教師研究計畫成果報告

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教師研究計畫成果報告

年度:九十五年度 編號:CNCS9504

題目:生物氧療法於皮膚上之開發與應用

執行機構 : 嘉南藥理科技大學

職稱姓名 : 粧品系助理教授 劉家全

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研究成果內容 (一)摘要

氧化壓力(oxidative stress)一直以來都被認為對人體各方面均 有極大的傷害,其中在皮膚方面包括有老化、斑點和皺紋的形成等均 與其有密切的關係。然而,有文獻研究發現,若給予適當低濃度臭氧 (ozone)或二氧化氫(hydrogen peroxide)卻可明顯降低許多疾病的 症狀,並可誘發活化體內許多對抗氧化壓力的防禦機制;很多動物及 臨 床 實 驗 也 都 證 實 有 其 正 向 的 醫 療 價 值 , 統 稱 為 生 物 氧 療 法 (bio-oxidative therapy);此兩者觀點明顯不同,也都有研究文獻 佐証,實有必要實驗研究闡述釐清臭氧是否有其確實有效作用。且此 一概念也使用於市面上化妝品科技應用,例如:超氧純精油皮膚霜和 臭氧防皺霜等。因此,本實驗主要的目的是利用不同濃度臭氧水來評 估對皮膚細胞毒性及安全評估之影響,進一步實驗設計觀察是否對美 白及抑癌功效有作用。首先以臭氧製造機製成高或低不同濃度臭氧 水,給予處理在皮膚纖維母細胞和黑色素瘤細胞上,以 MTT 觀察細胞 存活率。另一方面,以黑色素瘤細胞的生長抑制來評估對美白功效與 抑癌之影響。結果發現經細胞培養兩天後,稀釋後臭氧水對正常皮膚 細胞並無明顯毒性,且對黑色素癌細胞於處理兩天後,明顯有抑制生 長的情形。本研究有助釐清生物氧療法是否在皮膚上確有其功效,可

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作為市售化妝品產品篩選或原料開發使用之參考。

(二)研究目的

本本實驗主要的目的是利用不同濃度臭氧水來評估對皮膚細胞 毒性及安全評估之影響,進一步實驗設計觀察是否對美白及抑癌功效 有作用。

(三)研究方法與步驟 臭氧水製造

以臭氧水生成裝置(電解法臭氧發生器)產生臭氧水,實驗當天新 鮮配置,在稀釋成低或高各種不同濃度存放。

細胞存活率分析(MTT viability assay)

MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenol tetrazolium bomide]

為tetrazolium salt,經細胞內粒腺體去氫酶(dehydrogenase)的分解,

由透明無色產生藍色formazan晶體。將細胞置於 24 孔的微量平盤,

每孔有 1 ml之新鮮的培養液及約 104 cells,培養隔夜後,經過不同的 處理再進行細胞存活力之測定。在測定前,先將MTT以未含有FBS的 DMEM培養液稀釋成 0.2 mg/ml,將 1 ml之MTT稀釋液加入每孔細胞 中,於 37℃下培養 1 小時,於倒立顯微鏡下可觀察到細胞內藍色結

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晶的生成。將 24 孔的微量平盤倒蓋,移去培養液,再以 1 ml之DMSO 加以溶解,搖晃 5 分鐘直到看不到晶體後,在 492 nm讀取其吸光值。

酪胺酸酶分析(tyrosinase assay)

將細胞以 3×104/well之密度培養於 96-well培養盤中,並在 37oC、

5% CO2培養箱中至少生長 16 小時以上,接著分別加入不同濃度的萃 取物於指定的時間作用後,每個well中以 200 µl的PBS清洗,再分別 加入 20 µl 0.5% (V/V),Triton-X-100/50 mM sodium phosphate buffer

solution (pH6.9),置入-80oC,30 分鐘後,取出於室溫中放置 25 分鐘,

最後再於 37oC放置 5 分鐘。每個well中加入 190 ml受質溶液(6.3 mM MBTH,3-methyl-benzothizaolinone hydrazone),1.1 mM L-dopa於 48 mM sodium phosphate buffer solution , pH7.1) 含 有 4% (V/V) N, N-dimethyl foramamide,於 37oC反應 60 分鐘後,以免疫酵素分析儀 測定波長 508 nm吸光值。

(四)研究結果及討論

根據文獻報導指出,適量的給予氧化壓力源,不僅不會增加生物 體本身的傷害,反而會直接或間接誘發出體內抗氧化防禦系統,產生 更強的抗氧化作用;例如臭氧和二氧化氫的稀釋後低量使用,可見於 臨床醫學治療上。於皮膚上的應用有,將臭氧混入橄欖油、葵花油等,

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作成外敷油膏治療:黴菌感染(包括香港腳)、腿部潰瘍、褥瘡、齒齦 炎、單純泡疹、痔瘡、外陰道炎、蜂螫、蟲咬、粉刺及其他皮膚問題。

最近,學者也指出臭氧療法具有正向和反向不同的兩面作用,而仿間 市售產品中亦出現超氧純精油皮膚霜和臭氧防皺霜等產品,然而,卻 鮮少有實驗明確指出其功效作用,或是否經安全性評估。而本實驗結 果發現經細胞培養兩天後,稀釋後臭氧水對正常皮膚細胞並無明顯毒 性,且對黑色素癌細胞於處理兩天後,明顯有抑制生長的情形(如結 果圖表)。然而,濃度提升後,臭氧水有出現些微細胞毒性情形(12 μg/ml),針對抑制黑色素癌細胞生長方面,低濃度適當處理後兩天 確實出現抑制效果,且呈現濃度依賴效果,但是超過 12 μg/ml 濃度 後,抑制情形則逐漸遲緩(data not shown)。因此市售臭氧水產品需 注意高濃度的使用是否對細胞本身有傷害性,且過度強調高濃度是否 確有其功效值得深入考量。

(五)結果圖表

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The effects of ozone water on cell viability in HS68 cell

Days

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

C e ll Via b ility (% )

60 80 100 120 140 160 180 200 220

Control 1ug/ml 2ug/ml 4ug/ml 10ug/ml

The effects of ozone water on cell viability in B16 cell

Days

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Cell Viability (% )

60 80 100 120 140 160 180 200

Control 1 µg/ml 2 µg/ml 4 µg/ml 10 µg/ml

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Days

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Cell viability (%)

60 80 100 120 140 160 180 200

control 1ug/ml 2ug/ml 4ug/ml 10ug/ml 12ug/ml

The effects of ozone water on cell viability in B16 cell

(六)參考文獻

F. Sweet et al., Ozone Selectively Inhibits Growth of Cancer Cells. Science 209 (August 22, 1980): 931-32.

R. T. Canoso et al., Hydrogen Peroxide and Platelet Function. Blood 43, no. 5 (May 1974).

De Fabo EC. Arctic stratospheric ozone depletion and increased UVB radiation:

potential impacts to human health. Int J Circumpolar Health. 2005 Dec;64(5):509-22.

Saladi RN et al., The causes of skin cancer: a comprehensive review. Drugs Today (Barc). 2005 Jan;41(1):37-53. Review.

Lipatov KV et al., Ozone-ultrasonic therapy in the treatment of purulent wounds.

Khirurgiia (Mosk). 2002;(1):36-9.

Valacchi G et al., The dual action of ozone on the skin. Br J Dermatol. 2005 Dec;153(6):1096-100. Review.

數據

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參考文獻

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