水稻側根與根毛形成之研究

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國立臺灣大學生物資源暨農學院農藝學系碩士論文

Department of Agronomy

College of Bio-Resources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

水稻側根與根毛形成之研究 Studies on the Formation of Lateral Roots and Root Hairs in Rice

陳怡萱 Yi-Hsuan Chen

指導教授：高景輝教授

Advisor: Ching Huei Kao, Professor

中華民國 100 年 7 月

July, 2011

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i

誌謝

“ I understand that the most important encounter in life is encounter with oneself. ”

Yves Saint Laurent 口試當天早上，看到紀錄片《YSL 瘋狂的愛: L’amour Fou》中，Yves Saint Laurent 說：

我了解到我這一生中最重要的經歷就是認識自己的過程。我一直覺得在台大的這六年裡面，

學到的什麼專業知識都像雲一樣輕，可是我很努力在爬梳我自己，了解自己的價值，知道自己想要成為什麼樣的人。我常常說我是幸運的小孩，可能是世界上最幸運的小孩，在這個過程中，是許多人一起成就了現在的我。

最想感謝的人當然就是我的指導教授—高景輝老師，謝謝老師三年來對於論文的指導，

實驗失敗的時候老師也總是鼓勵我們，最常掛在嘴上的話是：祝妳幸福，還要謝謝老師包容我緩慢的步調以及各式各樣奇怪的缺點，更重要的是在老師身上學到了很多人生的道理。

謝謝陳宗禮老師、王恆隆老師與奕婷學姊仔細地看了我的論文，給我許多不一樣的想法與觀點，更在百忙中抽空來當我的口試委員。謝謝洪傳揚老師，提供高科技設備，讓我的論文多了很多可愛的螢光照片，還有在我切片失敗的時候跟我分享你切片的作品，大大激勵了我想要跟你一樣成為切片高手的決心。

謝謝實驗室的夥伴們。謝謝雲洋學長，你就像實驗室的領航員，有你在我們才不會在實驗的小細節裡迷路；謝謝庭卲學姊、士玨學姊與純馨學姊，在我剛進實驗室的時候帶我做實驗，告訴我許多實驗的小訣竅；謝謝張毅竹成為實驗室的壯丁，幫我們換燈管、抬重物，還有跟我一起畢業；謝謝雲雁與麥摳，總是幫助我一些小雜事。

謝謝我的小跟班們：董迪、小牛、小根跟糗哥，我說什麼妳們都會說好，跟妳們一起的時候雖然總是瘋瘋癲癲的很失控，不過是我最開心的時候，總是無憂無慮的，不管發生什麼事都有最幽默的解釋、有最樂觀的想法。

謝謝我的爸爸跟媽媽，雖然不懂我在做什麼，仍然為我感到驕傲，給我最強而有力毫無遲疑的支持，你們是我世界上最在意的人。謝謝妹妹，對我的要求總是使命必達，有時候反而比較像姊姊照顧我。

謝謝所有的你們，成就現在的我，讓我變成世界上最幸運的人。

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ii

中文摘要

本論文以水稻品種台中在來一號 (Oryza sativa L. cv. Taichung Native 1, TN1)為材料，探討生長素與一氧化氮對黃化幼苗側根與根毛之形成是否需要Ca²⁺與heme oxygenase (HO)之參與，以及apocynin 對水稻黃化幼苗側根形成之影響。

Sodium nitroprusside (SNP，一氧化氮釋放劑)、indole-3-butyric acid (IBA，植物體中存在之生長素)與 hemin (Hm，HO 之誘導劑)處理皆會誘導水稻側根與根毛之形成。SNP 與 IBA 所誘導之一氧化氮形成以及側根與根毛形成可由一氧化氮清除劑2- (4-carboxyphenyl)- 4,4,5,5- tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide (cPTIO)所抑制，而 Hm 處理不影響一氧化氮之形成，且其對側根與根毛形成之作用也不受cPTIO 影響，nitrate reductase (NR)抑制劑 tungstate 會抑制 IBA 所誘導之一氧化氮形成以及側根與根毛之形成，顯示 IBA 是透過 NR 的作用產生一氧化氮進而影響側根與根毛之形成。Ca²⁺之螯合物、通道阻礙劑、CaM 拮抗劑與 IP3合成抑制劑皆可明顯抑制SNP 與 IBA 所誘導之側根與根毛形成，而不影響 SNP 與 IBA 所誘導之一氧化氮形成，顯示SNP 與 IBA 之作用需要 Ca²⁺之參與，且Ca²⁺位於一氧化氮與IBA 作用之下游。

SNP、IBA 與 Hm 處理皆會使 HO 的活性提升，Zn protoporphyrin IX (ZnPPIX，HO 抑制劑)與 hemoglobin (Hb，一氧化碳與一氧化氮之清除劑)皆能有效抑制 SNP、IBA 與 Hm 誘導之側根與根毛形成及HO 的活性提升。而 HO 催化反應之產物 biliverdin IXα (BV) 也可有效地誘導側根與根毛形成，這些結果說明SNP、IBA 與 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗側根與根毛之形成需要透過HO 的參與。

Apocynin 會誘導水稻側根形成與 H2O2 合成，而 diphenylene iodonium (DPI，NADPH oxidase 抑制劑)可抑制其作用，顯示 apocynin 經由 H2O2之作用調控側根形成。

關鍵字：生長素、一氧化氮、側根、根毛、水稻、鈣、HO、apocynin

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ABSTRACT

In this thesis, rice (Oryza sativa L. cv. Taichung Native 1, TN1, an Indica type) seedlings were used to investigate the involvement of Ca²⁺ and heme oxygenase (HO) in auxin- and nitric oxide (NO)-induced formation of lateral roots (LRs) and root hairs (RHs) and the effect of apocynin on LR formation.

Application of sodium nitroprusside (SNP; a NO donor), indole-3-butyric acid (IBA; a naturally occurring auxin), or hemin (Hm; a HO inducer) to rice seedlings induced the formation of LRs and RHs. LR and RH formation and NO production induced by SNP and IBA were prevented by the specific NO scavenger 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5- tetramethyl-imidazoline-1-oxyl-3-oxide (cPTIO). Hm had no effect on NO production. Hm-induced formation of LRs and RHs could not be blocked by cPTIO. Nitrate reductase (NR) inhibitor sodium tungstate completely inhibited IBA-induced LR and RH formations and NO production. Clearly the effect of IBA is attributed by NO released, and the NO generation in response to IBA might mainly involve NR activity. The effects of Ca²⁺ chelators, Ca²⁺-channel inhibitors, and calmodulin antagonists were effective in reducing the action of SNP and IBA. However, Ca²⁺ chelators and Ca²⁺- channel inhibitors had no effect on SNP- and IBA-induced NO generation. It is concluded that Ca²⁺ is involved in SNP- and IBA-induced LR and RH formations, and is acting downstream of NO and IBA.

Treatment of rice seedlings with SNP, IBA, and Hm resulted in an enhancement of HO activity.

Zn protoporphyrin IX (ZnPPIX; a HO inhibitor) and hemoglobin (Hb; a CO/NO scavenger) reduced the LR and RH formation and the enhancement of HO activity induced by SNP, IBA, and Hm. The product of HO catalyzed reaction, biliverdin IXα (BV), was also able to induce LR and RH formation and enhance HO activity. These data suggested that HO is involved in SNP-, IBA- and Hm-induced LR and RH formation.

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iv

Apocynin was able to induce LR formation and the generation of H2O2, which could be blocked by diphenylene iodonium (a NADPH oxidase inhibitor). These results indicate that the apocynin-induced LR formation is related to H2O2.

