國立宜蘭大學生物技術研究所 碩士論文 Institute of Biotechnology National Ilan University Master Thesis

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國立宜蘭大學生物技術研究所 碩士論文

Institute of Biotechnology National Ilan University

Master Thesis

二硫蘇糖醇及電激活對精子顯微注射後豬卵母細胞的原核形成及 胚發育的影響

Effect of dithiothreitol and electrical activation on pronuclear formation and embryonic development following intracytoplasmic

sperm injection in porcine oocytes

指導教授:陳銘正 博士 Ming-Cheng Chen, Ph. D.

研究生:沈偉仁 Wei-Jen Sheng

中華民國九十六年七月

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中文摘要

精子顯微注射 (intracytoplasmic sperm injection, ICSI) 是一項將精子直 接注射進入卵母細胞細胞質而使其受精的重要技術,但是將精子顯微注射 應用在豬上,卻有雄原核 (male pronuclear, MPN) 形成率偏低的問題存在。

本試驗之目的乃應用二硫蘇糖醇 (dithiothreitol, DTT) 處理公豬精子並聯合 豬卵母細胞的電激活 (electrical activation, EA),搭配壓電脈衝顯微操作儀 (piezo micro manipulator, PMM),改善 ICSI 後豬卵母細胞的雄原核形成及胚 發育。以 5 mM DTT 處理公豬精子 10 或 30 分鐘,隨後將公豬精子注射到 體外成熟(in vitro matured, IVM)的豬卵母細胞中,精子顯微注射後 1.5 小 時,再利用電刺激 (1 x 30 μspulseof1.2 or2.2 kV/cm DC) 來激活受精卵。

精子顯微注射後經過 16-18 hr 的培養,以 DTT 處理公豬精子 30 分鐘且電激 活強度為 2.2kV/cm 的組別,其雄原核形成率 (60.7 ± 6.2 %) 是最高的,且 顯著高於注射無前處理的精子至無電刺激卵母細胞的對照組 (41.9 ± 3.2 %, P < 0.05)。比較 DTT 與電激活的聯合處理或單一處理對 ICSI 後豬卵母細胞 雄原核形成與胚發育的影響。DTT 與電激活聯合處理組 (54.8 ± 12.7 %) 的 雄原核形成率顯著高於 (P < 0.05) 注射無前處理的精子至無電刺激卵母細 胞的對照組 (24.3 ± 9.0 %);DTT 與電激活聯合處理組 (75.8 ± 12.1 %) 的卵 裂率顯著高於 (P < 0.05) 注射無前處理的精子至無電刺激卵母細胞的對照 組 (42.5 ± 11.5 %);DTT 與電激活聯合處理組 (37.3 ± 12.8 %) 的桑椹胚發

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育率顯著高於 (P < 0.05) 注射無前處理的精子至無電刺激卵母細胞的對照 組 (15.2 ± 8.4 %)。結論,以 DTT 處理豬精子與電激活的聯合處理能改善 ICSI 後豬卵母細胞的致活反應、精子的去濃縮作用、雄原核形成、正常受 精作用、卵裂及桑椹胚的發育,且理想的電激活條件及精子暴露在 DTT 的 時間對雄原核形成與胚發育來說是非常重要的。此外,需進一步研究去找 尋適當的處理方式,改善豬 ICSI 的囊胚發育率。

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英文摘要

Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a procedure where the oocyte is fertilized by a direct injection of sperm into the cytoplasm. In porcine, the low rate of male pronuclear (MPN) formation has been reported after ICSI. The objective of this study was to improve male pronuclear formation and embryonic development following ICSI of dithiothreitol (DTT)–treated boar spermatozoa and electrical activation (EA) of porcine oocytes after ICSI with piezo micro manipulator (PMM). The in vitro matured (IVM) porcine oocytes were injectedboar spermatozoa treated with 5 mM DTT for 10 and 30 min, then EA with 1 x 30 μspulseof1.2 or 2.2 kV/cm DC at 1.5 hr after ICSI. After 16-18 hr of culture, themale pronuclear formation rate in the group of porcine oocytes injected boar spermatozoa treated with DTT for 30 min combined with EA with 2.2 kV/cm (60.7 ± 6.2 %) was the best and higher than that in the control group (41.9 ± 3.2 %, P < 0.05) of unstimulated oocytes injected with untreated spermatozoa. We compared the effects of ICSI with and without a combination of DTT and EA on male pronuclear formation and embryonic development of porcine oocytes. The male pronuclear formation rate in the group treated with a combination of DTT and EA (54.8 ± 12.7 %) was higher (P < 0.05) than that in the control group (24.3 ± 9.0%) of unstimulated oocytes injected with untreated

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spermatozoa. The oocytes cleavage rate in the group treated with a combination of DTT and EA (75.8 ± 12.1 %) was higher (P < 0.05) than that in the control group (42.5 ± 11.5 %) of unstimulated oocytes injected with untreated spermatozoa. The morula development rate in the group treated with a combination of DTT and EA (37.3 ± 12.8 %) was higher (P < 0.05) than that in the control group (15.2 ± 8.4%) of unstimulated oocytes injected with untreated spermatozoa. In conclusion, pretreating sperm heads with DTT, and EA of oocytes after sperm head injection improved oocytes activation, sperm decondensation, male pronuclear formation, normal fertilization, oocytes cleavage, and morula development. The optimized electrical activation and an optimal time exposure of the spermatozoa in the DTT were very important for successful male pronuclear formation and embryos development. Further research is needed to find the more suitable treatment and to improve the rate of blastocyst formation in porcine ICSI.

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誌謝

不知不覺已在宜蘭大學生物技術所待了兩年,也順利完成碩士學業,

即將踏上畢業後的旅途。回想這短短兩年的研究過程,萬分感謝指導教授 陳銘正博士的悉心指導與勉勵,同為成功高中學長學弟的這份機緣,使彼 此亦師亦友,在研究上獲益良多,同時也學習到許多做人道理。亦感謝鄭 登貴博士與林佳靜博士,撥空參與論文口試,並於口試時給予我指導與審 閱論文初稿的指正。此外,感謝志德公司雷志中先生,在我操作 PMM 的技 術上遇到瓶頸時,能仔細地將技術轉移給我,使我能順利地應用在研究上。

剛踏進實驗室,所接觸到的研究領域與大學時期所學不盡相同,感謝 朱建安學長與林育安老師能適時給予我研究上的技術與知識,亦非常感謝 張育京學弟在我研究的這段期間,從旁給予許多協助,使研究更能有效地 完成。此外,感謝大學部的學弟妹們,洪若綺、季冠丞、倪國偉、朱輔群、

詹庭威、徐漢民、李文涵、侯佳妤、簡志明、潘睿珩,陪伴我度過實驗室 裡的這些日子,懷念與你們一同吃飯、聊天、娛樂、實驗等回憶,雖然不 捨與大家分離,但仍祝福你們與新進的學弟妹們能在實驗及考試上皆順利。

最後要感謝辛苦的家人在我求學的旅途上,不斷地給予支持與鼓勵,

讓我能自由地選擇求學道路。當我身心疲憊時,家的溫暖化為了最佳的避 風港,成為我在求學過程中能堅持下去的動力來源,將此論文與你們分享。

沈偉仁 中華民國九十六年七月二十日

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目錄

頁次 中文摘要………I 英文摘要……….III 誌謝………..V 表次………..…………..XII 圖次………..…XIV

壹、前言……….1

貳、文獻檢討……….3

一、卵母細胞的成熟作用與受精作用……….…3

(一)、卵母細胞的成熟作用………..…3

(二)、卵母細胞的受精作用………..…4

1、卵母細胞………...…………5

2、精子………...…7

(1)、精子獲能作用………7

(2)、頭巾反應………8

3、受精作用………...……9

(1)、精卵融合………9

(2)、卵母細胞的致活機制………..……10

(8)

(3)、防止多精入卵的機制………...……11

(4)、原核的形成………..………12

二、卵母細胞的體外成熟與體外受精………...……13

(一)、卵母細胞的體外成熟………13

(二)、卵母細胞的體外受精………14

1、體外受精的發展與應用……….……14

2、影響體外受精的主要因素……….……15

(1)、卵母細胞………..………15

(2)、精子………..………17

(3)、培養液的組成………..…………18

(4)、精卵共培養的比例與時間………..……18

3、改善體外受精的新技術……….…………19

三、精子顯微注射………...………20

(一)、精子顯微注射的發展與應用………20

(二)、精子顯微注射的過程與處理………20

(三)、精子顯微注射後的觀察指標………22

四、精子顯微注射在豬的應用與問題………...……23

(一)、精子顯微注射在豬的應用與發展………23

(二)、體外成熟豬卵母細胞的問題與改善………24

(9)

1、體外成熟培養系統的改善……….………25

(1)、含 FCS 與 pFF 的 IVM medium………25

(2)、Defined IVM medium………...……26

A、Defined IVM medium 的應用………26

B、Defined IVM medium 的改善………26

2、致活卵母細胞……….…………29

(1)、鈣離子濃度的提高………..………30

A、受精作用對卵母細胞內鈣離子濃度的影響………30

B、電激活的應用與理想條件………31

(2)、使用化學藥劑致活卵母細胞………..………32

A、DMAP 與 CHX………...…………32

B、InsP3………....33

(三)、雄原核形成率偏低的問題與改善………33

1、精子細胞膜的阻礙……….………34

(1)、精子細胞膜的特性………..………34

(2)、瓦解精子細胞膜的方法………..……35

2、精子頭巾的阻礙……….………36

(1)、精子頭巾的特性………..………36

(2)、移除精子頭巾的方法………..…………37

(10)

3、魚精蛋白的阻礙……….………38

(1)、魚精蛋白的特性………..………38

(2)、還原魚精蛋白的方法………..……39

(四)、公豬精子品質對卵母細胞的受精與發育的影響………39

(五)、化學藥劑對卵母細胞的傷害………40

五、總結………...…………42

參、材料與方法………...……43

一、卵母細胞的來源與體外成熟………...……43

二、精子的製備………...…………43

(一)、精子的來源與性狀檢測………43

(二)、精子的體外獲能與處理………47

三、卵母細胞的體外受精………...……50

四、精子顯微注射………...……52

(一)、顯微注射針的製作與架針步驟………52

(二)、精子顯微注射的步驟………53

五、電激活的處理………...…54

六、體外培養………...………57

七、卵母細胞或胚的形態觀察………...………57

八、評估指標………...…58

(11)

(一)、成熟評估………58

(二)、受精評估………58

(三)、發育評估………60

九、統計分析………...62

十、試驗設計………...62

(一)、豬卵母細胞的體外成熟、體外受精與精子顯微注射………..…62

(二)、不同的顯微注射針內徑對 ICSI 後豬卵母細胞存活與雄原核形成的 影響………...………...62

(三)、DTT 處理公豬精子的時間聯合電激活的電場強度對 ICSI 後豬卵母 細胞的影響……...………63

(四)、DTT 及電激活的聯合處理或單一處理對 ICSI 後豬卵母細胞原核形 成的影響………...………63

(五)、DTT 及電激活的聯合處理或單一處理對 ICSI 後豬卵母細胞卵裂的 影響……….………..64

(六)、DTT 及電激活的聯合處理或單一處理對 ICSI 後豬胚發育的影響...64

肆、結果………...65

一、豬卵母細胞的體外成熟、體外受精與精子顯微注射………65

二、不同的顯微注射針內徑對 ICSI 後豬卵母細胞存活與雄原核形成的影 響………..65

(12)

