P ot en ti al v s S C E

第一章　緒論

1-1 PQQ 文獻回顧

醌是醌蛋白(quinoproteins)中重要的氧化還原輔酶，其中最早被發

現的為Pyrroquinoline quinone，簡稱為 PQQ，是由 Salisbury⁽¹⁾在1979 年從菌種裡所分離而得，具有如下結構：

N

HN COOH C

HOOC

O O HO O

PQQ

有鑑於醌在醌蛋白中的重要性^(2-3)，科學家也著手對PQQ 的基本性質 進行探討，包括其對微生物的生長⁽⁴⁾、藥理性質^(5-7)及營養價值等之研

究^(8-9)。近年來，科學家也開始對 PQQ 在生化能源轉換中的角色進行

探討，圖1-1 所示即為 PQQ 催化氧化酒精⁽¹⁰⁾、胺類⁽¹¹⁾、胺基酸⁽¹²⁾、 硫醇⁽¹³⁾及葡萄糖⁽¹⁴⁾可能涉及的機制：

O

Ca²⁺ N

HN His144 O

Ca²⁺ O

O OH OH H HOHO

OH

N

HN His144

O O^- Ca²⁺

O OH O HOHO

OH

HN

HN His144 H

+

OH H OH

Ca²⁺ N

HN His144 OH

圖1-1 以 PQQ 為活性中心的代表性催化反應。

為探討PQQ 的電化學性質，Katz 等⁽¹⁶⁾首先在1994 年，藉由 cystamine 單層膜將 PQQ 修飾於金電極表面。藉由 PQQ 修飾電極，

他們發現：鈣離子可有效輔助PQQ 催化氧化 NAD(P)H。他們也將 PQQ 與葡萄糖氧化酶以自組裝薄膜方式，共同修飾於金電極上，藉 以催化氧化葡萄糖⁽¹⁷⁾。在1997 年，Bardea⁽¹⁸⁾利用PQQ 與 NAD⁺單層 膜和Lactate dehydrogenase 共同組成 PQQ 修飾電極，將溶液中的 pyruvate 轉換成 Lactate。在 1999 年，Arunas 等⁽¹⁹⁾藉由 polypyrrole 將 以PQQ 為活性中心的酒精去氫酶（ADH），修飾於白金電極上，藉 以將酒精轉化為乙醛。在1998 年，Katz 等^(20-21)進一步利用 PQQ 單層 膜修飾電極與microperoxidase-11 修飾電極結合，組成一可催化氧化

測器^(22-23)。在 2005 年，他們也成功將 PQQ 與葡萄糖去氫酶（GDH）

共修飾於金奈米上，製成酵素電極⁽²⁴⁾。

金屬離子在PQQ 所涉及的生化反應中似乎扮演重要角色。在 2001 年，Akihiro 等⁽²⁵⁾報導：鈣離子可穩定 PQQ 在轉化過程中的中間體：

semiquinone，因而有利其對受質的轉化反應。在 2003 年，Anthony 等⁽²⁶⁾從 E.coli.中分離出葡萄糖去氫酶，證實其活性中心的 PQQ 可與 鈣離子鍵結，其X-ray 繞射光譜如下所示：

圖1-2 由 E.coli.分離出的葡萄糖去氫酶，其活性中心 PQQ 與鈣離子 鍵結之X-ray 繞射光圖，其中 M²⁺為Ca²⁺。

除了對微生物的生長具有活性影響外，Takaoki Kasahara⁽⁸⁾也發 現：老鼠體內若缺乏PQQ，會顯現出生長緩慢、皮膚皺折，甚至生 殖力下降的行為偏差。有鑑於上述研究結果，本論文嘗試對PQQ 的 基本電化學行為作進一步研究，探討其與過渡金屬離子，如Cd²⁺、 Cu²⁺與Pb²⁺，間的交互作用。本論文也探討PQQ 可否參與酒精去氫 酶或葡萄糖去氫酶所涉及的電子轉移反應，並探討其與NADH 與 NAD⁺間可能存在的光誘發與錯合反應。

1-2 酵素電極

酵素於電化學上的應用是生化感測中的重大突破。酵素在生化反 應中具有高選擇性與專一性，因此極適合應用於生化感測與辨識。若 以偵測機制異同而論，酵素電極可大略分為兩類：一為藉由酵素與其 受質反應所生成的產物，如過氧化氫，以間接進行定量分析。另一，