Key words: auxin, nitric oxide, lateral root, root hair, rice, calcium, HO, apocynin

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表目錄

表1. 氯化鎘、一氧化氮清除劑、一氧化氮合成抑制劑、Ca²⁺螯合物、Ca²⁺通道阻礙劑、IP3

合成抑制劑與CaM 拮抗劑對水稻黃化幼苗根細胞活力之影響……….34

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圖目錄

圖1. 不同濃度 SNP (a)、IBA (b)與 Hm (c)對水稻黃化幼苗側根形成之影響……….15

圖2. 不同濃度SNP對水稻黃化幼苗根毛形成之影響……….……….……16

圖3. 不同濃度IBA對水稻黃化幼苗根毛形成之影響……….……….……17

圖4. 不同濃度Hm對水稻黃化幼苗根毛形成之影響……….……….……18

圖5. SNP、IBA與Hm對水稻黃化幼苗側根數量之影響……….……….……19

圖6. SNP、IBA與Hm對水稻黃化幼苗根毛數量之影響……….……….……20

圖7. cPTIO對SNP、IBA或Hm所誘導之水稻黃化幼苗側根形成之影響……….………22

圖8. cPTIO對SNP、IBA或Hm所誘導之水稻黃化幼苗根毛形成之影響，與L-NAME及Tu對IBA 所誘導之水稻黃化幼苗根毛形成之影響……….……….23

圖9. cPTIO對SNP、IBA (a)或Hm (b)所誘導之水稻黃化幼苗側根數量之影響………24

圖10. L-NAME與Tu對IBA所誘導之水稻黃化幼苗側根數量之影響………25

圖11. cPTIO對SNP、IBA或Hm所誘導之水稻黃化幼苗中一氧化氮生成之影響，及L-NAME及 Tu對IBA所誘導之水稻黃化幼苗中一氧化氮生成之影響………26

圖12. SNP與IBA所誘導之一氧化氮生成於水稻黃化幼苗種子根中之分布與側根形成部位之關係………27

圖13. SNP與IBA所誘導之一氧化氮生成於水稻黃化幼苗種子根中之分布與根毛形成部位之關係………28

圖14. Ca²⁺螯合物、Ca²⁺通道阻礙劑、IP3與CaM拮抗劑對SNP及IBA所誘導之水稻黃化幼苗側根數量之影響………30

圖15. Ca²⁺螯合物、Ca²⁺通道阻礙劑、IP3與CaM拮抗劑對SNP及IBA所誘導之水稻黃化幼苗根毛形成之影響………31

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ix

圖16. Ca²⁺螯合物與Ca²⁺通道阻礙劑對SNP及IBA所誘導之水稻黃化幼苗一氧化氮合成之影

響………32

圖17. Hm對HO活性之影響………36

圖18. SNP與IBA對HO活性之影響………37

圖19. ZnPPIX對SNP、IBA與Hm所誘導之水稻黃化幼苗根HO活性之影響………38

圖20. ZnPPIX對SNP、IBA與Hm所誘導之水稻黃化幼苗側根形成數量之影響………39

圖21. ZnPPIX對SNP、IBA與Hm所誘導之水稻黃化幼苗根毛形成之影響………40

圖22. Hb對SNP、IBA與Hm所誘導之水稻黃化幼苗根HO活性之影響………41

圖23. Hb對SNP、IBA與Hm所誘導之水稻黃化幼苗側根形成數量之影響………42

圖24. Hb對SNP、IBA與Hm所誘導之水稻黃化幼苗根毛形成之影響………43

圖25. BV對水稻黃化幼苗側根形成數量之影響………44

圖26. BV對水稻黃化幼苗根毛形成之影響………45

圖27. BV對HO活性之影響………46

圖28. 不同濃度apocynin對水稻黃化幼苗側根形成之影響………48

圖29. cPTIO與DPI對apocynin處理後水稻黃化幼苗中一氧化氮 (a)與H2O2 (b)之影響………49

圖30. cPTIO與DPI對apocynin所誘導之水稻黃化幼苗側根數量之影響………50

圖31. 不同濃度H2O2對水稻黃化幼苗側根形成之影響………51

圖32. Apocynin所誘導之H2O2生成於水稻黃化幼苗種子根中之分布與側根形成部位之關係………52

圖33. 水稻幼苗根中生長素、一氧化氮與HO調控側根與根毛形成之機制………56

圖34. 水稻幼苗根中apocynin調控側根形成之機制………57

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x

縮寫字對照

AsA Ascorbic acid

BAPTA 1,2-bis(ο-Aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid BAPTA/AM 1,2-bis(ο-Aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid

tetra(acetoxymethyl) ester BSA Bovine serum albumin

BV Biliverdin IXα

Ca²⁺ Calcium ion

CaM Calmodulin Cd Cadmium CDPK Calcium-dependent protein kinase

CM-H2DCF DA 5-(and-6)-Chloromethyl-2’,7’-dichlorodihydro-fluorescein diacetate

CO Carbon monoxide

Cr Chromium Cu Copper

cPTIO 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide CPZ Chlorpromazine hydrochloride

DAF-FM DA 4-Amino-5-methylamino-2’,7’-difluorofluorescein diacetate DFO Desferrioxamine

DMSO Dimethyl sulfoxide DPI Diphenylene iodonium DTT Dithiothreitol

DW Dry weight

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xi

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EGTA Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid Fd Ferredoxin

FNR Ferredoxin-NADP⁺ reductase

FW Fresh weight

GSH Glutathione

H2O2 Hydrogen peroxide Hb Hemoglobin

HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Hm Hemin

HO Heme oxygenase

IBA Indole-2-butyric acid IP3 Inositol triphosphate KNO2 Potassium nitrate K4Fe(CN)6 Potassium ferricyanide

L-NAME N^G-nitro-L-agrinine methyl ester hydrochloride LaCl3 Lanthanum (III) chloride

LiCl Lithium chloride

LRs Lateral roots

LSD Least significant difference

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

NEO Neomycin sulfate

NO Nitric oxide

NOS Nitric oxide synthase

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xii

NR Nitrate reductase

PVP Polyvinylpyrrolidone

RHs Root hairs

ROS Reactive oxygen species

RR Ruthenium red

SAS Statistical analysis system SDS Sodium dodecyl sulphate

SE Standard error

SNP Sodium nitroprusside

TFP Trifluoperazine dihydrochloride TN1 Taichung native 1

Tu Sodium tungstate

ZnPPΙΧ Zinc protoporphyrin IX

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1

前言

根是植物重要的營養器官之一，會分化出側根及根毛，負責幫助植物吸收水分和營養鹽，以及將植株固著於土壤當中，其形成與發育主要是受生長素以及環境的訊息所調控 (Casimiro et al., 2001; Malamy and Ryan, 2001; Ridge and Katsumi, 2002; Malamy, 2005)。

一氧化氮 (nitric oxide, NO)為氣態自由基分子，早期動物方面之研究顯示，

一氧化氮是一個重要的訊息傳導分子。近年來對於植物體內一氧化氮的研究，使得一氧化氮在植物之生理反應所扮演的角色得到很大的重視。近來有一些文獻指出在植物細胞與器官的訊息傳導途徑中，生長素 (auxin)和一氧化氮間有一定程度的關聯 (Correa-Aragunde et al., 2004, 2006)。許多植物包括番茄、小黃瓜、萵苣、

阿拉伯芥等的相關研究指出生長素經由一氧化氮影響植物不定根、側根以及根毛的形成 (Correa-Aragunde et al., 2004; Lombardo et al., 2006; Pagnussat et al., 2002)。

Heme oxygenase (HO) 為生物體中重要的酵素之一，參與植物中許多生理反應，

可催化heme的分解，產生一氧化碳 (carbon monoxide, CO)與biliverdin IXα (BV)。

也有文獻指出在番茄中，經由HO的作用，可以促進植物側根及根毛的形成 (Guo et al., 2008)，並且在此過程中需要生長素與一氧化氮的參與，但是沒有人對水稻做過 這方面的研究。本論文主要在探討生長素、一氧化氮與HO對於水稻黃化幼苗側根與根毛形成的影響。

鈣離子為生物中重要的二次訊息分子，當細胞接受環境或荷爾蒙的訊息之後，

細胞質中之鈣離子濃度會提高，與攜鈣素 (calmodulin, CaM)結合活化之，進而影響其他酵素之活性，使得細胞產生不同的生理反應。因此，鈣離子在水稻黃化幼

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苗側根與根毛形成的過程中，是否扮演訊息分子的角色也是本論文想探討的主題之一。

Apocynin最初是由胡黃連 (Picrorrhiza kurroa)中萃取出之酚類化合物，常被用 來當作NADP(H) oxidase的抑制劑 (Cai et al., 2003)。在前人研究當中也發現 apocynin可以誘導一氧化氮的產生 (Tossi et al., 2009)，故我們進一步想確認在水稻 黃化幼苗中，apocynin是否也可以因此誘導側根的形成。