三、DTT 處理公豬精子的時間聯合電激活的電場強度對 ICSI 後豬卵母細 胞的影響………...71 四、DTT 及電激活的聯合處理或單一處理對 ICSI 後豬卵母細胞原核形成

的影響………...75 五、DTT 及電激活的聯合處理或單一處理對 ICSI 後豬卵母細胞卵裂的影

響………...79 六、DTT 及電激活的聯合處理或單一處理對 ICSI 後豬胚發育的影響……85 伍、討論………...93 陸、結論……….100 柒、參考文獻……….101

(13)

表次

頁次

表 1. 含抗生素生理鹽水………44

表 2. Dulbecco 磷酸緩衝鹽溶液(D-PBS)………...45

表 3. North Carolina State University-23 (NCSU-23)培養液…………...……..46

表 4. 精子洗滌液………...…….48

表 5. 豬精子體外獲能培養液………...………….49

表 6. 豬精子體外受精培養液………...….51

表 7. Hepes-buffered Tyrode’s(HbT)………...…..56

表 8. 經體外成熟培養 48 小時的豬卵母細胞成熟率………...…66

表 9. 分析 IVF 後 16-18 小時豬卵母細胞存活率、穿透率及多精入卵率……67

表 10. 分析 ICSI 後 16-18 小時的豬卵母細胞存活率及雄原核形成率..……69

表 11. 不同的顯微注射針內徑對 ICSI 後 16-18 小時的豬卵母細胞存活與 雄原核形成的影響………..70

表 12. DTT 與電激活聯合處理對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時的存活 與正常受精的影響………...73

表 13. DTT 與電激活聯合處理對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時的致活 反應與雄原核形成的影響………...74 表 14. DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時的存活與正常受

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精的影響………...76 表 15. DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時精子形態的影響...78 表 16. DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時致活反應的影響...80 表 17. DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 48 小時卵裂的影響………….84 表 18. DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 48 小時精卵形態的影響…….86 表 19. DTT 及電激活對豬胚經 ICSI 後 168 小時發育的影響………...89

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圖次

頁次

圖 1. 使用 piezo pulses 來操作 ICSI………...…55

圖 2. 經 IVM 後 44-48 小時,成熟豬卵母細胞的形態………..59

圖 3. ICSI 後的豬卵母細胞在非正常受精情況下,完整精子頭部(ISH)及去 濃縮精子頭部(DSH)的形態………...61

圖 4. 經 IVF 後 16-18 小時,豬卵母細胞多精入卵的形態………68

圖 5. 經 ICSI 後 16-18 小時,豬卵母細胞正常受精的形態………...72

圖 6. 經 ICSI 後 16-18 小時,豬卵母細胞非正常受精的形態………...77

圖 7. 經 ICSI 後 48 小時,豬胚在 2 細胞期的形態……….81

圖 8. 經 ICSI 後 48 小時,豬胚在 3 細胞期的形態……….82

圖 9. 經 ICSI 後 48 小時,豬胚在 4 細胞期的形態……….83

圖 10. 經 ICSI 後 48 小時,豬卵母細胞在非正常卵裂(1-cell)的情況下,完 整精子頭部(ISH)的形態...87

圖 11. 經 ICSI 後 48 小時,豬卵母細胞在非正常卵裂(1-cell)的情況下,去 濃縮精子頭部(DSH)的形態………...88

圖 12. 經 ICSI 後 168 小時,豬胚在桑椹胚期的形態………91

圖 13. 經 ICSI 後 168 小時,脆裂的豬胚形態………92

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壹、前言

體外受精(in vitro fertilization, IVF)為家畜胚體外生產(in vitro production, IVP)程序中的主要關鍵技術,豬 IVF 技術最早由 Harms and Smidt 於 1970 年所開始,至今雖已有許多改善與進展,但以體外成熟(in vitro maturation, IVM) 豬 卵 母 細 胞 進 行 IVF 所 導 致 多 精 入 卵 (polyspermy) 率 偏 高 與 囊 胚 (blastocyst)品質及發育率偏低的問題仍未完全解決。多精入卵現象會導致多 倍體(polyploidy)豬胚產生,胚的發育品質也跟隨著降低。於是近年來發展 另 一 項 新 的 生 殖 技 術 - 精 子 顯 微 注 射 (intracytoplasmic sperm injection, ICSI),以解決 IVF 多精入卵的問題。ICSI 是一項將精子直接注射進入卵母 細胞細胞質而使其受精的重要技術,ICSI 應用範圍相當廣泛,能解決不孕 症的問題、研究精卵作用機制、製作轉殖基因動物與避免 IVF 中多精入卵 現象的發生等。但 ICSI 應用在豬上卻有雄原核(male pronuclear, MPN)形成 率與囊胚發育率偏低的問題存在,因此近年來許多研究嘗試應用物理及化 學方式處理精子、卵母細胞或受精卵,改善這些問題,但單獨的物理或化 學處理方式對 ICSI 胚的改善效果不盡相同。精子的 DNA 被魚精蛋白以雙 硫鍵(protamine disulfide bonds)緊密包覆著,若能順利還原魚精蛋白雙硫 鍵,則可以促進精子的去濃縮作用(decondensation),進而提高雄原核的形成 率。已知二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)為魚精蛋白雙硫鍵的還原劑,於 ICSI 前,以 DTT 處理精子,能還原精子的魚精蛋白雙硫鍵。此外應用電激活

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(electrical activation, EA)的方式也能改善雄原核的形成並致活卵母細胞,提 高囊胚的發育率,主要原因是給予卵母細胞電刺激可以使其細胞膜上產生 膜孔(pores),促使細胞外鈣離子的攝入,進而提高細胞內的鈣離子濃度,同 時致活卵母細胞。本試驗之目的:一、以體外成熟豬卵母細胞為對象,進 行 IVF 或 ICSI,並觀察兩者在受精之後的受精形態,同時建立本實驗室 ICSI 技術的標準化步驟;二、應用 DTT 處理公豬精子並聯合豬卵母細胞的電激 活,改善 ICSI 後豬卵母細胞的雄原核形成及豬胚發育,且搭配壓電脈衝顯 微操作儀(piezo micro manipulator, PMM),以減少 ICSI 過程中對豬卵母細胞 的傷害,提高 ICSI 後豬卵母細胞的存活率。

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貳、文獻檢討

一、卵母細胞的成熟作用與受精作用 (一)、卵母細胞的成熟作用

哺乳動物的卵原細胞(oogonium)在胎兒時期已經開始增生分裂(Franchi et al., 1962),當雌性家畜在出生後,卵巢內的卵原細胞均已完成增生分裂,

且歷經過第一次減數分裂前期(prophase I)後進入核網期(dictyate),此時的濾 泡隨著個體成長而發育,濾泡內的卵母細胞染色質被分散在一巨大的細胞 核中,稱之為生發泡(germinal vesicle, GV),此時的卵母細胞被稱為初級卵 母細胞(primary oocyte)。這些數目眾多的初級卵母細胞在家畜出生後不久,

減數分裂即告停頓,且進入漫長的靜休期,稱之為第一次減數分裂休止(first meiotic arrest) (Black and Ericson, 1968;Guraya, 1985)。減數分裂休止現象 將會一直維持到家畜發育達發身的年齡,此後在動物的每一動情週期中,

會有一個或多個被註定能發育成熟的初級卵母細胞因腦下垂體激性腺素 (gonadotrophins) 的 刺 激 而 恢 復 其 減 數 分 裂 , 稱 之 為 減 數 分 裂 再 恢 復 (resumption of meiosis) (Thibault et al., 1975),此一過程包括生發泡的核膜首 先被瓦解而消失,染色體隨之開始被濃縮,並且經歷第一次減數分裂中期 (metaphase I)、後期(anaphase I)、與末期(telophase I)各階段,最後在第二次 減數分裂中期(metaphase II, M II)將第一極體(first polar body)排出,此時的 卵母細胞已被成熟為次級卵母細胞(secondary oocyte),在濾泡內準備被排

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出。卵母細胞的成熟作用再度呈現減數分裂休止狀態,稱之為第二次減數 分裂休止(second meiotic arrest)。

如果第二次減數分裂休止的卵母細胞與精子發生受精作用,則卵母細 胞會被致活(activated),繼續完成其第二次減數分裂作用,並排出第二極體 (second polar body) (Hunter and Polge, 1966;Tsafriri et al., 1983)。卵母細胞 在成熟過程中,除了細胞核成熟(nuclear maturation)外,還包含細胞質成熟 作用(cytoplasmic maturation) (Thibault et al., 1975)。此外,當卵母細胞完成 其成熟作用後,經由顯微構造的觀察,可以發現許多構造上的變化,包括:

卵黃膜間隙(perivitelline space)增大、卵丘細胞與卵母細胞的間隙聯合(gap junction)被阻斷、卵質(ooplasm)中的粒線體由團狀向周邊均勻散佈、小囊泡 (small vesicle)被集中到卵母細胞的中心位置、皮質顆粒(cortical granules, CG) 朝細胞膜周邊遷移(Hyttel et al., 1986),上述的變化對往後卵母細胞的正常 受精作用與發育能力皆有極密切的關係(Moor and Warness, 1978;Cheng, 1985)。

(二)、卵母細胞的受精作用

當哺乳動物的卵母細胞與精子進行受精作用時,會產生一連串的反應 以利受精作用的起始與完成,以下將分為卵母細胞、精子與受精作用三部 份來探討。卵母細胞部份主要是說明在受精作用時,卵母細胞所產生的反 應 ; 精 子 部 份 主 要 是 說 明 獲 能 作 用 (capacitation) 與 頭 巾 反 應 (acrosome

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reaction);至於受精作用部份主要是說明受精期間的精卵融合、卵母細胞的 致活機制、防止多精入卵(polyspermy)的機制,以及受精後的原核(pronuclear) 形成。

