1
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
計劃名稱：牡丹皮抑制腫瘤轉移作用之評估
Evaluate the inhibitory effects of Paeonia suffruitcosa on tumor metastasis 計畫編號：NSC 90-2320-B-038-049
執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日 主持人：許秀蘊 台北醫學大學藥學系 共同主持人：李明亭 中央研究院生化所 計畫參與人員：黃倫伶、劉冠論
台北醫學大學藥學研究所研究生
一、中文摘要
具入侵性癌細胞的轉移與一群蛋白裂 解酵素(matrix metalloproteinase；MMPs)有 關，故以高度表現 MMP-2 及 MMP-9 的 A431 為模式，探討牡丹皮(Paeonia suffruticosa Andrews; Ranunculaceae) 對 其 活 性 之 影 響。其水萃取物以溶媒劃分及管柱層析於 各種溶媒系統下沖提；經細胞毒性試驗、
DNA 段片、蛋白裂解酵素的測定。細胞毒 性試驗顯示 Fr 5 於 24 小時之 IC50 為 22.46ìg/ml，DNA 段片及蛋白裂解酵素試 驗均顯示其為活性部分。
關鍵詞：牡丹皮、腫瘤轉移、
蛋白裂解酵素 Abstract
The invasive cancer cell metastasis is related to matrix metalloproteinases (MMPs), the model was based on A431 cancer cell line, high expression on MMP-2 and MMP-9.
Fractionation of an aqueous extract of Paeonia suffruticosa was achieved by solvent partition and column chromatography under various solvent system. All fractions were tested through cell viability, DNA fragmentation and MMPs inhibition. Fraction 5 showed potent inhibitory effect on cell viability ( IC50 = 22.46ìg/ml for 24hrs), also its bioactivities were found by DNA fragmentation and MMPs inhibitory test.
Keywords: Paeonia suffruticosa, tumor metastasis
matrix metalloproteinase 二、緣由與目的
數十年來, 惡性腫瘤位居台灣地區死 亡原因之首位,對國民健康上構成很大之 威脅,在全民健保上也是形成相當大的負 擔。目前整個治療過程以外科手術、放射 線治療、化學療法及激素控制等方式治 療，但終究有 80%的病人出現癌細胞轉移之 現象。癌細胞的轉移為其由原發處經由血 液或淋巴系統任意擴散至其他器官，亦即 具有入侵性，而這種入侵性與一群蛋白裂 解酵素(matrix metalloproteinase)有關，癌細 胞通常會分泌一群不同的蛋白裂解酵素，
以 便 能 穿 透 不 同 的 組 織 及 血 管 障 壁 等 (1~8)。其中以 collagenases IV、MMP-2 及 MMP-9 等高濃度出現於乳癌等多種之癌細 胞 (9) ， 因 此 選 擇 EGF 過 度 表 現 之 A431(epidermoid carcinoma, human) 為 模 型，藉由觀察細胞培養液中 MMP-2 及 MMP-9 之含量，作為測定中藥對於癌細胞 的入侵或轉移是否具有抑制作用之依據。
經文獻考察，中藥牡丹皮廣用於活血化瘀 方面，對於抑制血小板之凝集有很好的效 果(10~11)，及明顯抑制血管增生之作用 (12)，因此採用牡丹皮觀測其對蛋白裂解酵 素之抑制作用，並探討其對抑制癌細胞轉 移之機轉。
三、結果與討論
由中藥牡丹皮之水萃取液、經由 與 乙 酸 乙 酯 劃 分 後 ， 以 逆 相 層 析 管 柱
2
(sephadex LH-20)在乙醇及水之沖提下，分 得 1~6 個部分。首先以 A431 之培養液測試 1~6 個部分之細胞毒性，結果顯示 Fr.5 分 別以 10、50、100、150ìM 之濃度，於 12、
24、36、48 小時表現出相當強之細胞毒性 結果如表 1 所示；而 Fr.3 之細胞毒性則較 微弱些。
表 1 Fr.5 之細胞存活率百分比測試 (ìg/ml)
hr
10 50 100 150 IC50 (ìg/ml)
12 75.69 46.37 44.64 48.23 73.87 24 98.58 35.47 7.31 6.55 22.36 36 91.64 43.39 8.10 8.68 21.40 48 80.28 21.11 7.29 6.96 18.13
表皮生長因子(EGF)透過 EGFR (EGF receptor) 傳遞至細胞內，促使細胞生長分 化及分泌 MMPs 的作用。但癌細胞則透過 蛋白質酪胺酸激酵素過度之表現、生長因 子、治癌物之刺激，造成癌細胞之形成甚 而 加 速 其 生 長 。 同 時 加 入 EGF 會促進 MMPs 分泌之增加，使得癌細胞更容易轉 移(13-16)。因此針對 MMP-2、MMp-9 分泌 之抑制作用測試牡丹皮 fr.5 之活性，結果 如圖 1 所示，於 100、200ìg/ml 均顯示明 顯之抑制作用。
圖 1 Fr.5 對 MMPs 之抑制作用
細胞死亡途徑主要以細胞壞死或細胞 凋亡兩種，也是探討活性成分對癌細胞作 用機轉之方式。當細胞壞死，細胞膜破裂 而釋放出趨化性細胞物質，引起發炎反應 以便清除碎片。這些壞死細胞的 DNA 被 任意切割，於是在 DNA 的凝膠電泳片上呈 現模糊的光帶(17-21)。因此測試牡丹皮 fr.5 是否以細胞壞死之方式達到抑制癌細胞之 生長，其結果如圖 2 所示，fr.5 於 100、200、
300ìg/ml 均顯示明顯之 DNA 段片。
圖 2 Fr.5 於細胞培養 24 小時後，對 A431 細胞株 之 DNA 裂 解 片 段 圖 。 Lane 1:10ìg/ml; Lane 2:20ìg/ml; Lane 3: 50ìg/ml; Lane 4: 100ìg/ml; Lane 5: 200ìg/ml; Lane 6: 300ìg/ml。
牡丹皮於傳統中藥上用於活血化瘀，
文獻上指出對於抑制血小板凝集之效果甚 佳，且具明顯之抑制血管增生之作用。從 本研究之數據顯示，fr.5 於 100、200ìg/ml
均表現明顯之 MMP-2、MMp-9 分泌之抑制 作用；而 NDA 之片斷試驗可知其促進細胞 壞死亦是其作用機轉之一。從 fr.5 繼續分 離純化之化合物，其結構式及活性仍在測 定中。
四、計畫成果自評
1. 研究內容與原計畫之目的，完全相符。
2. 由於具活性之 fr.5 仍繼續分離純化之 中，其結構式及活性尚須測定，故達成 預期目標大約 75~80%。
3. 研究成果的學術及應用價值適合在學 術期刊中發表。
4. 從中藥活性成分之作用機轉，與傳統中 藥之藥理作一印證。
五、參考文獻
[1] Liotta LA (1992) Cancer cell invasion and metastasis. Medicine Feb 142-148.