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前人研究

各個不同組織與器官之間訊息的流通對於多細胞生物來說是一個很重要的機制，因此細胞之間的訊息傳遞必須要快速且準確才可以確保多細胞生物生理機能的正常運作，而生物體藉由不同的系統、不同的機制去完成訊息傳導的過程。

植物與動物有非常不一樣的生活方式。植物是自營性生物，藉由行光合作用得到能量，並且固著於土壤當中，對於環境逆境必須要有一個良好的機制去對抗以維持生命。大多數的植物細胞對於環境的刺激都有很好的感應能力，可以進行一連串的反應使得整個植株可以對環境的刺激做出改變。而植物產生特殊的分子進行細胞間的訊息傳導，可能是使植物有這樣特性的一個原因。

水稻根系

根是植物一個重要的營養器官。根的周鞘細胞進行細胞分裂，穿越皮層與表皮細胞向外生長，出現在主根表面即形成側根 (Hao and Ishii, 1999)，而根的成熟部上之表皮細胞，會向外突出形成毛狀物，即為根毛。根上長出之側根及根毛，

可幫助增加吸收水分與養分的表面積，並增加將植株固著於土壤當中的能力 (Wang et al., 2006)。

水稻種子發芽時首先會長出種子根，並由種子根分化出側根及根毛，種子根的基部則會長出不定根。

側根與根毛的數量主要是受生長素以及環境的訊息所調控 (Casimiro et al., 2001; Malamy and Ryan, 2001; Ridge and Katsumi, 2002; Malamy, 2005)。前人的研究指出，水分以及無機鹽 (例如：硝酸鹽與磷酸鹽)的多寡，皆為影響側根與根毛發育的重要環境因子 (Robinson, 1994; Zhang and Forde, 1999; Forde and Lorenzo,

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4

2001)。在小麥 (Triticum aestivum)與阿拉伯芥 (Arabidopsis thaliana)當中也發現重 金屬鉻 (chromium, Cr)與銅 (copper, Cu)分別會影響其側根的發育 (Hasnain and Sabri, 1997; Pasternak et al., 2005)。

生長素

植物荷爾蒙是一種有機物質，在低濃度下即可使植物產生特殊的生理、生化或是形態上之反應。生長素為研究歷史悠久的植物荷爾蒙之一，最早由Darwin 在 1880 年於金絲雀穀草 (Canary grass, Phalaris carnariensis)的向光性試驗中發現。

生長素已被證實可調控許多植物之生理反應。促進細胞生長與分裂 (Cosgrove, 1986; Rayle and Cleland, 1992)、促進木質部與韌皮部之分化 (Jacobs, 1952; Aloni, 1980; Aloni et al., 2006)、延緩葉片老化、控制葉與果實之脫落(Osborne, 1959; Leo and Sacher, 1970; Thomas and Stoddart, 1980)、影響果實生長 (Nitsch, 1953;

Guardiola and Lázaro, 1987; Catalá et al., 2000)以及與向地性和向光性 (Pickard and Thimann, 1964; Muday, 2001; Noh et al., 2003)有關等等，其中與我們研究主題最相 關的功能即為促進植物根的形成與發育。

外加生長素可以誘導側根的形成及發育 (Torrey, 1950; Blakely et al., 1982;

Muday and Haworth, 1994)，同時也可促進根毛的形成及增長 (Jackson et al., 1960;

Tanimoto et al., 1995; Lombardo et al., 2006; Takahashi and Inoue, 2008; Guo et al., 2009)。在阿拉伯芥當中，抑制生長素由莖運移到根，可抑制其側根的發育 (Casimiro et al., 2001; Bhalero et al., 2002)。而對生長素不敏感的阿拉伯芥與水稻 (Oryza sativa)突變株，其側根的形成也會受到影響 (Casimiro et al., 2003; Wang et al., 2006)。同時，對生長素不敏感的突變株與生長素運移的突變株，aux1、axr1、axr2 及axr3，其根毛的生長也受到抑制 (Lincoln et al., 1990; Wilson et al., 1990; Okada and Shimura, 1994; Leyser et al., 1996)，而根毛形成功能缺失之阿拉伯芥突變株rhd6，

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也可果都

一氧

主要氮的植物 1998 and D Lama 2003

反

可藉由處理生都說明植物側

氧化氮

一氧化氮要著重於動物的研究，使得物的生長分化

8; Durner et Durzan, 200

attina, 200 3; Arasimow

反應一：

反應二：

生長素回復側根與根毛

(nitric oxid 物方面，是得一氧化氮在

化 (Gouvêa t al., 1998) 00; Pedroso

1)、種子萌 wicz and Flo

復其根毛的形毛之發育皆受

de, NO)是一是一個重要的

在植物之生 a et al., 1997

、程序性細 o et al., 2000 萌芽、增加鐵

oryszak-Wi

5

形成 (Masu 受生長素所

一個氣態自由的訊息傳導生理反應所扮

7; Leshem e 細胞死亡 (p 0)、抵抗逆鐵的有效性 eczorek, 20

ucci and Sc 所調控。

由基分子，

導分子。近扮演的角色 et al., 1998) programmed 逆境( Macke

性以及氣孔 007; Besson

chiefelbein,

早期對於一近年來對於植色得到很大的

)、抗病 (D d cell death erness et al., 孔的開關 (L n-Bard et al.

1994)。這

一氧化氮的植物體內一的重視，例 Delledonne e h, PCD) (Pe

, 2001; Mat Lamattina e ., 2009)等等

這些結

的研究一氧化例如：

et al., droso ta and et al., 等。

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6

一氧化氮在植物當中有兩個合成系統，分別為酵素反應系統 (Wilson et al., 2008)與非酵素反應系統。酵素反應系統：（一）一氧化氮合成酵素 (nitric oxide synthase, NOS) ，經由一氧化氮合成酵素的作用將 L-arginine 和氧氣轉變為 L-citrulline 和一氧化氮 (反應一, Forstermann et al., 1994)，並且植物與動物 NOS 的 基因與蛋白質序列並不相同；（二）硝酸鹽還原酵素 (nitrate reductase, NR)，通常硝酸鹽還原酵素在細胞質當中將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，當亞硝酸鹽在細胞質中大量累積的時候，硝酸鹽還原酵素才可能將亞硝酸鹽還原為一氧化氮 (反應二, Bories and Bories, 1995)。非酵素還原系統：在酸性情況下 (pH<4)，有適當的還原劑存在，亞硝酸鹽可以轉變為一氧化氮，一般生理狀況下，一氧化氮不會經由這個途徑合成。

近年來之研究指出在植物細胞與器官的訊息傳導途徑中，生長素和一氧化氮有一定程度的關聯 (Pagnussat et al., 2002, 2003; Correa-Aragunde et al., 2004; Ötvös et al., 2005; Correa-Aragunde et al., 2006)。在許多植物當中發現一氧化氮可以促進 不定根、側根或根毛的形成 (Creus et al., 2005)，而生長素所引起的根的發育也發現是經由一氧化氮所調控 (Pagnussat et al., 2002; Correa-Aragunde et al., 2004;

Lombardo et al., 2006)。

生長素所誘導番茄 (Solanum lycopersicum)側根發育之訊息傳遞過程中，一氧化氮扮演著重要的角色 (Correa-Aragunde et al., 2004, 2006; Guo et al., 2008)。

Lombardo 等人 (2006)最先在萵苣 (Lactuca sativa)以及阿拉伯芥當中，發現根毛形 成的過程中一氧化氮是一個重要的分子，且在生長素誘導根毛形成的過程中，需要一氧化氮的參與。近來，Guo 等人 (2009)更證實，在番茄中，一氧化氮在生長素誘導根毛的形成途徑裡，為下游的訊息。

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鈣離子

鈣為植物生長之必需元素，同時也是大量元素。植物細胞中之鈣離子的分布非常不均勻，主要儲存於液胞、胞器與細胞壁當中，鈣離子的濃度約為10^-4至10^-3 M，而細胞質當中只有微量的鈣離子存在，濃度約為 10^-7M。