1、卵母細胞

哺乳動物的卵母細胞除了含有細胞本身的組成份外,還有環繞在卵母 細胞外圍由糖蛋白所組成的透明帶(zona pellucida, ZP)。卵母細胞與外圍的 卵丘細胞是同時經由排卵被排出,因此精子必須先穿過卵丘細胞才能與透 明帶接觸,並穿透入卵母細胞中。在排卵時,卵母細胞細胞膜仍緊連在透 明帶的內表面,收縮之後會在細胞膜與透明帶之間留下間隙,稱之為卵黃 膜間隙,第一極體與受精後的第二極體皆被排出於此區域中。大多數哺乳 動 物 的 卵 母 細 胞 細 胞 核 在 排 卵 時 是 處 於 第 二 次 減 數 分 裂 階 段 (Hafez, 1987a)。剛排出的成熟豬卵母細胞,其細胞膜是由雙層磷脂質(phospholipid) 分子所組成,此細胞膜內層有皮質顆粒,皮質顆粒形態的改變和遷移都與 多精入卵的發生有關。當皮質顆粒與細胞膜融合後,會藉由胞釋作用 (exocytosis)釋出皮質顆粒成分,稱之為皮質反應(cortical reaction),是阻止 多精入卵的主要機制(Gulyas, 1980)。

豬卵母細胞透明帶的厚度約有 16 μm,含有 30-35 ng 蛋白質(Dunbar, 1983)。透明帶的醣蛋白是酸性醣蛋白,經加熱至 70 ℃,歷經數分鐘後可被 軟化而融解,依分子量大小分別有 ZP1、ZP2 和 ZP3 (Nakano et al., 1987a)。

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當豬卵母細胞被受精時,ZP1 被進一步分切成碳端醣蛋白的 ZP2 和氮端醣 蛋白的 ZP4 兩部份(Hedrick et al., 1987;Hatanaka et al., 1992)。豬 ZP1 易受 蛋白酵素(proteases)分解,而 ZP3 則否(Nakano et al., 1987b, 1989)。由於 ZP3 的胺基結構不會和螢光染色劑 FITC (Fluorescein isothiocyanate)結合,但 ZP1 的胺基會和 FITC 結合,所以透過螢光染色法證實,ZP1 是分布於豬卵母細 胞透明帶的外層,而 ZP3 則分布於內層(Hatanaka et al., 1988)。人和鼠卵母 細胞透明帶的醣蛋白基因有三,依基因序列大小分類為 ZPA、ZPB 和 ZPC 基因,其基因產物依序為 ZP2、ZP1 和 ZP3 (Harris et al., 1994;Hedrick, 1996)。但豬的 ZPA 基因產物是 ZP1,而其分解物為 ZP2 和 ZP4;至於豬 ZPB 和 ZPC 基因產物則分別是 ZP3 的 α鏈和 β鏈。ZP3 是和精子黏附的主 要醣蛋白(Wassarman, 1990),而 ZP2 是由 ZP1 分解而來,其功能是讓已發 生頭巾反應的精子黏附(Hasegawa et al., 1994)。

肌動蛋白(actin)是細胞骨架(cytoskeleton)的主要成分之一,所以肌動蛋 白 絲 (actin filaments) 和 胚 的 正 常 性 (embryonic normality) 有 關 (Wang et al.,1999)。在卵母細胞或胚中,許多的發育事件都需要依賴肌動蛋白絲的正

常分布,例如極體的形成、細胞核的遷移與有絲分裂(Maro et al., 1984, 1986;Taylor and Piko, 1990;Barnett et al., 1997;Matsumoto et al., 1998;

Kim et al., 1996)。Kim et al. (1997)檢測出在豬卵母細胞的受精作用或孤雌致 活(parthenogenesis)期間,肌動蛋白絲有分布作用(distribution)的現象發生;

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Wang et al. (1999)則進一步證實豬胚的發育與肌動蛋白絲的分布作用有關。

2、精子

精子需先經由獲能作用後,才具有受精能力,當精子進一步發生頭巾 反應後,能穿透卵母細胞而受精。以下將分別探討精子獲能作用與頭巾反 應。

(1)、精子獲能作用

哺乳動物的精子需要在附睪中停留 10-15 日,使精子具有受精能力 (Hafez, 1987b)。當精子與卵母細胞接觸和穿透之前,必須在雌性生殖道停 留,此過程稱之為精子獲能作用。獲能作用可能開始於陰道及子宮頸,而 主要發生在子宮及輸卵管,尤其是輸卵管峽部,因為生殖道分泌物引起精 子表面成分的改變或去除,而使精子獲能(Chang, 1951;Austin, 1951)。將 獲能後的精子重新暴露回精漿中,精子頭部表面被覆蓋糖蛋白分子,導致 精子失去受精的能力,稱之為去獲能作用(decapacitation) (Cheng, 1985;

Hafez, 1987b)。用附睪的精子進行體外受精,其受精率高於射出的精子,主 要原因為精子表面最初的覆蓋物質是來自附睪,其次才是來自精漿,而最 初的覆蓋物質並不穩定,所以容易在體外被改變或移除,但是來自精漿的 覆蓋物質卻不易被獲能培養液所去除(Yanagimachi, 1988)。鈣離子(calcium, Ca2+)在誘發精子獲能作用上扮演重要的角色,增加鈣離子的通透性可以促 使精子細胞膜構造發生改變,並且活化精子的腺苷環酶(adenylate cyclase)

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及前頭巾素(proacrosin),進一步誘發精子發生獲能作用(Clegg, 1983)。

(2)、頭巾反應

精子頭巾類似蓋狀(cap-like)結構,位於精子頭部的前端。頭巾內包含一 系列的水解酶(Yanagimachi, 1994;Zaneveld and De Jonge, 1991),在與卵母 細胞發生受精作用時,精子必先發生頭巾反應。頭巾反應是指精子細胞膜 (plasma membrance)與頭巾外膜融合,然後頭巾囊泡化,使得頭巾內容物能 通過形成小孔的膜,被暴露在外(Bedford, 1982;Yanagimachi, 1988)。頭巾 的囊泡化與膜的融合反應會釋放出水解酵素,如玻尿酸酶(hyaluronidase)、

頭巾素(acrosin),皆與穿透卵母細胞有關。鈣離子濃度的升高是哺乳動物精 子頭巾反應的重要步驟,在鈣離子缺乏的培養液中,精子無法進行頭巾反 應(Yanagimachi and Usui, 1974);鈣離子濃度的升高,會引起磷脂質的改變 與膜的融合(Thakkart et al., 1984),而 calcium ionophore A23187 (Ca-I)會增加 鈣離子流入精子細胞膜,引起頭巾反應(Flechon et al., 1986)。卵丘細胞與卵 母 細 胞 透 明 帶 能 誘 導 哺 乳 動 物 精 子 的 頭 巾 反 應 (Bleil and Wassarman, 1983),因為頭巾反應的發生會導致頭巾成分的釋放和暴露,使精子能穿透 卵母細胞而受精,所以頭巾反應對正常的受精作用而言是重要且必須的 (Bazer et al., 1987),而頭巾是否能被瓦解則是取決於頭巾反應是否能夠發生 (Katayama et al., 2002)。精子的頭巾與卵母細胞透明帶表面接觸後,會將頭 巾遺留在卵母細胞的透明帶表面上,而後精子會與卵母細胞細胞膜結合,

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進行下一步受精過程(Yanagimachi, 1988),頭巾的存在會阻礙卵母細胞細胞 質內生理變化的發生。

3、受精作用

受精作用始於精卵融合,隨後卵母細胞會進行致活與防止多精入卵的 機制,於受精作用後,精子與卵母細胞單套的染色體會分別形成雄原核與 雌原核。以下將分別探討精卵融合、卵母細胞的致活機制、防止多精入卵 的機制與原核的形成。

(1)、精卵融合

哺乳動物的精卵融合是指歷經獲能作用的精子,黏附於卵丘細胞層,

進行頭巾反應後穿入卵母細胞的透明帶與細胞膜,產生融合作用,將精子 核併入卵細胞質的過程。卵母細胞的透明帶與獲能的精子表面有專一性鍵 結位置或受體,因此精卵融合有種別的專一性。不同物種間的專一性程度 卻有差異,例如倉鼠(hamster)的精子可以黏附到豬卵母細胞的透明帶上,而 人類的精子無法黏附到不同物種卵母細胞的透明帶上;卵黃膜的專一性不 如透明帶,但仍有某種程度的選擇性。精子的頭巾反應對精卵融合是必要 的,沒有透明帶的卵母細胞與沒有發生頭巾反應的精子相接觸,無法發生 精卵融合現象。當已發生頭巾反應的精子與卵母細胞接觸,並穿透卵母細 胞透明帶時,精子頭部移向卵黃膜間隙並與細胞膜接觸,此時卵母細胞被 致活,排出第二極體,精子以赤道節(equatorial segment)的表面與卵母細胞

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的細胞膜融合(Hafez, 1987b)。

(2)、卵母細胞的致活機制

在受精前,成熟卵母細胞藉由活化的細胞靜止因子(cytostatic factor, CSF)維持細胞內成熟啟動因子(maturation promoting factor, MPF)的活性,導 致細胞週期靜休於第二次減數分裂中期(M II) (Masui and Markert, 1971;

Newport and Kirschner, 1984;Kubiak et al., 1993)。分子量為 34000 道爾頓 (dalton)的 MPF 是由依週期素蛋白質激酶(cyclin-dependent kinase, P34cdc2)及 週期素 B(cyclin B)二種次單元所構成(Dunphy et al., 1988;Labbe et al., 1989);當 P34cdc2與 cyclin B 呈現結合狀態時,MPF 便具有活性。在受精過 程中,當精子穿入卵母細胞透明帶而接觸細胞膜時,便開始激活 M II 期卵 母細胞的訊息傳導作用(signal transduction),導致卵母細胞內的鈣離子呈現 週期性的潮湧(Cuthbertson and Cobbold, 1985;Igusa and Miyazaki, 1986),激 發後的鈣離子隨即被攜鈣素(calmodulin)捉取,活化依攜鈣素蛋白質激酶 (calmodulin-dependent protein kinase II, CaM II),進而誘導 P34cdc2進行磷酸 化作用,或引發 cyclin B 退化及 CSF 活性下降,導致 P34cdc2與 cyclin B 的 結合狀態瓦解,而使 MPF 活性下降,因此卵母細胞被致活,恢復減數分裂,

走出中期並完成第二次減數分裂(Doree et al., 1989;Murray and Kirschner, 1989;Lorca et al., 1993),當受精卵於雌原核(female pronuclear, FPN)與雄原 核(male pronuclear, MPN)形成後,隨即進入細胞週期(cell cycle)的合成期(S

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phase),啟動 DNA 的複製(Pinto-Correia et al., 1995),準備進行第一次的有 絲分裂(mitosis)。

(3)、防止多精入卵的機制

受精後的卵母細胞表面立即改變,防止與周圍多餘的精子融合,此機 制若未達成時,則會有多精入卵的現象發生,導致多倍體胚的形成,造成 胚的死亡或不正常的發育(Hunter, 1976)。大多數的哺乳動物,例如綿羊、

豬、狗、倉鼠等,是利用卵母細胞上的透明帶當作防止多精入卵的屏障;

而有些動物,例如兔等,是利用卵母細胞細胞膜來防止多精入卵的發生。

當精子穿透卵母細胞時,卵母細胞內皮質顆粒成分會以胞釋作用的方式釋 放到卵黃間隙,此時透明帶的屏障開始作用,這些皮質顆粒成分會導致卵 母細胞透明帶與細胞膜的表面改變,發生皮質顆粒反應(Hafez, 1987b;