則是直接利用酵素獲得受質的訊號。然而，生化物質在一般電極表面 多存在可觀的過電壓，難以在電極表面進行電子交換，因此多需在電 極表面修飾其他電子傳遞輔助物質，以降低過電壓的干擾，加速電子 傳遞速率。為能探討PQQ 的基本電化學與光化學性質，本論文利用 雙(十二烷基)-雙甲基-銨(didodecyldimethylammonium bromide，簡稱 DDAB)作為修飾劑，以製備 PQQ 修飾電極。目前 DDAB 已被廣泛應 用於修飾電極製備上，例如已被成功地應用於製備myoglobin^(27-30)和 hemoglobin^(31-32)修飾電極，並可藉以偵測生化重要物質如NO^(33-34)。

1-3 敏光物質能階測定與 zero-zero bands 電子轉移

當物質吸收特定波長的紫外或可見光光子後，物質內的電子可從 低能階（基態）躍遷至高能階（激發態），分子的內能會從基態（Ground state）升高至激發態（Excited state）。當輻射光消失後，激發態的分 子會在暫時距後，以圖 1-3 所示的輻射或非輻射形式將所吸收的能量 釋放：

圖1-3 分子內電子轉移示意圖，其中 VR 為 vibrational relaxation；IC 為internal conversion；ISC 為 intersystem crossing。

由於受到分子內原子間的振動與轉動之影響，分子能階在理論上 與原子能階有所不同，會呈現出如圖1-4(A)所示的「帶狀結構（band structure）」。為能估計分子內電子躍遷時所需的最低能量，實驗上可 以分子的激發光譜（Excitation spectra）與放射光譜（Emission spectra）

估計之，如圖1-4 (B)所示：

2 0 2 5 3 0 3 5 4 0

0 .0 0 .2 0 .4

0 .6

A

F

E/ eV

v"=0 v"=1 v"=2 v"=3 v'=0 v'=1 v'=2 v'=3 螢光光譜 激發光譜

0-0 band

F

E/ eV

S₁

S₀

B

圖1-4 吸收光譜與放射光譜示意圖(A)與電子躍遷路徑示意圖(B)。

圖1-4 中重疊處的能量，即為電子從基態電子能階中的基態振動能階

（S_o, v = 0），躍遷至激態電子能階中的基態振動能階（S_n, v = 0，n ≥ 1）所需能量。由於該能量涉及基態振動能階躍遷至基態振動能階，

故也稱為zero-zero bands transition。

由於PQQ 具有吸收光能的潛力，本論文便以其激發光譜與放射 光譜，估計PQQ 分子內電子進行 zero-zero band 躍遷時所需能量，再 藉以求得其激態與基態間的相對能量。以PQQ 在 pH 3 的環境中為 例，我們估計PQQ 的基態與激發態間的能階差約為 3 eV：

PQQ + hν ---> PQQ*, ∆G = -3 eV (1-1)

由於基態PQQ 的還原電位約為+0.2 V vs. SCE：

PQQ + ne^- + nH⁺ ---> PQQHn E^o’ = 0.2 V (1-2) 根據上述二方程式，我們估計處於激發態的PQQ，其還原電位可達 +3.2 V vs. SCE，圖 1-5 所示即為其基態與激發態之還原電位示意圖：

P ot en ti al v s S C E

-1 0 1 2

H₃-PQQ*/H₃-PQQH₂ hν

3

H₃-PQQ/H₃-PQQH₂

(-)

(+)

3.0eV

圖1-5 PQQ 基態與激發態之還原電位示意圖。

1-4 Stern-Volmer 方程式

分子受光激發後，可循輻射形式（radiation），如螢光或磷光放射，

將能量釋出，亦可循非輻射形式（non-radiation），如放熱，將能量釋 出。但由於激態分子是具潛力的氧化劑或還原劑，因此若在電子授與 者或接受者存在時，二者間便可發生光誘發電子轉移或是能量轉移反

應^(35-40)，而將能量經由淬熄反應（quenching）釋出，如下圖所示：

Dye Dye*

Dye+hv'

Dye+heat Dye+Q k_f

k_nf k_q[Q]

螢光 熱能

淬熄 hv

Q

其中Q 表示 quencher，k 為反應速率常數。在此情況下，激發態分子 的放光效率或量子產率（quantum yield）會降低，光強度會減弱，生 命期（lifetime，τ）也可能會因而縮短。

若無淬熄物（quencher）存在時，系統的螢光量子產率（ψf0） 可表示為：

ψf0= kf /(kf + knf) (1-3) 若加入淬熄物後，螢光量子產率（ψf）則會改變為：

ψf = kf /(kf + knf + kq[Q]) (1-4) 結合上述各式：

(ψf0/ψf) = 1 + (kq[Q]/kf + knf) (1-5) 若τ為存在淬熄物時之螢光生命期，而τ0為無淬熄物的螢光生命 期，則方程式1-5 可改寫為：

(ψf0/ψf) = (τ0/τ) = 1 + τ0kq[Q]

