（二）單次高強度運動採用 (Van Soeren &amp

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第參章研究方法 一、受試者

本實驗挑選 32 位無高血壓、心血管疾病且沒有服用任何抗氧化營養品之受試者，以招募的方式將受試者分配至控制組、運動組、吸菸組及吸菸加運動組共四組，每組人數各為 8 人。吸菸者的菸齡需達到至少一年，且每日香菸數量需達到至少 10 支；規律運動者需達到每週運動至少 3 次，每次至少 30 分鐘，持續至少半年。

每位受試者在實驗開始前需填寫受試者同意書（附錄二）、受試者基本資料及實驗相關調查表（附錄三）、受試者健康情況調查表（附錄四），且於實驗處理前需 48 小時內禁止激烈運動，血液收集前需至少 8 小時禁食；

而吸菸者於血液收集前需至少 8 小時禁菸。

二、實驗設計

首先，受試者以跑步機進行單次遞增性運動至衰竭，測量其最大攝氧量 (V‧

O2max)，以作為相對運動強度訂定的依據。間隔兩天之後，以跑步機實施 85%V‧

O2max 的強度進行單次高強度運動至衰竭，並於運動前（安靜態）及運動後立即採血。所有受試者皆於早上 6 點至 12 點進行單次高強度運動。實驗設計流程與步驟，描述如下：

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（一）漸增負荷運動測試

遞增性運動測試開始的速度為 4 mile/hr 持續 5 分鐘，此後每 3 分鐘增加 1 mile/hr；當速度增加至 10 mile/hr 時，每階段改以增加坡度 2％，直到受試者衰竭（吳家慶，2005，頁 33）。

（二）單次高強度運動採用 (Van Soeren & Graham, 1998) 的方法 受試者於原地跑步機上進行 85％V‧

O2max 的運動強度至衰竭，同時採集氣體作事後分析。

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三、實驗流程圖

填寫受試者同意書、基本資料及實驗相關調查表、健康情況調查表

招募受試者至下列組別

控制組運動組吸菸組運動加吸菸組

收集受試者基本資料

採集安靜時血液

85%V‧

O₂max 單次高強度運動

運動後立即採集血液

收集數據進行分析

圖一實驗流程圖

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四、血液樣本分析

（一）血清與血漿樣本製備：

於單次高強度運動前後各採集受試者橈靜脈的血液 21 ml，分別置於真空管與含有 EDTA 或 heparin 的抗凝劑試管，於 4℃下以 4,000 g 離心 15 分鐘，將其上清液（血清或血漿）取出備用。

（二）紅血球溶胞液 (erythrocyte lysate) 製備及血紅素移除法：

1. 將含有 EDTA 抗凝劑試管中的上清液完全取出後，移除紅血球上層之白血球，剩餘溶液為紅血球。先取 8 ml 的 HPLC-water ( Sigma, USA ) 置入離心管內，再加入 2 ml 的紅血球均勻混合，於 4℃以 10,000 g 離心 15 分鐘後，取出上清液備用。

2. 萃取液 (Extraction Reagent)：ethanol / chloroform 的體積比為 62.5/37.5 (w/v)，並置於 2-8℃。

3. 取 400 µl 的萃取液並加入 250 µl 的紅血球溶胞液的樣本，並於震盪器上均勻混合 30 秒。

4. 於 4℃下以 3,000 g 離心 5 分鐘，並取出上清液（於 24 小時內分析時，

可放置於 2 - 8℃，否則需要冷凍）。

（三）血紅蛋白 (hemoglobin, Hb) 分析

1. 在所有測量的分光比色管內加入 1000 µl 的 hemoglobin reagent

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( Instruchemie, Netherlands)。

2. 在 blank 的分光比色管中加入 2 µl 的 ddH₂O。

3. 在 standard 的分光比色管中加入 2 µl 濃度為 10.3 mM 的 hemoglobin standard (Instruchemie, Netherlands)。

4. 在 sample 的分光比色管中，分別加入 2 µl 的紅血球溶胞液。

5. 將分光比色計 (Hitachi U-2000, Japan) 的波長設定 540 nm。

6. 先將 blank 置入分光比色計內歸零。

7. 分別置入 standard 與 sample 測量吸光值。

8. Hemoglobin 濃度換算：

sample 的吸光值/standard 的吸光值 × 10.3 (mM)或 sample 的吸光值 × 36.8 (g/dl)

（四）乳酸分析

以血漿乳酸分析檢驗 85%V‧

O2max 強度單次高強度運動的效果（步驟請參見附錄五)。

（五）氧化指標與抗氧化酶活性分析

受試者氧化指標分析項目包括血漿脂質過氧化物-硫巴比妥酸反應物質 (thiobarbituric acid reactive substances, TBARS) 及血漿氧化態低密度脂蛋白 (oxidized low density lipoprotein, oxLDL)，而抗氧化酶活性分析項目則

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包括紅血球溶胞液過氧化氫酶 (catalase, CAT) 、麩胱甘肽過氧化酶

(glutathione peroxidase, GPx)、超氧離子歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 活性等（步驟請參見附錄五)。

五、統計分析

本研究以 SPSS 13.0 套裝軟體系統進行各項資料統計分析，所有測量之 數據皆以平均值 + 標準誤表示，統計意義至少須為 p < .05。在考驗研究假 設上所使用的統計方法有：

（一）以配對 t 考驗 (paired t test) 檢定各組運動前及運動後乳酸濃度的差 異。

（二）以獨立樣本單因子變異數分析考驗各組運動前氧化傷害指標

TBARS、oxLDL 濃度及抗氧化酶 CAT、GPx、SOD 活性之差異。

（三）採用獨立樣本雙因子（運動 × 吸菸）共變異數分析 (ANCOVA)，以各組運動前數據作為共變數，考驗運動後各組氧化傷害指標 TBARS、oxLDL 濃度及抗氧化酶 CAT、GPx、SOD 活性之差異。

當主要效果達顯著，再以 Scheffe’s 法進行事後比較。