鈣離子可以做為二次訊息分子，當接受環境或荷爾蒙的訊息之後，細胞壁中的鈣離子會進入到細胞質當中，而液胞與胞器中之鈣離子也會釋放到細胞質中，

使得細胞質中的鈣離子濃度提高後，鈣離子會直接與目標酵素結合影響細胞生理反應 (Felle, 1988; Gehring et al., 1990a, 1990b; Knight et al., 1991; Johannes et al., 1992; Knight et al., 1992; Shacklock et al., 1992; Gilroy and Jones, 1993)，或是與攜鈣 素 (Calmodulin, CaM)結合，活化攜鈣素，使其影響其他酵素活性，如：protein kinases 與phosphatases 等，催化一連串的反應，以調控細胞之生理 (Lee et al., 1983; Hedrich et al., 1990; Cosgrove and Hedrich, 1991; Ward and Schroeder, 1994; Bush, 1995)。

在動物中，一氧化氮為調控細胞中鈣離子恆定的重要訊息分子 (Willmott et al., 1996; Clementi, 1998)。近年來植物的研究也指出，內生或外加的一氧化氮皆可影響細胞質中之鈣離子濃度，使得細胞質中鈣離子濃度增加 (Lamotte et al., 2005;

Besson-Bard et al., 2008)。而 Lanteri 等人 (2006)也提出，在小黃瓜 (Cucumis sativus) 中，生長素與一氧化氮誘導之不定根的形成過程中，需要透過鈣離子的參與。

Heme oxygenase

Heme oxygenase (HO)是一個在生物體中重要的酵素，在動物當中的研究已經非常多 (Otterbein et al., 2003)，可以催化heme與一個分子的氧氣作用，產生一氧化碳 (carbon monoxide, CO)、二價鐵離子 (Fe²⁺)與biliverdin IXα (BV) (反應三, Muramoto et al., 2002; Terry et al., 2002)。HOs在動物當中有三個主要的形式，分別

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為HO 通常

反

例如 2002 體中 et al.

2004

缺氧 (Pian H2O2

(cadm

al., 1 在番素和

O-1、HO-2與常表現量很低

反應三：

近來，在植如阿拉伯芥中

2)，水稻中H 中參與許多重 ., 1999; Mu 4)、影響根部

動物的研究氧、與活化氧

ntadosi, 200

2) (Yannare mium, Cd)皆

近來的研究 1933; Xu et 番茄與油菜和一氧化氮的

與HO-3，HO 低。

植物體中也發中之AtHO1

HY1之同源 重要的生理 uramoto et a 部的發育

究中發現熱氧族 (reac 02)。而在植 elli et al., 20

皆會使得H

究指出HO之 al., 2006; C (Brassica n 的作用 (Ca

O-1為可誘導

發現HO-1之 1 (HY1)可以源基因SE5也理反應，包括

al., 1999; Da (Xuan et al

熱休克 (heat ctive oxyge 植物中也發 006)、sodiu HO-1 之表現

之產物一氧 Cao et al., 2 napus)中，

ao et al., 200

8

導的形式，

之活性 (Ter 以分解hem 也已經被發現

括調控phyt avis et al., 2 l., 2008; Gu

t shock)、金 en species, 發現ultravio

um nitropru 現量提升。

氧化碳可以調 2007; Guo e

一氧化碳誘 07; Guo et a

而HO-2與H

rry et al., 20 me，產生一

現 (Izawa tochrome c 2001)、抵抗 uo et al., 200

金屬、脂多 ROS)等皆 let-B、過氧 sside (SNP)

調節植物根 et al., 2008, 誘導之側根 al., 2008, 20

HO-3為持續

002; Norieg 一氧化碳 (M

et al., 2000 chromophor 抗氧化逆境

09)等。

多醣 (lipopo 皆會誘導 H 氧化氫 (hyd ) (Noriega e

根部的發育 , 2009; Xua 根與根毛形成

009)。然而也

續表現之形

ga et al., 200 Muramoto e

0)。HO-1在 re的合成 (D 境 (Noriega e

olysaccharid HO 的活性

drogen pero et al., 2007)

(Zimmerm an et al., 200

成需要透過也有文獻指

形式，

04)，

et al., 在植物

Davis et al.,

de)、

性上升 oxide, )與鎘

man et 08)，

過生長指出，

(22)

9

HO作用產生之一氧化碳，參與在生長素所誘導之小黃瓜的不定根形成過程中 (Xuan et al., 2008)。

Apocynin

Apocynin 最初是由胡黃連 (Picrorrhiza kurroa)中萃取出來的酚類化合物，胡 黃連為多年生草本植物，主要產於西藏、雲南等地，常被用來當作中藥材使用，

可以治療慢性發炎 (Meyer and Schmitt, 2000)。

Apocynin 功能的研究著重於動物方面，apocynin 常被用來當作 NADP(H) oxidase 的抑制劑 (Cai et al., 2003)，減少超氧自由基 (superoxide)的形成，以減緩 吞噬細胞 (phagocytes)中的氧化逆境 (Vejrazka et al., 2005)。然而，也有研究指出在神經膠細胞 (glial cells)中，apocynin 會藉由降低還原態 glutathione (GSH)與氧化態glutathione (GSSG)含量之比例，導致脂質過氧化作用提升，並使得過氧化氫的濃度提高，進而造成氧化逆境 (Riganti et al., 2006)。Riganti 等人 (2008)發現在氧化逆境下，apocynin 處理會誘導神經膠細胞中一氧化氮的生成。而關於 apocynin 對植物影響之研究還非常少，apocynin 可以誘導玉米 (Zea mays)葉片一氧化氮的生 成，使得玉米植株可以抵抗非生物性的氧化逆境 (Tossi et al., 2009)

本論文之研究方向

本論文主要探討水稻黃化幼苗側根與根毛形成過程中，生長素、一氧化氮與 HO 的作用，以及鈣離子所扮演的角色，並進一步探討生長素、一氧化氮與 HO 之間的關係；同時也探討apocynin 對水稻黃化幼苗側根形成之影響。

(23)

10

材料方法

材料種植

本論文以秈稻 (indica-type)台中在來一號 (Oryza sativa L. cv. Taichung Native 1)的種子做為材料，用 3% sodium hypochlorite 消毒十五分鐘後，以清水洗淨數次，

平鋪於墊有濾紙 (直徑二十公分)的培養皿當中，加入蒸餾水保持濕潤，置於 37℃

黑暗的生長箱中催芽二十四小時，後挑選露白均一之種子移到 27℃黑暗的生長箱中生長兩天。

處理

以兩天大生長情況一致的水稻黃化幼苗進行處理，取五株黃化幼苗置於鋪有濾紙 (直徑九公分)含有十毫升處理液 [蒸餾水、sodium nitroprusside (SNP)、

indole-2-butyric acid (IBA)、hemin (Hm)、biliverdin IXα (BV)、apocynin、hydrogen peroxide (H2O2)、100 μM 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl- 3-oxide (cPTIO)、1 mM sodium tungstate (Tu)、1 mM N^G-nitro-L-agrinine methyl ester hydrochloride (L-NAME)、0.14 g L^-1 hemoglobin (Hb)、1 μM diphenylene iodonium (DPI)、200 μM potassium nitrite (KNO2)或 200 μM potassium ferricyanide (K4Fe(CN)6)]的培養皿中，一個培養皿為一重複，每個處理四重複，放至 27℃黑暗的生長箱中，分別於各試驗所需的處理時間後，收取黃化幼苗進行分析。

而 HO 抑制劑與鈣離子螯合物、鈣離子通道阻礙劑及 calmodulin 拮抗劑則必須進行前處理。同樣選取兩天大生長情況一致的水稻黃化幼苗，置於鋪有濾紙 (直徑九公分)含有十毫升處理液 [蒸餾水、200 μM zinc protoporphyrin IX (ZnPPIX)、

100 μM ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)、100 μM 1,2-bis(ο-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (BAPTA) 、 100 μM

(24)

11

1,2-bis(ο-Aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid tetra(acetoxymethyl) ester (BAPTA/AM)、500 μM lanthanum chloride (LaCl3)、50 μM ruthenium red (RR)、100 μM verapamil、50 μM neomycin sulfate (NEO)、5 mM lithium chloride (LiCl)、100 μM chlorpromazine hydrochloride (CPZ)或 100 μM trifluoperazine dihydrochloride (TFP)]