Gulyas, 1980;Szollosi, 1967)。皮質顆粒釋放物含有酶,能使透明帶發生硬 化現象(zona hardening),阻止其他精子的繼續穿透,達到防止多精入卵的效 果(Bleil and Wassarman, 1983;Bleil et al., 1988;Moller and Wassarman, 1989)。豬卵母細胞透明帶上的 ZP3 可和精子黏合,誘發豬精子的頭巾反應 (Berger et al., 1989a, 1989b;Yurewicz et al., 1991;Fierro et al., 1994),豬和 牛的受精過程中,透明帶的 ZP1 和已發生頭巾反應的精子結合後,隨即促 使透明帶硬化以阻止多精入卵(Hatanaka et al., 1992;Noguchi et al., 1994)。

大多數哺乳動物的多精入卵率約 1-2 %,但是豬對多精入卵的發生特別敏

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感,尤其當延遲配種或授精時,多精入卵率可提高到 15 %以上;且全身或 局部注射助孕素,增加輸卵管中助孕素的濃度,也會增加多精入卵的發生 率(Hunter, 1972b;Hafez, 1987b)。

(4)、原核的形成

當精子穿透卵母細胞透明帶且與細胞膜融合後,卵母細胞被精子致 活,通過第二次減數分裂中期、第二極體與皮質顆粒(CG)被排出、精子細 胞 核 與 卵 母 細 胞 染 色 體 分 別 形 成 雄 原 核 (MPN) 與 雌 原 核 (FPN) (Hafez, 1987b)。受精前,精子的 DNA 被魚精蛋白(protamine)緊密地包覆著,形成 非常濃縮的染色質;在受精後,魚精蛋白被組蛋白(histone)所取代而瓦解 (Shimada et al., 2000;Nakazawa et al., 2002),精子的細胞核開始進行去濃縮 作用(decondensation),且 DNA 開始合成。牛未成熟的卵母細胞被精子穿透 後無法形成雄原核,顯然雄原核的形成需要成熟卵母細胞細胞質內的某些 因子,此因子稱為雄原核生長因子(male pronucleus growth factor, MPGF) (Hunter, 1972a;Hafez, 1987b)。生發泡時期的豬卵母細胞能被受精,但是雄 原核卻無法形成,只有生發泡瓦解(germinal vesicle break down, GVBD)後的 豬卵母細胞,能使精子的細胞核形成雄原核,並且進行正常的 DNA 合成,

此等結果說明了卵母細胞成熟期間合成的蛋白質,與卵母細胞成熟後的受 精作用及早期胚的發育有關(Moor and Trounson, 1977;Nagai et al., 1983;

Masui and Clarke, 1979)。

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二、卵母細胞的體外成熟與體外受精 (一)、卵母細胞的體外成熟

體外成熟(in vitro maturation, IVM)過程是自卵巢有腔濾泡(antral follicle) 取得卵丘卵母細胞複合體(cumulus-oocyte complex, COCs),於成熟培養液中 培養一段期間,生發泡核膜消失,細胞核進行減數分裂,最後到達 M II 期 (Sato et al., 1978;Motlik et al, 1984)。卵母細胞周圍的卵丘細胞參予了許多 成熟作用,因此影響卵母細胞的成長與成熟、減數分裂的中止與恢復、卵 母細胞細胞質的成熟、以及早期胚的發育(Lawrence et al.,1978;Eppig, 1982;Coskun and Lin, 1994;Petr et al., 1996;Ka et al., 1997;Yamauchi and Nagai, 1999;Bing et al., 2002;Tanghe et al., 2002)。Wongsrikeao et al. (2005) 證實卵丘細胞的存在對豬卵母細胞的核成熟、受精與受精後的發育極為重 要。取自卵巢濾泡內未成熟的卵母細胞,進行體外成熟培養,可以使其恢 復減數分裂(Pincus and Enzmann, 1935)。豬卵母細胞能在體外完成成熟作用 早已被證實(Edwards, 1965;Foote and Thibault, 1969),但是體外成熟的卵母 細胞有時會引起異常的減數分裂與不完全的細胞質成熟(McGaughey and Polge, 1971;Moor and Trounson, 1977),導致受精後胚的異常發育。

影響卵母細胞體外成熟的因子包括:濾泡的大小(Motlik et al., 1984)、

卵丘細胞的有無、以及培養液的組成(Fukui et al., 1982)等,所以要提高卵母 細胞的體外成熟率,除了使用良好的體外成熟培養液外,卵母細胞應選自

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直徑 3-5 mm 的濾泡(Marchal et al., 2002),而且使用健康且含有卵丘細胞的 卵母細胞進行體外培養(Shioya et al., 1988)。豬的卵丘卵母細胞複合體 (COCs)經體外成熟培養,其外圍的卵丘細胞會呈現粘液化擴散現象,已粘 液化擴散的卵丘卵母細胞複合體,其成熟率高達 86-89 % (Minato and Toyoda, 1982a, 1982b)。目前有關豬卵母細胞的研究,卵巢都是由屠宰場取 得,然後運回實驗室取卵進行進一步的體外成熟培養。在豬卵巢運送及操 作過程中,豬卵巢可能長時間處於低溫之下,而影響豬卵母細胞的成熟能 力。Yuge et al. (2003)指出,將豬卵巢暴露於 30 ℃,並不會影響豬卵母細胞 的成熟能力,但是將豬卵巢置於 25 ℃或 25 ℃以下時,會降低豬卵母細胞 的成熟能力。因此,若要運送豬卵巢時,最好將豬卵巢保存在 30 ℃以上,

以確保其卵母細胞的成熟能力。

(二)、卵母細胞的體外受精

體外受精(in vitro fertilization, IVF)常被應用於動物生殖科技中,此技術 發展至今已有大幅度的改善,以下將針對體外受精的發展與應用,及影響 體外受精的主要因素來做探討。

1、體外受精的發展與應用

體外受精乃是將精子與成熟的卵母細胞在體外共培養而使精卵融合受 精。由於精子與卵母細胞是在體外的培養皿內進行受精作用,因此可以由 人為控制精卵的品質,而生產優良或特定遺傳型的子代。哺乳動物體外受

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精最早由 Chang (1959)開發成功,他以兔子的體內成熟(in vivo maturation) 卵母細胞進行體外受精,成功地產生子代。豬的體外受精最早由 Harms and Smidt (1970)所完成,但是受精卵沒有繼續發育的能力;直到 Cheng (1985) 以體內成熟豬卵母細胞進行體外受精,將受精卵移置母體中,順利產下子 代才宣告成功;Mattioli et al. (1989)進一步以體外成熟的豬卵母細胞進行體 外受精後,移置母體中也有子代產出。近來,一些應用體外成熟卵母細胞 進行體外受精的相關研究,顯示囊胚發育率已有兩成到三成(Abeydeera et al., 2000;Funahashi et al., 1999;Xia et al., 1994),但是豬體外成熟卵母細

胞進行體外受精,多精入卵率偏高與囊胚品質及發育率低的問題,仍是主 要的障礙(Niwa, 1993;Funahashi and Day, 1997;Macháty et al., 1998;Day et al., 2000)。

2、影響體外受精的主要因素

多精入卵率偏高與囊胚品質及發育率偏低,可能受體外受精的一些條 件所影響,以下將影響體外受精的主要因素分為卵母細胞、精子、培養液 的組成、及精卵共培養的比例與時間來探討。

(1)、卵母細胞

體外受精所使用的卵母細胞一般有兩種來源,一種是取自成熟前有腔 濾泡的卵母細胞,經體外培養誘發其成熟,稱之為體外成熟卵母細胞;另 一種在激性腺素潮湧後,取自排卵前濾泡或排卵後的輸卵管,稱之為體內

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成 熟 卵 母 細 胞 。 體 外 成 熟 卵 母 細 胞 的 多 精 入 卵 率 高 於 體 內 成 熟 者 (Leibfried-Rutledge et al., 1989),可能是因為體外成熟卵母細胞的皮質顆粒 移動較體內成熟卵母細胞遲緩,導致體外受精時皮質顆粒成分無法散布出 來(Hyttel et al., 1989),較晚發生皮質顆粒反應。Mattioli et al. (1989)指出,

無論體內或體外成熟的豬卵母細胞,兩者在體外受精後皆有偏高的多精入 卵率;Nagai et al. (1988)發現,體內成熟的豬卵母細胞在體外受精後,其受 精率及雄原核形成率皆顯著高於體外成熟者;Cheng (1985)以未完全成熟或 老化的卵母細胞進行體外受精,明顯提高多精入卵的發生率。

大多數哺乳動物進行體內受精時,卵母細胞仍被卵丘細胞包覆著 (Yanagimachi, 1994;Bedford, 1996),雖然外圍無卵丘細胞的裸露卵母細胞 仍然可以完成體外受精,但卵丘細胞卻可以促進受精作用(Yanagimachi, 1988),提高體外受精的受精率,已在小鼠(mouse) (Miyamoto and Chang, 1972)、牛(Zhang et al., 1995;Tajik et al., 1993)、及豬(Ka et al., 1997;Kikuchi et al., 1993;Coy et al., 1993a;Wang et al., 1995;Wongsrikeao et al., 2005)

等物種上被證實。Van Soom et al. (2002)指出,卵丘細胞能提高體外受精率 的主因,包括引導精子朝向卵母細胞、誘發精子獲能作用及頭巾反應、阻 止未完全成熟卵母細胞的皮質顆粒反應、與導致透明帶無法硬化。所以 Tanghe et al. (2002)認為卵丘細胞在體外受精過程中擔任了重要且不容忽視 的角色。

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除了卵母細胞本身的成熟程度與卵丘細胞的影響外,溫度也會影響成 熟卵母細胞體外受精的結果。低溫使豬卵母細胞的微管蛋白(tubulin)去聚集 化 (depolymerization) , 導 致 減 數 分 裂 紡 錘 絲 (meiotic spindle) 的 微 管 (microtubules)瓦解(Aman and Parks, 1994);低溫也使成熟豬卵母細胞的透明 帶硬化(Parks and Ruffing, 1992),上述低溫的兩種影響都會導致成熟豬卵母 細胞受精能力降低。Yuge et al. (2003)證實,成熟豬卵母細胞置於 20 ℃下,

會影響正常受精能力,Martino et al. (1996)指出,成熟牛卵母細胞分別置於 0 ℃、10 ℃下,其卵裂(cleavage)能力與囊胚發育能力皆顯著降低。相較於 其他哺乳動物,豬卵母細胞對於低溫有更高的敏感性(Leibo et al., 1996;

Pollard and Leibo, 1994),導因於豬卵母細胞有較高的脂質成分(McEvoy et al., 2000;Mohr and Trounson, 1981;Nagashima et al., 1994)。事實上,豬卵

