐘後,其 DPPH 自由基清除率分別為 62 % 、 90 % 、 91 % 、 86 % 、 92 % 、 92 % 和 92 %,由此可知有使用甲醇共溶劑進行萃取的萃取物其 DPPH 自由基清除效應 結果都非常顯著,而 0 % 甲醇共溶劑其 DPPH 自由基清除效應則非常不佳。

在 10 分鐘時甲醇共溶劑 5 、 10 、 20 、 25 、 30 % 自由基清除率有 80 % 以上,因此萃取物濃度效應時選擇甲醇共溶劑 5 、 10 、 20 、 25 、 30 % 之 萃取物進行進一步測試。

圖十九、以不同 % 甲醇共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取之 0.5 mM DPPH 自由基清除率

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圖二十是以不同%乙酸乙酯共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取之 DPPH 自由基清除預測試結果進行進一步測試。 DPPH 甲醇溶液濃度為 0.5 mM,乙酸 乙酯共溶劑 0 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 % 之萃取物最終濃度為 2.5 mg/mL,

結果顯示於室溫反應 30 分鐘後,其 DPPH 自由基清除率分別為 62 % 、 72

% 、 81 % 、 81 % 、 90 % 和 93 %,由此可知乙酸乙酯共溶劑 25 、 30

% 進行萃取的萃取物其 DPPH 自由基清除效應結果都非常顯著,而 0 % 乙酸 乙酯共溶劑其 DPPH 自由基清除效應則非常不佳。在 10 分鐘時乙酸乙酯共溶 劑 25 、 30 % 自由基清除率有 80 % 以上,因此萃取物濃度效應時選擇乙酸 乙酯共溶劑 25 、 30 % 之萃取物進行進一步測試。

圖二十、以不同 % 乙酸乙酯共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取之 0.5 mM DPPH 自由基清除率

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53

圖二十一是以不同 % 丙酮和 15 % 正己烷共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取之 DPPH 自由基清除預測試結果進行進一步測試。 DPPH 甲醇溶液濃度 為 0.5 mM,丙酮共溶劑 0、10、15、20、25、30 % 和 15 % 正己烷之萃取物最 終濃度為 2.5 mg/mL,結果顯示於室溫反應 30 分鐘後,其 DPPH 自由基清除 率分別為 62 % 、 83 % 、 93 % 、 92 % 、 92 % 、 91 % 和 55 %,

由此可知丙酮共溶劑進行萃取的萃取物其 DPPH 自由基清除效應以 15、20、

25、30 % 結果都非常顯著,而 15 % 正己烷共溶劑其 DPPH 自由基清除效應 則非常不佳。在 10 分鐘時丙酮共溶劑 15、20、25、30 % 自由基清除率有 80 % 以上,因此萃取物濃度效應時只選擇丙酮共溶劑 15、20、25、30 % 之萃取物進 行進一步測試。

圖二十一、以不同 % 丙酮共溶劑條件下以 55 ℃、 250 bar 萃取之 0.5 mM DPPH 自由基清除率

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圖二十二是 15 % 正己烷共溶劑條件下以 55 ℃、250 bar 萃取之 DPPH 自 由基清除預測試結果進行進一步測試。 DPPH 甲醇溶液濃度為 0.5 mM , 15 % 正己烷之萃取物最終濃度為 2.5 mg/mL,結果顯示於室溫反應 30 分鐘後,其 DPPH 自由基清除率為 55 %,由此可知 15 % 正己烷共溶劑其 DPPH 自由基 清除效應則非常不佳。因此 15 % 正己烷共溶劑之萃取物不會進行進一步測試。

圖二十二、以 15 % 正己烷共溶劑條件下以 55 ℃、 250 bar 萃取之 0.5 mM DPPH 自由基清除率

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55

3. 不同條件下超臨界二氧化碳流體萃取之萃取物 DPPH 自由基清除率濃度效 應測試結果

不同條件下超臨界二氧化碳流體萃取之萃取物 DPPH 自由基清除率濃度效 應測試,將上一個試驗所選擇之樣品進行序列稀釋,以確認其 EC50 濃度,結 果如圖二十三所示。以序列稀釋的維他命 C 為對照組,於最終濃度分別為 78.1 、 156.3 、 312.5 和 625 μg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 16 % 、 21

% 、 44 % 和 88 %。將最終濃度 312.5 和 625 μg/mL 之維他命 C 對照組 DPPH 自由基清除數值,以 EXCEL 進行回歸曲線分析,所得公式為 y = 0.1416x - 0.4469,經換算維他命 C 之 EC50 為 356.3 μg/mL。

實驗組的 5 % 甲醇共溶劑萃取物,經序列稀釋後,於最終濃度分別為 125 、 250 、 500 和 1000 μg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 31 % 、 52

% 、 86 % 和 93 %。將實驗組最終濃度 250 和 500 μg/mL 之 DPPH 自由基 清除數值,以 EXCEL 進行回歸曲線分析,所得公式為 y = 0.1679x + 10.461,經 換算 5 %甲醇共溶劑萃取物之 EC50 為 235.5 μg/mL。

實驗組的 10 % 甲醇共溶劑萃取物,經序列稀釋後,於最終濃度分別為 125 、 250 、 500 和 1000 μg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 15 % 、 28 % 、 47 % 和 68 %。將實驗組最終濃度 500 和 1000 μg/mL 之 DPPH 自 由基清除數值,以 EXCEL 進行回歸曲線分析,所得公式為 y = 0.0428x + 25.2,