的培養皿中，放在 27℃黑暗的生長箱中前處理三個小時後，再將黃化幼苗移至分別含有蒸餾水、500 μM SNP、1 μM IBA 或 10 μM Hm 的培養皿中進行處理，放至 27℃黑暗的生長箱中，分別於各試驗所需的處理時間後，收取黃化幼苗進行分析。

側根形成

水稻黃化幼苗處理三天之後，觀察其種子根上側根形成之狀況，計算一公釐以上之側根數量並且拍照。

根毛形成

水稻黃化幼苗處理二十四小時之後，取距離種子基部一公分到兩公分之間之種子根，以切片機 (D.S.K Microslicer DTK-1000)將其縱切，厚度為 40 micron，以螢光顯微鏡 (Nikon ECLIPSE 50i)觀察根毛之數量，並計算。有些試驗，則於處理三天後，以電子解剖顯微鏡 (Nikon SMZ1500)觀察種子根上根毛之形成狀況，並且拍照。

一氧化氮螢光影像偵測

一氧化氮螢光之測定主要根據 Xiong 等人 (2009)之方法修改而成。處理後之水稻黃化幼苗，切下種子根，將其完整浸在 20 μM 之一氧化氮螢光探針 4-amino-5-methylamino-2’,7’-difluorofluorescein diacetate [DAF-FM DA ，溶於 dimethyl sulfoxide (DMSO，0.0025% (v/v))，以 20 mM HEPES buffer (pH 7.5)稀釋之]

中，遮光靜置於室溫下十五分鐘，再浸泡在20 mM HEPES buffer (pH 7.5，新鮮配

(25)

12

置)中十五分鐘，以去除種子根表面之螢光探針，即可以螢光電子解剖顯微鏡 (Nikon SMZ1500)觀察其根尖之一氧化氮螢光 (激發波長與發散波長分別為 495 nm 與 515 nm)。取距離種子根基部約一公分之根的片段，以切片機 (D.S.K Microslicer DTK-1000)將其縱切或橫切，厚度皆為 40 micron，以螢光顯微鏡 (Nikon ECLIPSE 50i)觀察種子根切面上之一氧化氮螢光分布情形 (激發波長與發散波長分別為495 nm 與 515 nm)。縱切之切片主要觀察一氧化氮螢光分布與側根形成的關係，而橫切之切片則主要觀察一氧化氮螢光分布與根毛形成的關係。

過氧化氫螢光影像偵測

過氧化氫螢光之測定主要根據Shin 與 Schachtman (2004)之方法。處理後之水稻黃化幼苗，切下種子根，將其完整浸在 50 μM 之過氧化氫螢光探針 5-(and-6)-chloromethyl-2’,7’-dichlorodihydro-fluorescein diacetate [CM-H2DCF DA，

溶於dimethyl sulfoxide (DMSO，0.0025% (v/v))]中，靜置於 37℃生長箱中三十分鐘，再以蒸餾水清洗種子根數次，以去除表面之螢光探針，即可以螢光電子解剖顯微鏡 (Nikon SMZ1500)觀察其過氧化氫螢光 (激發波長與發散波長分別為 495 nm 與 515 nm)。取距離種子根基部約一公分之根的片段，以切片機 (D.S.K Microslicer DTK-1000)將其縱切，厚度為 40 micron，以螢光顯微鏡 (Nikon ECLIPSE 50i)觀察種子根切面上之過氧化氫螢光分布情形與側根形成的關係(激發波長與發散波長分別為495 nm 與 515 nm)。

HO 活性分析

Heme oxygenase (HO)活性分析主要根據 Liu 等人 (2007)之方法修改而成。取二十五條水稻黃化幼苗的根，加入新鮮配置的3 mL HEPES-Tris [25 mM (pH 7.4)，

內含250 mM mannitol、1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)、1% (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP)、10% (v/v) glycerol 及 1 mM dithiothreitol (DTT)]，在冰

(26)

13

浴中研磨至均質後，以15000 g 於 4℃下離心三十分鐘。取 250 μL 上清液，加入 2 mM desferrioxamine (DFO，以 100 mM HEPES-NaOH (pH 7.2)稀釋之)、10 μM Hm、

0.15 mg mL^-1 bovine serum albumin (BSA)、50 μg mL^-1 (4.2 μM) spinach ferredoxin (Fd)、0.025 units mL^-1 spinach ferredoxin-NADP⁺ reductase (FNR)、5 mM ascorbic acid (AsA)，最後加入 100 μM NADPH (新鮮配置)開始反應，總反應體積為 1 mL，置於 37℃下三十分鐘。以分光光度計測量波長 650 nm 的吸光值，並以消光係數 6.25 mM^-1cm^-1估算BV 的濃度，每單位 (unit) HO 活性定義為每三十分鐘生成 1 μmol BV 所需的酵素量。由於根中蛋白質含量很低，因此 HO 活性以乾重為基準來表示，

HO 活性 (units g^-1 DW)為 A650 ÷ 6.25 (消光係數，mM^-1cm^-1) × 1 (反應體積) × 12 (稀釋倍率) ÷ 乾重 (g)。

根細胞活力測定

為試驗本論文中所使用之抑制劑是否會影響根細胞活力，我們於抑制劑處理根後三小時，以Evans blue 處理測定其細胞活力，測定方法主要根據 Baker 與 Mock (1994)之方法修改而成。將水稻黃化幼苗浸於 Evans blue (0.25%，w/v)中十五分鐘，

再移到蒸餾水中浸泡十五分鐘兩次，以進行退染，而後在室溫下靜置於蒸餾水中隔夜。取十條幼苗的根，切取根尖2 cm 的部分，加入 3 mL 1% (w/v) sodium dodecyl sulphate [SDS，溶於 50% (v/v) methanol 中]研磨至均勻，放至 50℃水浴加熱一個小時後，在室溫下以13000 g 離心十分鐘，取上清液以分光光度計測量波長 595 nm 的吸光值，即可代表細胞之活力，吸光值愈高則表示細胞活力越低。

統計分析

本論文每一個試驗處理皆為四重複，結果以平均值加上標準差 (standard error, SE)表示。統計分析則以 SAS (statistical analysis system) 9.0 版本進行，採 Duncan’s multiple range test，比較不同處理之間之差異，P<0.05 則視為處理間有顯著差異。

(27)

14

結果

（一） SNP、IBA 與 Hm 對水稻黃化幼苗根之側根與根毛形成之影響

以不同濃度之 SNP、IBA 或 Hm 處理在黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗，三天後分別觀察其種子根上側根與根毛形成之情形，試驗結果顯示SNP (1-500 μM)、

IBA (0.1-10 μM)與 Hm (5-50 μM)皆可誘導水稻黃化幼苗側根 (圖 1)與根毛 (圖 2、

3、4)之形成。SNP、IBA 與 Hm 分別於處理濃度為 500、1 與 10 μM 時，誘導側根 與根毛形成效果最佳，故後續之試驗即以此為處理濃度。

進一步量化 SNP、IBA 或 Hm 對水稻黃化幼苗側根與根毛形成之影響，分別以500 μM SNP、1 μM IBA 或 10 μM Hm 處理兩天大之水稻黃化幼苗，在處理後一、

二、三天計算側根形成之數量，及在處理一天後計算根毛形成之數量。試驗結果顯示 SNP、IBA 或 Hm 處理三天後之水稻黃化幼苗，其側根之形成數量有顯著的提升 (圖 5)，而處理一天即可觀察到根毛數量皆明顯比水處理多 (圖 6)，圖 6a 也顯示SNP、IBA 或 Hm 處理可增加根毛之長度。

(28)

15

圖1. 不同濃度 SNP (a)、IBA (b)與 Hm (c)對水稻黃化幼苗側根形成之影響。以黑 暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，處理不同濃度之 SNP (1、10、100、500 μM)、IBA (0.1、0.5、1、5、10 μM)或 Hm (5、10、25、50 μM)，三天後進行觀察並拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 cm。

(29)