母細胞的脂肪酸含量比牛和綿羊者還要高出兩倍(McEvoy et al., 2000)。

(2)、精子

精子的活力與品質都會影響到體外受精的結果,目前體外受精所使用 的精子來源有三種:分別是附睪精子、射出精子、子宮及輸卵管內沖出的 精子。來自附睪的精子在體外容易獲能(Iritani et al., 1978;Nagai et al., 1988),而射出精子的體外獲能方式因物種而異。倉鼠附睪精子經稀釋後,

置於含白蛋白(albumin)的培養液中培養,即可獲能(Yanagimachi and Chang, 1964);小鼠附睪精子培養於培養液中一段時間,再清洗稀釋即可獲能

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(Oliphant and Brackett, 1973);公豬的射出精子需在 16-18 ℃中靜置 16 小 時,經清洗三次後再放入獲能培養液中培養,可使之獲能(Cheng, 1985)。受 精時的精子濃度也會影響體外受精的受精率及多精入卵率(Pavlok, 1981),

高濃度的精子雖然提高了受精率,相對的也提高了多精入卵率,所以豬卵 母細胞體外受精的精子濃度以 105-106 cells / ml 較適當(Cheng, 1985)。精子 的品質可以從活力、頭巾完整性、成熟狀況及形態予以評估,品質越好,

對豬卵的穿透率與受精率也就越高,所以體外受精須使用品質良好的精 子,以避免影響體外受精的結果。

(3)、培養液的組成

體外受精培養液主要是提供精子與卵母細胞進行體外受精作用時所需 的成分,其中鈣離子在精卵受精作用上擔任重要的角色,雖然母豬生殖道 分泌物的鈣離子濃度只約 1 mM,但是將培養液中的鈣離子濃度提高至 4.72 或 7.64 mM,有利於豬卵母細胞體外受精的受精率及早期胚的發育能力 (Cheng, 1985;Hsieh, 1989;Hartmann, 1983)。丙酮酸鈉(sodium pyruvate)與 咖啡因(caffeine)可以維持和提高精子的活力,促進胚的發育(Hsieh, 1989)。

在體外受精的過程中,適當的溫度、精卵混合時間及 pH 值,皆可以提高體 外受精的受精率(Cheng, 1985)。

(4)、精卵共培養的比例與時間

體外受精時,精卵共培養的比例也會影響體外受精的穿透率與多精入

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卵率(Xu et al., 1996;Rath, 1992),當精子濃度越低時,雖然能提高單精入 卵率,但同時伴隨著低穿透率的發生(Abeydeera and Day, 1997)。Gil et al.

(2004a)分別使用五種不同的精卵比例 (2000、3000、 4000 、6000、 8000 spermatozoa per oocyte)進行體外受精,當精卵比例提高,則穿透率顯著提 高,單精入卵率顯著降低;反之,當精卵比例降低,則穿透率顯著降低,

單精入卵率卻顯著提高。在精卵共培養的時間上,縮短共培養的時間能提 高單精入卵率(Coy et al., 1993b;Ocampo et al., 1994)。目前普遍使用的共培 養時間為 5-6 小時(Abeydeera and Day, 1997;Abeydeera et al., 2000;Wang et al., 1999;Funahashi et al., 1999;Gil et al., 2003)。Gil et al. (2004b)分別使用

四種不同的精卵共培養時間(10、30、60 分鐘及 6 小時),發現 6 小時與 60 分鐘的單精入卵率顯著(P < 0.04)高於 10 及 30 分鐘,而四組的穿透率及囊 胚發育率則無顯著差異,顯然縮短精卵共培養的時間也無法改善體外受精 的效率。

3、改善體外受精的新技術

雖然有許多方式可以改善體外受精的效率,但是多精入卵的發生率仍 舊不低,尤其在豬的體外受精上,多精入卵的發生率比起其他物種來得更 高。最近已發展另一種技術來避免體外受精時多精入卵現象的發生,以單 一精子顯微注射到卵母細胞細胞質後,可以在體外繼續生存及分裂(Keefer, 1989),經移置母體後也有子代的產生(Mann, 1988)。

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三、精子顯微注射

(一)、精子顯微注射的發展與應用

精子顯微注射(intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI)是一項將單一精子 直接打入到卵母細胞細胞質的重要技術,當精子活動力不高導致不孕症 時,可利用 ICSI 來改善。除此之外,ICSI 還可以用來繁殖瀕臨絕種的動物,

研究精卵之間的作用機制(Lee et al., 2003),製作轉殖基因動物(Lai et al., 2001;Perry et al., 1999),與避免 IVF 中多精入卵的發生(Wu et al., 2001)。

因此近年來在生殖科技方面備受重視且不斷地在發展與改良。最早使用 ICSI 的記載是 Hiramoto (1962)對海膽所進行的試驗,而將 ICSI 應用在哺乳 動物,是 Uehara and Yanagimachi (1976)將 ICSI 應用在倉鼠卵的受精上;但 ICSI 是從 1990 年開始才漸漸有明顯的發展。自從 1990 年開始,陸續有 ICSI 應用在一些物種的成功案例被發表,例如人類(Palermo et al., 1992, 1993;Van Steirteghem et al., 1993a, 1993b;Tesarik, 1996)、小鼠(Ahmadi et al., 1995;

Kimura and Yanagimachi, 1995;Lacham-Kaplan and Trounson, 1995)與豬 (Martin, 2000)等,均使用體內成熟的卵母細胞;而牛(Goto et al., 1991)、綿 羊(Catt et al., 1996)、兔(Hosoi et al., 1988;Li et al., 2001)、馬(Grondahl et al., 1997)與貓(Pope et al., 1997),則是使用體外成熟的卵母細胞。

(二)、精子顯微注射的過程與處理

通常 ICSI 包含兩個重要步驟,首先需要損害精子尾巴(sperm tail),導

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致精子活動力降低;其次是將精子吸至注射針(injection pipette)中,當注射 針穿透卵母細胞後,吸取少量細胞質,與欲注射之精子混合,隨即順勢一 同注射至卵母細胞細胞質中。在注射前,損害精子而導致精子活動力下降 與精子細胞膜瓦解,對 ICSI 後卵母細胞是否成功受精,被認為是關鍵的步 驟,主要是由於精子活動力降低,可以讓吸取精子的操作更為容易;尤有 甚者,精子細胞膜的瓦解能使可溶性的精子因子(sperm factors)更容易被釋 放,此等因子普遍地被認為可以誘導卵母細胞的致活作用(Svalander et al., 1995;Vanderzwalmen et al., 1996;Dozortsev et al., 1997)。藉由玻璃顯微注 射針對精子尾巴做機械性地處理,使精子的活動力降低的方法,包括:

scoring (Horiuchi et al., 2002;Martin, 2000)、crushing (Bourne et al., 1995)、

vigorous swiping (Wu et al., 2001)、piezo pulses (Dozortsev et al., 1998;

Katayama et al., 2007)及反覆地用注射針吸吐精子(Pope et al., 1998)。PVP (polyvinylpyrrolidone)被大部分的實驗室用來降低精子的活動力與導致精子 尾巴的損壞,但是 PVP 對於 ICSI 後卵母細胞的生存率與發育率皆是有害的 (Tesarik et al., 1994;Feichtinger et al., 1995)。

普遍上 ICSI 技術都只針對精子尾巴進行機械性的處理,對於精子頭部 細胞膜則多使用化學藥劑,目的是為了使精子活動力降低,並使精子細胞 膜瓦解,導致可溶性的精子因子在卵母細胞細胞質中更容易被釋放出來,

致活卵母細胞,俾能順利完成受精作用。目前普遍使用的兩種化學藥劑,

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分別是 Triton X-100 與二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT),其主要功用是損害 精子頭部細胞膜,但這兩種化學藥劑對於 ICSI 後的卵母細胞發育皆有危害 (Szczygiel and Ward, 2002)。所以近幾年來,ICSI 技術漸漸地在各實驗室中 被改良與修飾,尤其是針對精子頭部細胞膜的機械性處理方式,不使用化 學藥劑去作處理,免除化學藥劑對 ICSI 後卵母細胞的傷害,提高 ICSI 後卵 母細胞的生存率與發育率(Yong et al., 2003, 2005)。Kim et al. (1998)指出,

僅注射精子的頭部或連同尾巴一齊注射至豬卵母細胞中,皆不會影響 ICSI 後豬卵母細胞的正常受精率、卵裂率與囊胚發育率。

(三)、精子顯微注射後的觀察指標

當進行完 ICSI 後,需要記錄 ICSI 後卵母細胞的幾個觀察指標,例如 16-18 小時後的存活率、精子去濃縮的情況、雄原核形成率、雌原核形成率、

正常受精率(同時包含 1 個雄原核、1 個雌原核及 2 個極體);48 小時後的卵 裂率與脆裂情況;168 小時後的囊胚發育率、囊胚細胞數、染色體是否正常 等。關鍵指標通常是存活率、雄原核形成率、正常受精率、卵裂率以及囊 胚發育率,ICSI 效率之所以不高,大都由於雄原核形成率偏低,導致隨後 一連串發育的異常,而雄原核形成過慢導致雌雄原核無法同步形成與發 育,造成受精率降低、異常受精與異常發育,在綿羊(Gomez et al., 1998)與 恆河猴(Sutovsky et al., 1996;Ramalho-Santos et al., 2000)的 ICSI 上皆已被證 實。

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四、精子顯微注射在豬的應用與問題 (一)、精子顯微注射在豬的應用與發展

ICSI 技術在解決人類的不孕症上被廣泛地使用著,當成年男士因為精 子數目不足或精子活動力不高時,可以藉由 ICSI 來解決(Tesarik, 1996)。ICSI 也曾應用在實驗動物上,例如小鼠(Kimura and Yanagimachi, 1995)。雖然 ICSI 在實驗動物上的應用還不廣泛,但 ICSI 則廣泛地應用在家畜,但在豬上卻 有著許多困難(Kren et al., 2003)。為何要將 ICSI 應用到豬上呢?主要原因為 豬卵母細胞進行體外受精時,相較於其他家畜,豬卵發生多精入卵的機率 超過五成以上(Abeydeera and Day, 1997;Day, 2000),因此 ICSI 被應用來解 決多精入卵的問題。最早將 ICSI 應用在豬卵受精的是 Catt and Rhodes (1995),渠等將豬精子注射至體外成熟的豬卵母細胞中,精子頭部去濃縮,

並能發育到原核階段。隨後 Kim et al. (1999b)使用體外成熟的豬卵母細胞進 行 ICSI,豬胚能進一步發育到囊胚期;Martin (2000)與 Kolbe and Holtz (2000) 使用體內成熟的豬卵母細胞進行 ICSI,成功生出健康的小豬。

公豬精子可以被冷凍保存且不破壞其遺傳成分,但在解凍後,大多數 的精子會喪失活動力或有活動力降低的現象發生(Woelders et al., 1996),對 於這些活動力不佳的精子,ICSI 是理想的生殖技術,協助沒有活動力的精 子進入卵母細胞內,最後也可以生產健康的子代。Kwon et al. (2004)證實,