經換算 10 % 甲醇共溶劑萃取物之 EC50 為 579.4 μg/mL。

實驗組的 20 % 甲醇共溶劑萃取物,經序列稀釋後,於最終濃度分別為 125 、 250 、 500 和 1000 μg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 21 % 、 38 % 、 62 % 和 89 %。將實驗組最終濃度 250 和 500 μg/mL 之 DPPH 自由基清除

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數值,以 EXCEL 進行回歸曲線分析,所得公式為 y = 0.0979x + 13.525,經換算 20 % 甲醇共溶劑萃取物之 EC50 為 372.6 μg/mL。

實驗組的 25 % 甲醇共溶劑萃取物,經序列稀釋後,於最終濃度分別為 125 、 250 、 500 和 1000 μg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 25 % 、 40 % 、 65 % 和 83 %。將實驗組最終濃度 250 和 500 μg/mL 之 DPPH 自由基清除數 值,以 EXCEL 進行回歸曲線分析,所得公式為 y = 0.0977x + 15.912,經換算 25

% 甲醇共溶劑萃取物之 EC50 為 348.9 μg/mL。

實驗組的 30 % 甲醇共溶劑萃取物,經序列稀釋後,於最終濃度分別為 125 、 250 、 500 和 1000 μg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 21 % 、 38 % 、 65 % 和 90 %。將實驗組最終濃度 250 和 500 μg/mL 之 DPPH 自由基清除數 值,以 EXCEL 進行回歸曲線分析,所得公式為 y = 0.1045x + 12.256 ,經換算 30 % 甲醇共溶劑萃取物之 EC50 為 361.2 μg/mL。

實驗組的 25 % 乙酸乙酯共溶劑萃取物,經序列稀釋後,於最終濃度分別為 125 、 250 、 500 和 1000 μg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 14 % 、 24 % 、 42 % 和 60 %。將實驗組最終濃度 500 和 1000 μg/mL 之 DPPH 自 由基清除數值,以 EXCEL 進行回歸曲線分析,所得公式為 y = 0.0362x + 23.73 , 經換算 30 % 甲醇共溶劑萃取物之 EC50 為 725.7 μg/mL。

實驗組的 30 % 乙酸乙酯共溶劑萃取物,經序列稀釋後,於最終濃度分別為 125 、 250 、 500 和 1000 μg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 29 % 、 52 % 、 75 % 和 94 %。將實驗組最終濃度 125 和 250 μg/mL 之 DPPH 自

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57

由基清除數值,以 EXCEL 進行回歸曲線分析,所得公式為 y = 0.1889x + 5.1065 ,經換算 30 % 甲醇共溶劑萃取物之 EC50 為 237.7 μg/mL。

實驗組的 15 % 丙酮共溶劑萃取物,經序列稀釋後,於最終濃度分別為 125 、 250 、 500 和 1000 μg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 25 % 、 41 % 、 65 % 和 91 %。將實驗組最終濃度 250 和 500 μg/mL 之 DPPH 自由基清除數 值,以 EXCEL 進行回歸曲線分析,所得公式為 y = 0.0972x + 16.836 ,經換算 15 % 丙酮共溶劑萃取物之 EC50 為 341.2 μg/mL。

實驗組的 20 % 丙酮共溶劑萃取物,經序列稀釋後,於最終濃度分別為 125 、 250 、 500 和 1000 μg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 25 % 、 47

% 、 72 % 和 93 %。將實驗組最終濃度 250 和 500 μg/mL 之 DPPH 自由基 清除數值,以 EXCEL 進行回歸曲線分析,所得公式為 y = 0.0999x + 22.215 , 經換算 20 % 丙酮共溶劑萃取物之 EC50 為 278.1 μg/mL。

實驗組的 25 % 丙酮共溶劑萃取物,經序列稀釋後,於最終濃度分別為 125 、 250 、 500 和 1000 μg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 44 % 、 70 % 、 92 % 和 94 %。將實驗組最終濃度 125 和 250 μg/mL 之 DPPH 自由基清除 數值,以 EXCEL 進行回歸曲線分析,所得公式為 y = 0.2036x + 18.77 ,經換算 25 % 丙酮共溶劑萃取物之 EC50 為 153.4 μg/mL。

實驗組的 30 % 丙酮共溶劑萃取物,經序列稀釋後,於最終濃度分別為 125 、 250 、 500 和 1000 μg/mL 時,其 DPPH 自由基清除率分別為 45 % 、 75 % 、 93 % 和 93 %。將實驗組最終濃度 125 和 250 μg/mL 之 DPPH 自由基清除

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數值,以 EXCEL 進行回歸曲線分析,所得公式為 y = 0.236x + 15.61,經換算 30

% 丙酮共溶劑萃取物之 EC50 為 145.7 μg/mL。

圖二十三、不同條件下超臨界二氧化碳流體萃取之萃取物 DPPH 自由基清除率 之 EC50

數據

Table  1  Variety  chemical  substances  of  critical  pressure,  temperature  and  density
Table 3 Scavenging effects of the compounds 1-5 from the heartwood of J. chinensis  on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ( DPPH ) radical
Table 4 Antimicrobial activity of the juniper essential oil by the diffusion method.
Table 5. The sample analysis conditions of HPLC
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參考文獻

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