16

圖2. 不同濃度 SNP 對水稻黃化幼苗根毛形成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻 黃化幼苗為材料，處理不同濃度之SNP (1、10、100、500 μM)，三天後進行觀察，

並取距種子根基部約一公分之根進行拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 mm。

(30)

17

圖3. 不同濃度 IBA 對水稻黃化幼苗根毛形成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻 黃化幼苗為材料，處理不同濃度之IBA (0.5、1、5、10 μM)，三天後進行觀察，

(31)

18

圖 4. 不同濃度 Hm 對水稻黃化幼苗根毛形成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻 黃化幼苗為材料，處理不同濃度之Hm (5、10、25、50 μM)，三天後進行觀察，

(32)

19

圖5. SNP、IBA 與 Hm 對水稻黃化幼苗側根數量之影響。以黑暗下生長兩天之水 稻黃化幼苗為材料，分別處理水、500 μM SNP、1 μM IBA 或 10 μM Hm，於處理後一、二、三天計算其種子根上之側根數量。每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

(33)

20

圖6. SNP、IBA 與 Hm 對水稻黃化幼苗根毛數量之影響。以黑暗下生長兩天之水 稻黃化幼苗為材料，分別處理水、500 μM SNP、1 μM IBA 或 10 μM Hm，24 小時後進行切片後拍照 (a)，計算根毛數量 (b)。每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。Bar= 1 μm。

(34)

21

（二） SNP 與 IBA 誘導水稻黃化幼苗根側根與根毛之形成需要一氧化氮的參與，而 Hm 則不需要

為了瞭解 SNP、IBA 與 Hm 誘導水稻黃化幼苗側根及根毛之形成是否是經由一氧化氮的作用，水稻黃化幼苗以一氧化氮之清除劑cPTIO (100 μM)與 SNP、IBA 或Hm 共同處理三天。試驗結果顯示 SNP 與 IBA 所誘導之側根 (圖 7、圖 9a)與根 毛 (圖 8)的形成皆因為 cPTIO 處理受到明顯的抑制，說明 SNP 與 IBA 的作用是經由一氧化氮所引起，而Hm 所誘導之側根 (圖 7、圖 9b)與根毛 (圖 8)的形成則不 受cPTIO 處理所抑制。由於 SNP 分子結構的關係，處理 SNP 後同時會釋放出一氧化氮、nitrate 與 ferricyanide，為了進一步確認 SNP 誘導水稻黃化幼苗側根及根毛之形成是經由一氧化氮的作用而非 nitrate 與 ferricyanide，將水稻黃化幼苗以 100 μM KNO2與100 μM K4Fe(CN)6處理，結果顯示KNO2與K4Fe(CN)6並不能誘導側根 (圖 7)與根毛 (圖 8)之形成。本論文也以螢光探針 DAF-FM DA 偵測水稻黃化幼苗根中之一氧化氮。如圖11 所示，Hm、KNO2與K4Fe(CN)6並不能誘導一氧化氮之生成 (圖 11a)，而 SNP (圖 11a)與 IBA (圖 11b)則明顯的誘導之，且受 cPTIO 處理而抑制 (圖 11)。

為了瞭解 IBA 誘導水稻黃化幼苗側根及根毛之形成與一氧化氮合成間之關係，

以NOS 抑制劑 L-NAME (1 mM)與 NR 抑制劑 Tu (1 mM)與 IBA 共同處理三天。結果顯示 NR 抑制劑 Tu 可以完全抑制 IBA 所誘導之側根 (圖 7、圖 10)、根毛 (圖 8) 的形成與一氧化氮之螢光 (圖 11b)，而 NOS 抑制劑 L-NAME 則沒有抑制的作 用(圖 7、圖 8、圖 10、圖 11b)。為更進一步確認 IBA 與 SNP 誘導之一氧化氮生成與側根及根毛形成之關係，水稻黃化幼苗以SNP 與 IBA 處理後 24 小時及 42 小時，

分別取種子根以螢光探針 DAF-FM DA 處理後進行縱切及橫切，發現一氧化氮之螢光分布於側根根原基 (圖 12)與根的表皮 (圖 13)，即為側根與根毛形成之部位。

(35)

22

圖 7. cPTIO 對 SNP、IBA 或 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗側根形成之影響，與 L-NAME 及 Tu 對 IBA 所誘導之水稻黃化幼苗側根形成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別處理水、100 μM KNO2、100 μM K4Fe(CN)6、 cPTIO、SNP、SNP + cPTIO、Hm、Hm + cPTIO、IBA、IBA + cPTIO、IBA + L-NAME 或IBA + Tu，cPTIO、SNP、IBA、Hm、L-NAME 與 Tu 之濃度分別為 100 μM、

500 μM、1 μM、1 mM 與 1 mM，於處理後三天進行觀察並拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 cm。

(36)

23

圖 8. cPTIO 對 SNP、IBA 或 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗根毛形成之影響，與 L-NAME 及 Tu 對 IBA 所誘導之水稻黃化幼苗根毛形成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別處理水、100 μM KNO2、100 μM K4Fe(CN)6、 cPTIO、SNP、SNP + cPTIO、Hm、Hm + cPTIO、IBA、IBA + cPTIO、IBA + L-NAME 或IBA + Tu，cPTIO、SNP、IBA、Hm、L-NAME 與 Tu 之濃度分別為 100 μM、

500 μM、1 μM、1 mM 與 1 mM，於處理後三天進行觀察，並取距種子根基部約一公分之根進行拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 mm。

(37)

24

圖9. cPTIO 對 SNP、IBA (a)或 Hm (b)所誘導之水稻黃化幼苗側根數量之影響。

以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別處理水、cPTIO、SNP、SNP + cPTIO、Hm、Hm + cPTIO、IBA、IBA + cPTIO，cPTIO、SNP、IBA 與 Hm 之濃度分別為100 μM、500 μM 與 1 μM，於處理後三天計算其種子根上之側根數量。

每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

a

b

(38)

25

圖10. L-NAME 與 Tu 對 IBA 所誘導之水稻黃化幼苗側根數量之影響。以黑暗下 生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別處理水、L-NAME、Tu、IBA、IBA + L-NAME 與 IBA + Tu，L-NAME、Tu 與 IBA 之濃度分別為 1 mM、1 mM 與 1 μM，

於處理後三天計算其種子根上之側根數量。每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

(39)

26

圖11. cPTIO 對 SNP、IBA 或 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗中一氧化氮生成之影響，

及L-NAME 及 Tu 對 IBA 所誘導之水稻黃化幼苗中一氧化氮生成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，(a) 處理水、100 μM KNO2、100 μM K4Fe(CN)6、cPTIO、SNP、SNP + cPTIO、Hm、Hm + cPTIO 6 小時，(b) 處理水、

cPTIO、IBA、IBA + cPTIO、IBA + L-NAME 或 IBA + Tu 24 小時，cPTIO、SNP、

IBA、Hm、L-NAME 與 Tu 之濃度分別為 100 μM、500 μM、1 μM、1 mM 與 1 mM，

於處理後取根尖一公分以20 μM DAF-FM DA 染色後觀察並拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 mm。

(40)

27

圖12. SNP 與 IBA 所誘導之一氧化氮生成於水稻黃化幼苗種子根中之分布與側根 形成部位之關係。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，處理水、500 μM SNP 與1 μM IBA 42 小時後，取距種子根基部一公分之根以 20 μM DAF-FM DA 染色後進行縱切並拍照。白色箭頭所指為側根根原基。每試驗處理四重複。Bar= 0.2 mm。

(41)

28

圖13. SNP 與 IBA 所誘導之一氧化氮生成於水稻黃化幼苗種子根中之分布與根毛 形成部位之關係。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，處理水、500 μM SNP 與1 μM IBA 24 小時後，取距種子根基部一公分之根以 20 μM DAF-FM DA 染色後進行橫切並拍照。每試驗處理四重複。Bar= 0.5 mm。

(42)