利用 ICSI 注射冷凍乾燥而失去活動力的豬精子至豬卵母細胞中,能使受精

(39)

卵成功發育到囊胚期。ICSI 這項生殖技術在豬上的應用並非如預期般的順 利,主要是因為應用 ICSI 技術體外生產(in vitro production, IVP)豬胚,效率 極低,無法順利形成雄原核(Lee et al., 2003)。若無法克服這些問題,ICSI 在豬的應用上仍然充滿著困難(Martin, 2000;Nakai et al., 2003;Kolbe and Holtz, 1999, 2000)。

(二)、體外成熟豬卵母細胞的問題與改善

近來利用 ICSI 成功生產出健康的小豬,都是使用體內成熟的豬卵母細 胞(Kolbe and Holtz, 2000;Martin, 2000;Probst et al., 2002),雖然也曾利用 體外成熟的豬卵母細胞進行 ICSI,但生產出的小豬皆在生產後立即死亡(Lai et al., 2001)。使用體外成熟豬卵母細胞進行 ICSI 的主因是豬卵母細胞容易

取得,在成本與時間效率上,皆遠勝於體內成熟者。因此,當前重要的事 是如何提高體外成熟豬卵母細胞的品質,使其在 ICSI 後能發育成正常且健 康的小豬。Nakai et al. (2003)利用體外成熟的豬卵母細胞進行 ICSI,雖然也 生產出健康的小豬,但機率卻只有 1 %,所以應用體外成熟豬卵母細胞進行 ICSI 的 效 率 仍 然 很 低 。 體 外 成 熟 的 卵 母 細 胞 可 能 缺 乏 細 胞 質 因 子 (cytoplasmic factors),例如麩胱甘肽(glutathione, GSH) (Funahashi et al., 1995) 與 ATP (Collas and Poccia, 1998)。Glutathione 與 ATP 皆能幫助精子形成雄原 核,因此若能在體外成熟培養液中添加特殊成分,促使豬卵母細胞增加 glutathione 和 ATP 的含量,則可能提高體外成熟豬卵母細胞的 ICSI 效率。

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除此之外,一些卵母細胞的處理過程也會影響 ICSI 的效率,例如,部份研 究者在 ICSI 前先將卵母細胞進行離心,是為了能明確觀察到精子是否沿著 顯微注射針被注射至卵母細胞細胞質中,然而 Brown (2001)證實,離心對 ICSI 後卵母細胞的早期發育是有害的。針對體外成熟卵母細胞的問題,可 以從體外成熟培養系統的改善與卵母細胞的致活來著手解決。

1、體外成熟培養系統的改善

體外成熟培養液(IVM medium)大致上可以分為兩種,一種通常有添加 胎牛血清(fetal calf serum, FCS)與豬濾泡液(porcine follicular fluid, pFF),另 一種體外成熟培養液則不添加胎牛血清與豬濾泡液,稱之為 defined IVM medium。以下將分別進一步探討此兩種體外成熟培養液的差異,與改善方 式。

(1)、含 FCS 與 pFF 的 IVM medium

體外成熟的豬卵母細胞進行 ICSI 後,發育率不高的主要原因,乃卵母 細 胞 的末 期分 化 (terminal differentiation)未 能 完全 所致 (Probst and Rath, 2003;Lai et al., 2001)。為了解決卵母細胞成熟分化的問題,一些研究者嘗 試在體外成熟培養液中添加抑制減數分裂的化學藥劑,例如 roscovitine 能 抑制卵母細胞的減數分裂,使卵母細胞維持在生發泡期(GV 期),模擬在濾 泡中體內成熟的環境,增長卵母細胞細胞質成熟的時期(García-Roselló et al., 2006),使細胞質能達到完全成熟。Roscovitine 是一種有效的成熟啟動因子

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抑制劑(Meijer and Raymond, 2003),被添加到體外成熟培養液中能顯著提高 ICSI 後豬卵母細胞的卵裂率,且發現豬卵母細胞體外成熟 36 小時後隨即進 行 ICSI,相較於體外成熟 44 小時者,能顯著提高豬 ICSI 的正常受精率。

(2)、Defined IVM medium

Defined IVM medium 是不添加胎牛血清與豬濾泡液的 IVM medium,

以下分別探討 defined IVM medium 的應用,及 defined IVM medium 的問題 與改善。

A、Defined IVM medium 的應用

豬卵母細胞的體外成熟培養液通常會添加胎牛血清與豬濾泡液,然而 胎牛血清與豬濾泡液中卻存在著許多未知的因子或隱藏的病毒(Stringfellow and Givens, 2000),且源自於不同個體的血清或濾泡液,可能導致試驗結果 受到未知因子的影響,甚至於不具有重複性。所以發展不添加胎牛血清與 豬濾泡液的體外成熟培養液有其必要性。在許多研究豬卵體外成熟的實驗 室,已開發一些 defined IVM medium (Abeydeera et al., 1998b;Kishida et al., 2004;Katayama et al., 2007)。然而 defined IVM medium 所培養的豬卵母細 胞,其成熟率及 ICSI 後胚的發育率,卻低於含有胎牛血清與豬濾泡液的 IVM medium 所培養的豬卵母細胞。

B、Defined IVM medium 的改善

將 Cysteamine 或 β-mercaptoethanol(β-ME)添加至 IVM medium 中,能

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促進豬(Grupen et al., 1995;Abeydeera et al., 1998a;Bing et al., 2002;Nagai, 2001)、牛(Takahashi et al., 1993, 2002;de Matos and Furnus, 2000;Mizushima and Fukui, 2001;Nagai, 2001;Tsuzuki et al., 2005)、綿羊(de Matos et al., 2002) 及山羊(Gonzales et al., 2003)卵母細胞內 glutathione 的合成,因而提高囊胚 發育率。Glutathione 是卵母細胞細胞質成熟的指標(El Mouatassim et al., 1999),能啟動精子的去濃縮作用,促進雄原核形成(Funahashi et al., 1994;

Yoshida, 1993)。Glutathione 能使精子魚精蛋白雙硫鍵(protamine disulfide bonds)進行還原作用而瓦解 (Hill et al., 1999),此外在細胞核或粒腺體 (mitochondrium)周圍的 glutathione 含量較高,能保護 DNA,避免氧化傷害 (Hansen, 1999)。添加上皮成長因子(epidermal growth factor, EGF)至 IVM medium,能誘導細胞質的成熟(Ding and Foxcroft, 1994;Grupen et al., 1997),若添加 EGF 至 defined IVM medium,能增加豬卵母細胞 glutathione 的濃度,提高 IVF 後豬卵母細胞的卵裂率、囊胚發育率及囊胚細胞數 (Abeydeera et al., 2000);添加半胱胺酸(cysteine)至 IVM medium,能提高卵 母細胞內 glutathione 的濃度,啟動受精後的精子細胞膜瓦解,促進雄原核 形成(Sawai et al., 1997)。Cysteine 的效果,在豬的 IVF (Yoshida et al., 1993;

Boquest et al., 1999;Yoshioka et al., 2003)或牛的 IVF (Ali et al., 2003)皆已被 證實,主要原因為 cysteine 是 glutathione 的組成胺基酸之ㄧ(Yoshida et al., 1993)。

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Kobayashi et al. (2006)應用 100 μM cysteamine或 100 μM β-ME 的 defined IVM medium 所培養的豬卵母細胞進行 ICSI,雖然卵母細胞的成熟 率與正常受精率無顯著差異,但受精卵的囊胚發育率顯著地被提高,與添 加 pFF 者相似,顯然在 defined IVM medium 中添加 cysteamine 或 β-ME 能 取代 pFF 的效果。Kishida et al. (2004)在 defined IVM medium 中同時添加 10 ng/ml EGF 與 0.57 mM cysteine,能提高豬卵母細胞的成熟率、glutathione 的濃度與 ICSI 後的卵裂率。培養液中的 cysteine 並不穩定,所以不容易進 入 卵 母 細 胞 中 , 因 此 cysteamine 與 β-ME 對 於 提 高 成 熟 卵 母 細 胞 內 glutathione 的濃度而言更具重要性(Mizushima and Fukui, 2001;Bing et al., 2002;Yamauchi and Nagai, 1999)。Katayama et al. (2007)先使用添加 0.57 mM cysteine 的 defined IVM medium,讓豬卵母細胞成熟,完成 ICSI 後的前三小 時添加 1.71 mM cysteine 至豬胚培養液中,能提高 ICSI 後豬卵母細胞的受 精率及囊胚發育率,並成功產下健康的仔豬,惟若繼續延長 ICSI 後豬卵母 細胞暴露在 cysteine 中的時間,則不再提高受精率及囊胚發育率。Cysteine 對豬胚早期發育的影響,較重要者為促進精子細胞核的去濃縮作用,不再 影響對 ICSI 後豬卵母細胞 glutathione 的濃度,主要原因可能是雄原核形成 的過程中,需消耗 glutathione,所以 glutathione 的濃度雖無顯著提高,但雄 原核形成率卻有顯著提高(Katayama et al., 2007)。由此可知,cysteine 能提 高成熟時豬卵母細胞 glutathione 的濃度,改善豬卵母細胞的成熟率及 ICSI

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後豬胚的早期發育,而對 ICSI 後豬胚的晚期發育並無太大影響。

2、致活卵母細胞

近年來的研究指出,人為致活 ICSI 後的卵母細胞,能影響其受精率與 隨後的囊胚發育率(Rho et al., 1998a, 1998b;Suttner et al., 2000)。誘導卵母 細 胞 致 活 的 方 式 非 常 多 樣 , 常 用 的 方 式 有 物 理 性 的 電 激 活 (electrical activation, EA) (Lai et al., 2001;Lee et al., 2003),與化學性的添加 InsP3

(Inositol 1, 4, 5-triphosphate) (Wu et al., 2001)、乙醇(ethanol)、calcium ionophore A23187 (Ca-I)、6-dimethylaminopurine (DMAP)、cycloheximide (CHX) (Rho et al., 1998b;Suttner et al., 2000;Chen and Seidel, 1997;Macháty and Prather, 1998;Prather et al., 1999)等激活物質。電激活、乙醇與 InsP3的 作用,均能藉由提高卵母細胞內的鈣離子濃度而致活卵母細胞,在豬的核 轉殖(nuclear transfer) (Onishi et al., 2000)、孤雌致活(Zhu et al., 2002)與 ICSI (Lai et al., 2001)上都被證實。DMAP 是一種蛋白質激脢(kinase)的抑制劑,

能藉由抑制蛋白質的磷酸化(phosphorylation),導致成熟啟動因子(MPF)與細 胞靜止因子(CSF)失去活性。當 MPF 與 CSF 皆失去活性時,卵母細胞便能 被致活(Macháty and Prather, 1998;Liu et al., 1998)。CHX 能直接抑制細胞 內 cyclin B 和 CSF 的合成,使卵母細胞內 MPF 的活性下降(Motlik and Kubelka, 1990),達到卵母細胞致活的效果,並讓卵母細胞在致活處理後的 3-5 小時形成雌原核(FPN),此等致活效果已在兔(Pinto-Correia et al., 1993)、