[2] Nakajima M, Welch DR, Belloni PN, NicolsonGL (1987) Degradation of basement membrane type IV collagen and lung subendothelial matrix by rat mammary adenocarcinoma cell clones of differing metastatic potentials. Cancer Res 47:
4869-4876.
[3] Liotta LA, Steeg PS, Stetler-stevenson W (1991)
3 Cancer metastasis and angiogenesis: an imbalance of positive and negative regulation. Cell 64:
327-336.
[4] Neal DE, Marsh C, Bennet MK, Abel PD, Hall RR, Sainsbury JR, Harris AL (1985) Epidermal growth factor receptors in human bladder cancer:
comparison of invasive and superficial tumors.
Lancet 336-368.
[5] Paolo M, Daniel B, Rifkin (1993) Biology and biochemistry of proteinase in tumor invasion.
Physiological Reviews 73(1): 161-195.
[6] Kelloff GJ, Fay JR, Steele VE, Lubet RA, Boone CW, Crowell JA, Sigman CC (1996) Epidermal growth factor receptor tyrosin kinase inhibitors as potential cancer chemopreventives.
Cancer Epidermiol Biomarkers Prev 5: 657-666.
[7] Wang YS (1983) Pharmacology and application of Chinese medica. Beijing: Peoples Health Publisher pp. 259-533.
[8] Kondapaka SB, Fridman R, Reddy KB (1997) Epidermal growth factor and amphiregulin up-regulate matrix mettaloproteinase-9 (MMP-9) in human greast cancer cells. Int J Cancer 70: 722-726.
[9] Benaud C, Dickson RB, Thompson EW (1998) Roles of the matrix mettaloproteinases in mammary gland development and cancer. Breast Cancer Res Treatment 50: 97-116.
[10] Tani Y, Katsuki Y, Kosoto H, Arichi S, Kubo M, Tatsuda H, Kimura Y, Kitagawa I, Yoshikawa (1981) Studies od the medical history, chemical conatituents and pharmacological effects of moutan cortex. Proc Symp Wakan-Yaku 14: 86-92.
[11] Dictionary of Chinese Materia Medica (1977) Chiangsu New Medical College: Shanghai Scientific and Technological Publishing Co., Shanghai pp. 1127.
[12] Cohen S, Carpenter G, King L. (1980) Epidermal growth factor receptor protein kinase interactions. Co-purification of receptor and epidermal growth factor unhanced phosphorylation activity. J Biol Chem 255: 4834-4842.
[13] Bishop JM (1987) The molecular genetics of cancer. Science 235: 305-311.
[14] Levitzki A, Gazit A (1995) Tyrosine kinase inhbition: an approach to drug development.
Science 267: 1782-1788.
[15] Yasui W, Hata J, Yokozaki H, Nakatani H, Ochiai A, Ito H, Tahara E (1988) Interaction between epidermal growth factor and its receptor in progression of human gastric carcinoma. Int J Cancer 41: 211-217.
[16] Merlino GT, Xu YH, Clark AJ, Semba K, Toyoshima K, Yamamoto T, Pastan I (1984) Amplification and enhanced expression of the epidermal growth factor receptor gene in A431 human carcinoma cells. Science 224: 417-419.
[17] Green RD and Reed CJ (1998) Mitochodria and apoptosis. Science 281: 1309-1316.
[18] Liotta LA (1992) Cancer cell invasion and metastasis. Sci Am 142-148.
[19] Liotta LA, Steeg PS and Stetler-Stevenson W (1991) Cancer metastasis and angiogensis: an
imbalance of positive and negative regulation. Cell 64: 327-336.
[20] Martin SJ and Green DR (1995) Apoptosis and cancer: the failure of controls on cell death and ell survival. Crit Rev Oncol Hematol 18: 137-153.
。
4
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※
※ 牡丹皮抑制腫瘤轉移作用之評估 ※
※ Evaluate the inhibitory effects of Paeonia suffruitcosa ※
※ on tumor metastasis ※
※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※
計畫類別：□個別型計畫 □整合型計畫 計畫編號：NSC90－2320－B－038－049 執行期間：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日
計畫主持人：許秀蘊 共同主持人：李明亭
計畫參與人員：黃倫伶、劉冠論
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：台北醫學大學
中 華 民 國 91 年 10 月 18 日
