【11】證書號數：I328117 【45】公告日： 中華民國 99 (2010) 年 08 月 01 日 【51】Int. Cl.： G01N33/68 (2006.01) 發明 全 7 頁 【54】名 稱：廣泛型蛋白質質譜分析試劑組及使用該試劑組之蛋白質定性及定量方法 【21】申請案號：092126189 【22】申請日： 中華民國 92 (2003) 年 09 月 23 日 【11】公開編號：200512459 【43】公開日期： 中華民國 94 (2005) 年 04 月 01 日 【72】發 明 人： 陳淑慧 (TW) CHEN, SHU HUI；徐睿良 (TW) ；黃聖聿 (TW)
【71】申 請 人： 國立成功大學 NATIONAL CHENG KUNG
UNIVERSITY 臺南市東區大學路 1 號 【74】代 理 人： 郭雨嵐；林發立 [57]申請專利範圍 1. 一種用於蛋白質鑑定及定量之廣泛型蛋白質質譜分析試劑組，其係包含以下組成：一甲 醛；及一還原劑，其係為硼氰氫化鈉；其中前述甲醛係以氫及氘(1 H 及2 D)進行修飾。 2. 一種偵測蛋白質相對表現量之方法，包含以下步驟：a)提供欲比較之兩樣品；b)將前述 兩樣品利用酵素水解；c)分別將兩樣品利用以氫/氘(1 H/2 D)同位素修飾之甲醛進行標 示；d)混合前述標示完成之兩樣品；及 e)利用質譜技術分析兩樣品，其係利用質譜技術 配合資料庫比對進行蛋白質鑑定及相對表現量之分析。 3. 如申請專利範圍第 2 項之方法，其中前述兩樣品係為一種或一種以上之蛋白質。 4. 如申請專利範圍第 2 項之方法，其中前述步驟 a)之前係可進一步增加一層析步驟純化蛋 白質。 5. 如申請專利範圍第 4 項之方法，其中前述層析步驟係利用免疫層析法純化特定蛋白質或 利用強陰離子交換層析將蛋白質混合物分部收集。 6. 如申請專利範圍第 2 項之方法，其中前述步驟 d)與步驟 e)之間係可進一步增加一層析步 驟進行胜肽分離純化。 7. 如申請專利範圍第 6 項之方法，其中前述層析步驟係選自以下群組之方法：逆向液相層 析、強陽離子交換層析及凝膠管柱層析。 8. 一種蛋白質重新定序之方法，包含以下步驟： a)提供一樣品；b)將前述樣品利用酵素水 解；c)分別將部分樣品利用以氫/氘(1 H/2 D)同位素修飾之甲醛進行標示；d)混合未標示 與標示完成之樣品；及 e)利用質譜技術分析樣品，其係利用串聯質譜訊號進行胜肽片段 之胺基酸直接重新定序。 9. 如申請專利範圍第 8 項之方法，其中前述樣品係為一種或一種以上之蛋白質。 10. 如申請專利範圍第 8 項之方法，其中前述步驟 a)之前係可進一步增加一層析步驟純化蛋 白質。 11. 如申請專利範圍第 10 項之方法，其中前述層析步驟係利用免疫層析法純化特定蛋白質或 利用強陰離子交換層析將蛋白質混合物分部收集。 12. 如申請專利範圍第 8 項之方法，其中前述步驟 d)與步驟 e)之間係可進一步增加一層析步 驟進行胜肽分離純化。 1611
-13. 如申請專利範圍第 12 項之方法，其中前述層析步驟係選自以下群組之方法：逆向液相層 析、強陽離子交換層析及凝膠管柱層析。 14. 一種分析磷酸化蛋白質之方法，包含以下步驟：a)提供欲比較之兩樣品；b)將前述兩樣品 利用酵素水解；c)分別將兩樣品利用以氫/氘(1 H/2 D)同位素修飾之甲醛進行標示；d)混 合前述標示完成之兩樣品；e)利用固著金屬離子交換層析進行磷酸化胜肽之分離純化； 及 f)利用質譜技術進行分析，其係利用質譜技術配合資料庫比對進行磷酸化蛋白質之鑑 定分析及磷酸化相對程度之定量分析。 15. 如申請專利範圍第 14 項之方法，其中前述兩樣品係為一種或一種以上之蛋白質。 16. 如申請專利範圍第 14 項之方法，其中前述步驟 a)之前係可進一步增加一層析步驟純化蛋 白質。 17. 如申請專利範圍第 16 項之方法，其中前述層析步驟係利用免疫層析法純化特定蛋白質或 以強陰離子交換層析將蛋白質混合物分部收集。 圖式簡單說明 第一圖係為此廣泛型蛋白質質譜分析試劑組進行蛋白質定性及定量之流程圖。 第二圖係為胜肽還原胺化反應之示意圖。 第三圖係為標準磷酸化胜肽以廣泛性蛋白質質譜分析試劑組(GAPE)標示之 MALDI 圖， 其中(A)為未經標示，(B)為利用 light-GAPE 標示，(C)為利用 heavy-GAPE 標示。
第四圖係為血紅素消化物以廣泛性蛋白質質譜分析試劑組(GAPE)標示之 MALDI 圖，其 中(A)為未經標示，(B)為利用 light-GAPE 標示，(C)為利用 heavy-GAPE 標示。
第五圖係為等量混和利用 light-GAPE 標示及未標示之血紅素消化物之質譜訊號比較圖。 第六圖係為利用本發明之廣泛性蛋白質質譜分析試劑組(light-GAPE 及 heavy-GAPE)標示 胜肽之滯留時間比較圖。 第七圖係為利用利用本發明之廣泛性蛋白質質譜分析試劑組(light-GAPE 及 heavy-GAPE) 標示磷酸化胜肽(SEQ：AEEEIpYGVLFAKKK)標準品後依不同比例混和之質譜訊號比較圖。 第八圖係為第六圖之結果以混合比例與其質譜訊號之相對強度之線性關係圖。 第九圖係為一個標示端且為三重態(triplet state)之胜肽，其同位素對之質譜展開圖。 第十圖係為利用廣泛型蛋白質質譜定量分析試劑組搭配 IMAC 進行蛋白質磷酸化分析之 MALDI 圖，其中(A)為未純化前，(B)以 IMAC 去除之非磷酸化胜肽，(C)以 IMAC 濃縮之磷 酸化胜肽。
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