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綿羊(Campbell et al., 1994)、牛(Presicce and Yang, 1994)等物種上被證實。

DMAP 與 CHX 皆可以使未受精或核轉殖的卵母細胞致活(Booth et al., 2001)。

(1)、鈣離子濃度的提高

提高卵母細胞內的鈣離子濃度,確實可以致活卵母細胞。以下將分別 探討卵母細胞經受精作用後,卵母細胞內鈣離子濃度的變化對卵母細胞致 活的影響,與進行電激活處理,對 ICSI 後豬卵母細胞發育品質的影響。

A、受精作用對卵母細胞內鈣離子濃度的影響

當精子與卵母細胞受精後,有一連串的事件發生,包含卵母細胞通過 第二次減數分裂中期、第二極體與皮質顆粒的排出、精子細胞核與卵母細 胞染色體分別形成雄原核(MPN)與雌原核(FPN)。上述事件的發生,乃由於 精卵受精後鈣離子濃度發生變化所致,即鈣離子可以致活受精後的卵母細 胞,而啟動鈣離子發生變化的是精子。精子啟動卵母細胞內鈣離子發生變 化有三種模式:一、精子與卵母細胞細胞膜融合後,精子內的鈣離子會轉 移至卵母細胞內,進而誘導卵母細胞內一連串釋放鈣離子的訊息傳導;二、

精子與卵母細胞表面受體結合後,藉由活化 GTP 結合蛋白(GTP-binding proteins, G proteins)刺激鈣離子的釋放;三、精卵受精後,精子在卵母細胞 內釋放卵母細胞致活因子(oocyte-activating factor)或精子因子,這些因子能 導致卵母細胞內鈣離子濃度發生變動(Lee et al., 2003)。前述精子與卵母細

(46)

胞受精所發生的事件,在 ICSI 的卵母細胞中卻不易發生。

B、電激活的應用與理想條件

Lai et al. (2001)和 Lee et al. (2003)利用電刺激方式來致活 ICSI 的豬卵 母細胞,結果發現 ICSI 的豬卵母細胞經電激活處理後,雄原核形成率與囊 胚發育率皆有顯著提高。主要原因為電激活能引起卵母細胞細胞膜形成膜 孔,促進細胞外鈣離子的攝入(Onodera and Tsunoda, 1989;Ozil, 1990;Collas et al.,1993),導致卵母細胞內鈣離子濃度的提高,進而致活卵母細胞。電激

活的電場強度過大或過小皆會降低囊胚發育率,所以 Lee and Yang (2004) 進行豬卵母細胞的 ICSI,並比較四種不同的電場強度(1.2, 1.7, 2.2, 2.7 kV/cm DC)對胚發育的影響,發現最理想的電場強度為 2.2 kV/cm DC,而且在 ICSI 之後 1.5 小時進行電激活處理,能提高囊胚發育率。推論其原因可能為第二 次減數分裂中期的成熟卵母細胞內有高濃度的成熟啟動因子(MPF),能促進 精子去濃縮作用,但是成熟啟動因子的濃度會因為電激活而隨即降低,所 以當精子經由 ICSI 注射至成熟卵母細胞內,若能歷經一段適當的時間後再 給予電激活處理,便能提高雄原核形成率與囊胚發育率。Abeydeera et al.

(1993)指出,牛卵母細胞中,高濃度的成熟啟動因子能促進精子形成雄原 核,相反地,若 IVF 後降低卵母細胞內的成熟啟動因子,反而會降低精子 的去濃縮作用(Fulka et al., 1996),因此卵母細胞內成熟啟動因子確實與精子 的去濃縮形成雄原核有關。由此可知,理想的電激活條件對 ICSI 後豬卵母

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細胞的發育非常重要。

(2)、使用化學藥劑致活卵母細胞

以化學藥劑的方式處理卵母細胞,確實能致活卵母細胞,若將此化學 藥劑應用於豬 ICSI 上,是否能改善 ICSI 後豬卵母細胞的發育品質。以下將 分別列出 DMAP、CHX 與 InsP3來探討。

A、DMAP 與 CHX

利用電激活致活 ICSI 後的豬卵母細胞能顯著提高囊胚發育率(Lai et al., 2001;Lee et al., 2003),若在電激活之後再給予 DMAP 或 CHX,能誘發卵 母細胞進行第二次致活(Nussbaum and Prather, 1995),因此在豬卵母細胞的 孤雌致活上,電激活聯合 DMAP 或 CHX 能改善豬胚的發育(Tian et al., 2004)。Tian et al. (2006)結合電激活與 DMAP 處理,對 ICSI 後豬卵母細胞 進行二次致活,與電刺激單次致活比較,發現前者能顯著提高豬卵母細胞 的致活率、正常受精率與囊胚發育率。由於 DMAP 會抑制紡錘絲組成份的 磷酸化作用,導致紡錘絲瓦解,隨後阻礙第二極體的排出(Macháty and Prather, 1998;Liu et al., 1998),因此,若電激活之後隨即使用 DMAP,可 能導致第二極體無法排出,影響胚的發育,所以 DMAP 必須在第二極體排 出後才能使用。通常卵母細胞在電激活後 7 小時能確實排出第二極體,但 此時的卵母細胞過於老化,若隨即使用 DMAP 誘發第二次致活,可能會影 響 ICSI 後卵母細胞的發育,因此,Tian et al. (2006)將電激活聯合 DMAP 的

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二次致活時間間隔縮短為 4 小時,卵母細胞不會過於老化,且排出第二極 體的機率約為八成,故 4 小時為二次致活的最佳時間間隔。

B、InsP3

InsP3能誘導卵母細胞內質網(endoplasmic reticulum, ER)釋放鈣離子,提 高細胞內鈣離子濃度,誘發卵母細胞致活(Wu et al., 2001)。Amano et al.

(2004)證實,注射 InsP3至豬卵母細胞中,能誘發卵母細胞的致活作用,且 能進一步卵裂並形成囊胚。但 García-Roselló et al. (2006)將精子與 InsP3同 時注射至體外成熟的豬卵母細胞中,並沒有改善 ICSI 後豬卵母細胞的卵裂 率與囊胚發育率,推論其原因可能為 InsP3的作用時機點不對,造成致活的 情況與自然受精時不同(Banrezes et al., 2004),因此若能找到使用 InsP3的適 當作用時機點,也許能改善 ICSI 的效率。

(三)、雄原核形成率偏低的問題與改善

當精子與卵母細胞受精後,精子頭部開始進行去濃縮作用,形成雄原 核。大多數的豬卵母細胞進行 ICSI 後,無法正常地誘導精子頭部進行去濃 縮作用,雄原核無法形成,導致 ICSI 後豬卵母細胞的發育率降低。Lee et al.

(2003)觀察 ICSI 後發育失敗的豬卵母細胞,發現不發育的原因有八成是因 為雄原核形成失敗所致。因此若能提高雄原核形成率,或許就能提高 ICSI 後豬卵母細胞的發育率。以下幾點說明 ICSI 後精子無法進行去濃縮作用,

且雄原核無法形成的原因,與改善方法。

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1、精子細胞膜的阻礙

精子細胞膜會阻礙精子細胞核去濃縮因子(sperm nucleus-decondensing factor)與精子因子的作用,以致雄原核形成困難,且卵母細胞的致活反應不 易,在此將說明精子細胞膜的特性及瓦解精子細胞膜的方法,並探討精子 細胞膜的瓦解是否能改善 ICSI 的效率。

(1)、精子細胞膜的特性

精子細胞膜位於精子頭部最外層,當精子與卵母細胞受精時,精子細 胞膜會與卵母細胞細胞膜融合,導致裸露的精子細胞核進入卵母細胞細胞 質中。然而在 ICSI 的過程中,精子細胞膜會完整包覆精子細胞核,直接進 入卵母細胞細胞質中,而卵母細胞細胞質中並無使精子細胞膜移除的因子 存在(Maleszewski, 1990)。雖然成熟卵母細胞細胞質中含有精子細胞核去濃 縮因子,能誘發精子細胞核進行去濃縮作用,但此等去濃縮因子卻無法穿 透完整的精子細胞膜(Dozortzev et al., 1994),因此,注射精子前必須先瓦解 精子細胞膜,使精子細胞核與胞器被釋放在卵母細胞細胞質中,才能使精 子細胞核去濃縮因子順利作用在精子細胞核上。所以在 ICSI 前將精子細胞 膜瓦解,對精子頭部去濃縮作用與 ICSI 後卵母細胞的發育極為重要 (Dozortsev et al., 1995)。除此之外,可溶性的精子因子也因為精子細胞膜的 瓦 解 而 被 釋 放 , 並 誘 發 卵 母 細 胞 的 致 活 反 應 (Svalander et al., 1995 ; Vanderzwalmen et al., 1996)。精子細胞膜的瓦解能改善 ICSI 後卵母細胞的

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受精率與囊胚發育率,在綿羊(Gomez et al., 1997)、牛(Rho et al., 1998a)、豬 (Kim et al., 1999a)等物種上皆已被證實。

(2)、瓦解精子細胞膜的方法

Triton X-100 是一種陰離子界面活性劑,能瓦解精子細胞膜(Perry et al., 1999;Szczygiel and Ward, 2002),因此 Triton X-100 應用在人類的 ICSI 上,

對卵母細胞的致活與精子的去濃縮作用皆有改善效果(Kasai et al., 1999)。

Lee and Yang (2004)使用 0.1 %的 Triton X-100 瓦解豬精子細胞膜,較未處理 的豬精子容易形成雄原核,因此提高受精卵的囊胚發育率。Tian et al. (2006) 也證實 ICSI 前藉由 Triton X-100 處理豬精子能提高 ICSI 後豬卵母細胞的正 常受精率。比較 Triton X-100 應用在小鼠與人類的精子上,卻有不同的效 果,小鼠精子細胞膜的瓦解對受精與發育沒有影響,而人類精子細胞膜的 瓦解能改善精子的去濃縮作用(Ahmadi and Ng, 1997, 1999;Kasai et al., 1999)。推論差異的原因,可能小鼠與人類精子細胞膜的生理特性與化學組 成不同,造成細胞膜的穩定性有所差異。當物種擁有穩定的細胞膜(stable membranes)時,藉由外力瓦解精子的細胞膜,能改善精子的去濃縮作用,

提高雄原核形成率與囊胚發育率。豬與人類精子的細胞膜較為類似(Lee and Yang, 2004),因此,精子經 Triton X-100 處理,可得到相似的結果。不同物 種精子的細胞膜成分不盡相同,ICSI 前精子的處理步驟也有所差異,但是 在豬的 ICSI 上,瓦解豬精子細胞膜確實能改善 ICSI 後精子的去濃縮作用,

數據

表 3. North Carolina State University-23 (NCSU-23)培養液

表 3.

North Carolina State University-23 (NCSU-23)培養液 p.61
表 4. 精子洗滌液

表 4.