29

（三） SNP 與 IBA 誘導水稻黃化幼苗根側根與根毛之形成與 Ca²⁺之關係

為了瞭解Ca²⁺是否參與在SNP 與 IBA 誘導水稻黃化幼苗側根及根毛形成之途徑中，水稻黃化幼苗以 Ca²⁺螯合物 100 μM EGTA 、 100 μM BAPTA (membrane-permeable)或 100 μM BAPTA/AM (membrane-impermeable)前處理三小時後，分別移至水、SNP 與 IBA 處理三天後進行觀察。結果顯示，這三個 Ca²⁺螯合物皆可明顯抑制SNP 與 IBA 所誘導之側根 (圖 14a)與根毛 (圖 15)的形成，這說 明細胞間與細胞質中之Ca²⁺參與在SNP 與 IBA 誘導水稻黃化幼苗側根及根毛形成之途徑中。水稻黃化幼苗以Ca²⁺通道阻礙劑500 μM LaCl3、100 μM verapamil 與 50 μM RR 前處理三小時後，後分別移至水、SNP 與 IBA 處理三天後進行觀察。結果顯示，這三個Ca²⁺通道阻礙劑皆可明顯抑制SNP 與 IBA 所誘導之側根 (圖 14a) 與根毛 (圖 15)的形成。

Ca²⁺由液胞與胞器釋放到細胞質中之過程需要inositol triphosphate (IP3)，水稻黃化幼苗以IP3合成抑制劑50 μM NEO (抑制 phospholipase C)與 5 mM LiCl (抑制 IP3循環) 前處理三小時後，後分別移至水、SNP 與 IBA 處理三天後進行觀察。結果顯示NEO 與 LiCl 皆可明顯抑制 SNP 與 IBA 所誘導之側根 (圖 14b)與根毛 (圖 15)的形成。而以 CaM 拮抗劑 100 μM CPZ 與 100 μM TFP 前處理三小時之水稻黃 化幼苗，後分別移至水、SNP 與 IBA 處理三天後進行觀察。結果顯示，CPZ 與 TFP 同樣可以明顯抑制SNP 與 IBA 所誘導之側根 (圖 14b)與根毛 (圖 15)的形成。

為了確定Ca²⁺與SNP 及 IBA 誘導之一氧化氮生成的關係，我們以 BAPTA、

BAPTAAM、RR 與 LiCl 前處理三小時後之水稻黃化幼苗，分別移至水、SNP 與 IBA 處理 24 小時後，取種子根以螢光探針 DAF-FM DA 處理，發現這些抑制劑皆沒有辦法抑制SNP 與 IBA 所誘導之一氧化氮的合成 (圖 16)。

(43)

30

圖14. Ca²⁺螯合物、Ca²⁺通道阻礙劑、IP3與CaM 拮抗劑對 SNP 及 IBA 所誘導之水稻黃化幼苗側根數量之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別前處理(a) 100 μM BAPTA、100 μM EGTA、100 μM BAPTA/AM、50 μM RR、500 μM LaCl3、100 μM verapamil、 (b) 50 μM NEO、5 mM LiCl、100 μM CPZ 或 100 μM TFP 三小時後，移至水、500 μM SNP 或 1 μM IBA 處理三天，計算其種子根上之側根數量。每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

(44)

31

圖15. Ca²⁺螯合物、Ca²⁺通道阻礙劑、IP3與CaM 拮抗劑對 SNP 及 IBA 所誘導之水稻黃化幼苗根毛形成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別前處理100 μM BAPTA、100 μM EGTA、100 μM BAPTA/AM、50 μM RR、500 μM LaCl3、100 μM verapamil、50 μM NEO、5 mM LiCl、100 μM CPZ 或 100 μM TFP 三小時後，移至水、500 μM SNP 或 1 μM IBA 處理三天後進行觀察，並取距種子根基部約一公分之根進行拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 mm。

(45)

32

圖16. Ca²⁺螯合物與Ca²⁺通道阻礙劑對SNP 及 IBA 所誘導之水稻黃化幼苗一氧化氮合成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別前處理 100 μM BAPTA、100 μM BAPTA/AM、50 μM RR 與 5 mM LiCl 三小時後，移至水、500 μM SNP 或 1 μM IBA 處理 24 小時後進行觀察，並取根尖一公分之根進行拍照。

每試驗處理四重複。Bar= 1 mm。

(46)

33

（四）一氧化氮清除劑、一氧化氮合成抑制劑、Ca²⁺螯合物、Ca²⁺通道阻礙劑、IP₃合成抑制劑與 CaM 拮抗劑對根細胞活力之影響

為了檢驗本論文之試驗所使用之抑制劑是否會對水稻黃化幼苗根造成毒害作用，進而影響試驗之結果，故以Evans blue 染色法測試其對根細胞活力之影響。本研究室過去發表之數據顯示氯化鎘 (CdCl2)會導致水稻根細胞死亡，而本論文之試驗結果也發現水稻黃化幼苗根處理0.1 mM CdCl2六小時後 (表 1)，A595明顯的提升，顯示本文所使用之方法可以有效的測定根細胞活力。如表 1 所示，一氧化氮 清除劑 (cPTIO)、一氧化氮合成抑制劑 (Tu、LNAME)、Ca²⁺螯合物 (EGTA、BAPTA、

BAPTA/AM)、Ca²⁺通道阻礙劑 (LaCl3、verapamil、RR)、IP3合成抑制劑 (NEO、

LiCl)與 CaM 拮抗劑 (CPZ、TFP)皆不影響根細胞之活力。

(47)

34

表 1. 氯化鎘、一氧化氮清除劑、一氧化氮合成抑制劑、Ca²⁺螯合物、Ca²⁺通道阻礙劑、IP3合成抑制劑與CaM 拮抗劑對水稻黃化幼苗根細胞活力之影響。

細胞活力測定方法主要根據Baker 與 Mock (1994)之方法修改而成，以 Evans blue 處理後測波長595 nm 的吸光值，即可代表細胞之活力，吸光值愈高則表示細胞活力越低。試驗一：兩天大之水稻黃化幼苗處理水或CdCl2六小時；試驗二：兩天大之水稻黃化幼苗處理水、100 μM cPTIO、1 mM Tu、1mM L-NAME、100 μM BAPTA、

100 μM EGTA、100 μM BAPTA/AM、50 μM RR、500 μM LaCl³、100 μM verapamil、

50 μM NEO、5 mM LiCl、100 μM CPZ 或 100 μM TFP 三小時。結果為平均值加減標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

Expt. Treatment Root Cell Viability (A595) I H2O 0.013 ± 0.0030^a

CdCl2 0.022 ± 0.0016^b

II H2O 0.012 ± 0.0026âb c-PTIO 0.010 ± 0.0011^b Tu 0.012 ± 0.0034âb L-NAME 0.012 ± 0.0021âb BAPTA 0.011 ± 0.0029âb EGTA 0.010 ± 0.0015âb BAPTA/AM 0.013 ± 0.0011â

RR 0.013 ± 0.0018^a LaCl3 0.011 ± 0.0011^ab

Verapamil 0.011 ± 0.0016âb NEO 0.011 ± 0.0023âb LiCl 0.010 ± 0.0020^b CPZ 0.010 ± 0.0013^b TFP 0.011 ± 0.0017âb

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（五） SNP、IBA 與 Hm 對 heme oxygenase 活性之影響

在動物中 Hm 可以活化 HO 之活性進而增加一氧化碳的合成，因此被認為是一氧化碳的donor。在本論文之試驗中，同樣發現 Hm 可以增加水稻黃化幼苗根中 HO 之活性 (圖 17)，結果顯示在 Hm 處理一天之後，HO 之活性即有明顯的提升，

而隨著處理時間的增加HO 之活性也隨之變高。為了瞭解 SNP 與 IBA 是否會影響 HO 之活性，我們將兩天大之水稻黃化幼苗處理 SNP 與 IBA，於處理一、二、三天之後分別測其HO 之活性，結果發現在水稻黃化幼苗根中，SNP 與 IBA 處理同樣在一天後即可明顯使得HO 之活性增高 (圖 18)。

（六） ZnPPIX 與 hemoglobin 對 SNP、IBA 與 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗側根與根毛之形成與 heme oxygenase 活性增加之影響