= 1 + Kq[Q] (1-6) 此關係式即為Stern-Volmer 方程式，若以（τ0/τ）或（ψf0/ψf）對 [Q]作圖，即可求得 Kq值。

1-5 X 光光電子能譜簡介⁽⁴¹⁾

X 光光電子能譜（X-ray photoelectron spectrum）的測量原理，主

要是根據愛因斯坦的光電效應。當 X-ray 照射到材料表面時，若光子 的能量（hν）大於元素內電子束縛能（Eb），則電子便可掙脫原子核 的束縛，成自由電子。這種自由電子便稱為光電子（photoelectron）。

基於光電子游離前後能量必須守恆，故其動能（Ek）便可表示為：

Ek = hν - Eb – w (1-7) 其中 w 為光譜儀的功函數(work function)，為一參數，可用調節該電 子實際存在與量測所得環境間的差異性。圖1-6 所示，即為 X 光光電 子能譜原理示意圖。

1s 2s 2p

X-ray

photoelectron

圖1-6 X 光光電子能譜原理示意圖。

由於X 光的能量較高、波長較短，故可對原子的內層電子進行能 階分析。一般而言，不同元素內層軌域的電子具有其特定的束縛能，

因此可藉由內核層電子能譜分析得知元素成分，所以此技術又稱為 Electron Spectroscopy for Chemical Analysis (ESCA)。除外，相同原 子常因化學結構不同，其內核層電子的束縛能也會顯現差異，即化學 位移。根據束縛能或化學位移的差異，化學家便可進而瞭解特定元素 所處的化學環境之異同。

進行XPS 光譜分析時，樣品多置於超高真空腔體內（<10^-8 Torr）， 再將單光化後的X 光聚焦照射於樣品上，利用電子能量分析儀

(Electron Energy Analyzer)，量測電子數目對電子動能之函數圖，即所 謂能量分佈曲線(Energy Distribution Curve, EDC)。電子能量分析儀所 量得的動能可表示為：

Ek = hν - Eb – Φsp (1-8) 其中Φsp為電子能量分析儀之功函數。Ek為電子能量分析儀所量得的 電子動能，並非所釋出至真空中自由電子的動能，藉由束縛能的分佈 曲線，便可獲得該元素的電子結構及化學組態。

1-6 X 光吸收光譜簡介^(42-43)

X 光吸收光譜分析包括 X 光近緣結構（X-ray Absorption Near-Edge Structure，簡稱為 XANES）與延伸 X 光吸收精細結構 (Extended X-ray Absorption Fine Structure，簡稱為 EXAFS)分析，其中 XANES 可 以 用 來 檢 測 待 測 物 中 特 定 原 子 之 電 子 組 態 ， 而 EXAFS 則可 被 用 來 測 定 原 子 之 區 域 結 構 ， 進 而 得 知 原 子 與 其 鄰 近 原 子 間 的 距 離 、 種 類 或 配 位 數 目 等 。

物質受到X 光照射而吸收 X 光光能時，可用吸收係數 µ 來表示 其吸光程度，如式1-9 所示：

I = I₀exp(-µx) 　 　 　 (1-9)

其中 I0表示入射X 光之強度，I 表示出射光的強度，x 為樣品厚度，

而µ 代表待測物單位厚度對 X 光之吸收係數。光譜測量之初，雖然 入射光因能量不符而無法激發待測物，但常因散射等因素，而使得出 射光強度稍弱於入射光強度，因此多會顯現出少許吸收。但當X 光 的能量逐漸逼近待測物中所含原子之吸收邊緣（Absorption Edge）

時，原子的內層電子便可開始吸收X 光光子，致使電子躍遷至外層 空軌域，吸收度也隨之增加，形成所謂X 光近緣結構（XANES）。由 於不同原子之Absorption Edge 不盡相同，且其近緣結構也會受到中

測材料中特定原子的電子組態。

當X 光的能量繼續提高，內層電子便可形成光電子，離開原屬原 子。由於吸收原子的附近亦存在其他原子，故射出的光電子可能與之 作用而回彈。出射光電子與回彈光電子間便會產生干繞現象

（Interference），吸收係數便會隨相差改變而逐漸變化，呈現出週期 性變化，這種變化可從 Absorption Edge 延伸至約 1000 eV 的範圍內，

這範圍內的吸收光譜，即為「延伸X 光吸收精細結構（EXAFS）」。

1-7 研究動機

PQQ 是醌蛋白，如甲醇去氫酶與葡萄糖去氫酶，中的重要輔酶，

不僅具有輔助生化反應進行之功能，也具有醌類化合物中不多見的光 電性質。為能探討其基本光電特性，本論文藉由溶液態PQQ 與 PQQ 修飾電極，進行研究比對，藉以釐清二者間異同及其與金屬離子間的 交互作用，並探討其於生化檢測之應用潛力。