精子洗滌液 p.63
表 5. 豬精子體外獲能培養液

表 5.

豬精子體外獲能培養液 p.64
表 6. 豬精子體外受精培養液

表 6.

豬精子體外受精培養液 p.66
圖 1. 使用 piezo pulses 來操作 ICSI。顯微注射針以 piezo pulses 使精子無法游動(A)。將 豬卵母細胞的極體固定於 12 或 6 點鐘方向,以 piezo pulses 使顯微注射針穿透透 明帶(B)。Ba r =  10  μm

圖 1.

使用 piezo pulses 來操作 ICSI。顯微注射針以 piezo pulses 使精子無法游動(A)。將 豬卵母細胞的極體固定於 12 或 6 點鐘方向,以 piezo pulses 使顯微注射針穿透透 明帶(B)。Ba r = 10 μm p.70
表 7. Hepes-buffered Tyrode’s (HbT) Table 7. Hepes-buffered Tyrode’ s (HbT)

表 7.

Hepes-buffered Tyrode’s (HbT) Table 7. Hepes-buffered Tyrode’ s (HbT) p.71
圖 2. 經 IVM 後 44-48 小時,成熟豬卵母細胞的形態。成熟的豬卵母細胞(Metaphase II, M II 期),以 Hoechst 33258 (A)或 lacmoid (B)染色,能觀察到第一極體與染色體。Bar

圖 2.

經 IVM 後 44-48 小時,成熟豬卵母細胞的形態。成熟的豬卵母細胞(Metaphase II, M II 期),以 Hoechst 33258 (A)或 lacmoid (B)染色,能觀察到第一極體與染色體。Bar p.74
圖 3. ICSI 後的豬卵母細胞在非正常受精情況下,完整精子頭部(ISH)及去濃縮精子頭部 (DSH)的形態。非正常受精的豬卵母細胞,以 Hoechst 33258 或 lacmoid 染色,能 觀察到一個完整精子頭部(A, B)或一個去濃縮精子頭部(C, D)。Bar = 5  μm

圖 3.

ICSI 後的豬卵母細胞在非正常受精情況下,完整精子頭部(ISH)及去濃縮精子頭部 (DSH)的形態。非正常受精的豬卵母細胞,以 Hoechst 33258 或 lacmoid 染色,能 觀察到一個完整精子頭部(A, B)或一個去濃縮精子頭部(C, D)。Bar = 5 μm p.76
表 8. 經體外成熟培養 48 小時的豬卵母細胞成熟率

表 8.

經體外成熟培養 48 小時的豬卵母細胞成熟率 p.81
表 9. 分析 IVF 後 16-18 小時豬卵母細胞存活率、穿透率及多精入卵率 Table 9. Analysis the rates of survival, penetration, and polyspermy of porcine

表 9.

分析 IVF 後 16-18 小時豬卵母細胞存活率、穿透率及多精入卵率 Table 9. Analysis the rates of survival, penetration, and polyspermy of porcine p.82
圖 4. 經 IVF 後 16-18 小時,豬卵母細胞多精入卵的形態。多精入卵的豬卵母細胞,以 Hoechst 33258 染色(A, B),能觀察到 2 或超過 2 個精子穿透豬卵母細胞。Bar = 10 μm

圖 4.

經 IVF 後 16-18 小時,豬卵母細胞多精入卵的形態。多精入卵的豬卵母細胞,以 Hoechst 33258 染色(A, B),能觀察到 2 或超過 2 個精子穿透豬卵母細胞。Bar = 10 μm p.83
表 10. 分析 ICSI 後 16-18 小時的豬卵母細胞存活率及雄原核形成率 Table 10. Analysis the rates of survival and male pronuclear formation of

表 10.

分析 ICSI 後 16-18 小時的豬卵母細胞存活率及雄原核形成率 Table 10. Analysis the rates of survival and male pronuclear formation of p.84
表 11. 不同的顯微注射針內徑對 ICSI 後 16-18 小時的豬卵母細胞存活與雄 原核形成的影響

表 11.

不同的顯微注射針內徑對 ICSI 後 16-18 小時的豬卵母細胞存活與雄 原核形成的影響 p.85
圖 5. 經 ICSI 後 16-18 小時,豬卵母細胞正常受精的形態。正常受精的豬卵母細胞,以 Hoechst 33258 (A)或 lacmoid (B, C)染色,能觀察到一個雄原核(MPN)、一個雌原核 (FPN)與兩個極體(Pb)。Ba r =  10  μm

圖 5.

經 ICSI 後 16-18 小時,豬卵母細胞正常受精的形態。正常受精的豬卵母細胞,以 Hoechst 33258 (A)或 lacmoid (B, C)染色,能觀察到一個雄原核(MPN)、一個雌原核 (FPN)與兩個極體(Pb)。Ba r = 10 μm p.87
表 12. DTT 與電激活聯合處理對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時的存活與 正常受精的影響

表 12.

DTT 與電激活聯合處理對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時的存活與 正常受精的影響 p.88
表 13. DTT 與電激活聯合處理對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時的致活反 應與雄原核形成的影響

表 13.

DTT 與電激活聯合處理對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時的致活反 應與雄原核形成的影響 p.89
表 14. DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時的存活與正常受精 的影響

表 14.

DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時的存活與正常受精 的影響 p.91
圖 6. 經 ICSI 後 16-18 小時,豬卵母細胞非正常受精的形態。非正常受精的豬卵母細胞,

圖 6.

經 ICSI 後 16-18 小時,豬卵母細胞非正常受精的形態。非正常受精的豬卵母細胞, p.92
表 15. DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時精子形態的影響 Table 15. Effects of DTT and EA on morphology of sperm of porcine oocytes at

表 15.

DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時精子形態的影響 Table 15. Effects of DTT and EA on morphology of sperm of porcine oocytes at p.93
表 16. DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時致活反應的影響 Table 16. Effects of DTT and EA on activation of porcine oocytes at 16-18 hr

表 16.

DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 16-18 小時致活反應的影響 Table 16. Effects of DTT and EA on activation of porcine oocytes at 16-18 hr p.95
圖 7. 經 ICSI 後 48 小時,豬胚在 2 細胞期的形態。2 細胞期的豬胚在位相差顯微鏡下(A) 可觀察到 2 個胚葉細胞。以 Hoechst 33258 染色(B),能觀察到 2 個細胞核。Bar = 10 μm

圖 7.

經 ICSI 後 48 小時,豬胚在 2 細胞期的形態。2 細胞期的豬胚在位相差顯微鏡下(A) 可觀察到 2 個胚葉細胞。以 Hoechst 33258 染色(B),能觀察到 2 個細胞核。Bar = 10 μm p.96
圖 8. 經 ICSI 後 48 小時,豬胚在 3 細胞期的形態。3 細胞期的豬胚在位相差顯微鏡下(A) 可觀察到 3 個胚葉細胞。以 Hoechst 33258 染色(B),能觀察到 3 個細胞核。Bar = 10 μm

圖 8.

經 ICSI 後 48 小時,豬胚在 3 細胞期的形態。3 細胞期的豬胚在位相差顯微鏡下(A) 可觀察到 3 個胚葉細胞。以 Hoechst 33258 染色(B),能觀察到 3 個細胞核。Bar = 10 μm p.97
圖 9. 經 ICSI 後 48 小時,豬胚在 4 細胞期的形態。4 細胞期的豬胚在位相差顯微鏡下(A) 可觀察到 4 個胚葉細胞。以 Hoechst 33258 染色(B),能觀察到 4 個細胞核。Bar = 10 μm

圖 9.

經 ICSI 後 48 小時,豬胚在 4 細胞期的形態。4 細胞期的豬胚在位相差顯微鏡下(A) 可觀察到 4 個胚葉細胞。以 Hoechst 33258 染色(B),能觀察到 4 個細胞核。Bar = 10 μm p.98
表 17. DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 48 小時卵裂的影響

表 17.

DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 48 小時卵裂的影響 p.99
表 18. DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 48 小時精卵形態的影響

表 18.

DTT 及電激活對豬卵母細胞經 ICSI 後 48 小時精卵形態的影響 p.101
圖 10. 經 ICSI 後 48 小時,豬卵母細胞在非正常卵裂(1-cell)的情況下,完整精子頭部(ISH) 的形態。非正常卵裂的豬卵母細胞,以 Hoechst 33258 (A)或 lacmoid (B)染色,能 觀察到一個完整精子頭部、一個雌原核(FPN)及兩個極體。Bar =  10  μm

圖 10.

經 ICSI 後 48 小時,豬卵母細胞在非正常卵裂(1-cell)的情況下,完整精子頭部(ISH) 的形態。非正常卵裂的豬卵母細胞,以 Hoechst 33258 (A)或 lacmoid (B)染色,能 觀察到一個完整精子頭部、一個雌原核(FPN)及兩個極體。Bar = 10 μm p.102
圖 11. 經 ICSI 後 48 小時,豬卵母細胞在非正常卵裂(1-cell)的情況下,去濃縮精子頭部 (DSH)的形態。非正常卵裂的豬卵母細胞,以 Hoechst 33258 (A)或 lacmoid (B)染 色,能觀察到一個去濃縮精子頭部、一個雌原核(FPN)及兩個極體。Ba r =  10  μm

圖 11.

經 ICSI 後 48 小時,豬卵母細胞在非正常卵裂(1-cell)的情況下,去濃縮精子頭部 (DSH)的形態。非正常卵裂的豬卵母細胞,以 Hoechst 33258 (A)或 lacmoid (B)染 色,能觀察到一個去濃縮精子頭部、一個雌原核(FPN)及兩個極體。Ba r = 10 μm p.103
表 19. DTT 及電激活對豬胚經 ICSI 後 168 小時發育的影響

表 19.

DTT 及電激活對豬胚經 ICSI 後 168 小時發育的影響 p.104
圖 12. 經 ICSI 後 168 小時,豬胚在桑椹胚期的形態。桑椹胚期的豬胚在位相差顯微鏡 下(A)可觀察到超過 12 個胚葉細胞。以 Hoechst 33258 染色(B),能觀察到超過 12 個細胞核。Ba r =  10  μm

圖 12.

經 ICSI 後 168 小時,豬胚在桑椹胚期的形態。桑椹胚期的豬胚在位相差顯微鏡 下(A)可觀察到超過 12 個胚葉細胞。以 Hoechst 33258 染色(B),能觀察到超過 12 個細胞核。Ba r = 10 μm p.106
圖 13. 經 ICSI 後 168 小時,脆裂的豬胚形態。脆裂的豬胚在位相差顯微鏡下(A)可觀察 到超過 20 個胚葉細胞。以 Hoechst 33258 染色(B),則觀察到無細胞核。Bar = 10 μm

圖 13.

經 ICSI 後 168 小時,脆裂的豬胚形態。脆裂的豬胚在位相差顯微鏡下(A)可觀察 到超過 20 個胚葉細胞。以 Hoechst 33258 染色(B),則觀察到無細胞核。Bar = 10 μm p.107

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