前人研究指出ZnPPIX 可以抑制植物中 HO 之活性 (Liu et al., 2007; Xuan et al., 2008)。本論文之試驗結果也發現，前處理 200 μM ZnPPIX 可以有效抑制 SNP、IBA 與Hm 所引起的 HO 活性的增加 (圖 19)，同時 SNP、IBA 與 Hm 所誘導之水稻黃 化幼苗側根與根毛的形成也受到ZnPPIX 的作用而顯著的被抑制 (圖 20、圖 21)。

Hb 長期被用來作為一氧化氮與一氧化碳的清除劑，前處理 0.14 g L^-1 Hb 也可有效抑制SNP、IBA 與 Hm 所引起的 HO 活性的增加 (圖 22)，同時 SNP、IBA 與 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗側根與根毛的形成也受到Hb 的作用而完全的被抑制 (圖 23、

圖24)。

（七） Biliverdin IXα 對水稻黃化幼苗側根與根毛之形成與 heme oxygenase 活性之影響

BV 為 HO 所催化反應之產物之一，為了瞭解 BV 對於水稻黃化幼苗側根與根毛形成之影響，將其處理不同濃度之BV (10、20、30 與 40 μM)三天後，發現 BV 可以有效促進水稻側根與根毛之形成 (圖 25、圖 26)與提升 HO 活性 (圖 27)。

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圖17. Hm 對 HO 活性之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別 處理水或10 μM Hm，於處理後一、二、三天分別分析其種子根之 HO 活性。每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

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圖18. SNP 與 IBA 對 HO 活性之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，

分別處理水、500 μM SNP 或 1 μM IBA，於處理後一、二、三天分別分析其種子根之HO 活性。每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

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圖19. ZnPPIX 對 SNP、IBA 與 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗根 HO 活性之影響。

以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別前處理水與200 μM ZnPPIX 三小時後，移至水、500 μM SNP、1 μM IBA 或 10 μM Hm 處理一天，分析其種子根之HO 活性。每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

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圖20. ZnPPIX 對 SNP、IBA 與 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗側根形成數量之影響。

以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別前處理水與200 μM ZnPPIX 三小時後，移至水、500 μM SNP、1 μM IBA 或 10 μM Hm 處理三天，計算其種子根上之側根數量。每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

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圖21. ZnPPIX 對 SNP、IBA 與 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗根毛形成之影響。以 黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別前處理水與200 μM ZnPPIX 三小時後，移至水、500 μM SNP、1 μM IBA 或 10 μM Hm 處理三天後進行觀察，並取距種子根基部約一公分之根進行拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 mm。

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圖22. Hb 對 SNP、IBA 與 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗根 HO 活性之影響。以黑暗 下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，處理水、SNP、IBA、Hm、Hb、SNP + Hb、

IBA + Hb、Hm + Hb 一天後，分析其種子根之 HO 活性，SNP、IBA、Hm 與 Hb 之濃度分別為500 μM、1 μM、10 μM 與 0.14 g L^-1。每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

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圖23. Hb 對 SNP、IBA 與 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗側根形成數量之影響。以 黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，處理水、SNP、IBA、Hm、Hb、SNP + Hb、IBA + Hb、Hm + Hb 三天後，計算其種子根上之側根數量，SNP、IBA、Hm 與Hb 之濃度分別為 500 μM、1 μM、10 μM 與 0.14 g L^-1。每試驗處理四重複，

垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

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圖24. Hb 對 SNP、IBA 與 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗根毛形成之影響。以黑暗 下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，處理水、SNP、IBA、Hm、Hb、SNP + Hb、

IBA + Hb、Hm + Hb 三天後進行觀察，並取距種子根基部約一公分之根進行拍照，SNP、IBA、Hm 與 Hb 之濃度分別為 500 μM、1 μM、10 μM 與 0.14 g L^-1。每試驗處理四重複。Bar= 1 mm。

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圖25. BV 對水稻黃化幼苗側根形成數量之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化 幼苗為材料，分別處理水或不同濃度之BV (10、20、30 或 40 μM)三天，計算其種子根上之側根數量。每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

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圖26. BV 對水稻黃化幼苗根毛形成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗 為材料，分別處理水或不同濃度之BV (10、20、30 或 40 μM)三天後進行觀察，

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圖27. BV 對 HO 活性之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別 處理水及不同濃度之BV (10、20、30 或 40 μM)，於處理後一天分析其種子根之 HO 活性。每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

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（八） Apocynin 對水稻黃化幼苗側根形成之影響

以不同濃度之apocynin (1、5、10、20、30 μM)處理在黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗，三天後觀察其種子根上側根形成之情形。試驗結果顯示 apocynin 可誘導水稻黃化幼苗側根 (圖 28)之形成，且於處理濃度為 10 μM 時，誘導側根形成情形最佳，故後續之試驗便以此為處理濃度。

（九） Apocynin 誘導水稻黃化幼苗側根之形成是經由 H2O2而非一氧化氮

以螢光探針DAF-FM DA 與 CM-H2DCFDA 分別偵測水稻黃化幼苗根中之一氧化氮與H2O2。如圖29 所示，apocynin 處理水稻黃化幼苗後，其種子根無法偵測到 一氧化氮之螢光 (圖 29a)，而可以偵測到 H2O2螢光的生成 (圖 29b)，處理 DPI 之後也可以明顯抑制apocynin 所誘導之 H2O2螢光的生成 (圖 29b)，然而處理 cPTIO 對apocynin 所誘導之 H2O2螢光的生成則沒有影響 (圖 29b)。

為了瞭解apocynin 與水稻黃化幼苗側根形成與一氧化氮及 H2O2間之關係，將水稻黃化幼苗前處理100 μM cPTIO 或 1 μM DPI 三小時後，試驗結果發現 DPI 可以有效抑制apocynin 所誘導之側根形成數量，而 cPTIO 則沒有作用 (圖 30)，顯示 apocynin 誘導側根形成之過程中需要 H2O2之參與而非一氧化氮。

為確認H2O2與水稻黃化幼苗側根形成之關係，故將水稻黃化幼苗以不同濃度之H2O2 (1、2.5、5、7.5 μM)處理，三天後觀察其種子根上側根形成之情形。結果顯示H2O2可誘導水稻黃化幼苗側根 (圖 31)之形成，且於處理濃度為 1 μM 時，誘導側根形成情形最佳，故後續之試驗便以此為處理濃度。更進一步想確認apocynin 誘導之H2O2生成與側根形成之關係，水稻黃化幼苗以 apocynin 處理後 42 小時，

取種子根以螢光探針CM-H2DCFDA 處理後進行縱切，結果發現 H2O2之螢光分布於側根根原基，即為側根形成之部位 (圖 32)。

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圖28. 不同濃度 apocynin 對水稻黃化幼苗側根形成之影響。以黑暗下生長兩天之 水稻黃化幼苗為材料，處理不同濃度之apocynin (1、5、10、20、30 μM)，三天後進行觀察並拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 cm。

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圖29. cPTIO 與 DPI 對 apocynin 處理後水稻黃化幼苗中一氧化氮 (a)與 H2O2 (b) 之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，處理水、apocynin、cPTIO、

apocynin + cPTIO、DPI、apocynin + DPI 24 小時，apocynin、cPTIO 與 DPI 之濃度分別為10 μM、100 μM 與 1 μM，於處理後取根尖一公分以 20 μM DAF-FM DA 或50 μM CM-H2DCFDA 染色後觀察並拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 mm。

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圖30. cPTIO 與 DPI 對 apocynin 所誘導之水稻黃化幼苗側根數量之影響。以黑暗 下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別處理水、apocynin、cPTIO、apocynin + cPTIO、DPI、apocynin + DPI，apocynin、cPTIO 與 DPI 之濃度分別為 10 μM、100 μM 與 1 μM，於處理三天後計算其種子根上之側根數量。每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。

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圖 31. 不同濃度 H2O2對水稻黃化幼苗側根形成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，處理不同濃度之H2O2 (1、2.5、5、7.5 μM)，三天後進行觀察並拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 cm。

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圖32. Apocynin 所誘導之 H2O2生成於水稻黃化幼苗種子根中之分布與側根形成部位之關係。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，處理水、1 μM H2O2與 10 μM apocynin 42 小時後，取距種子根基部一公分之根以 50 μM CM-H2DCFDA 染色後進行縱切並拍照。白色箭頭所指為側根根原基。每試驗處理四重複。Bar=

0.2 mm。