行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
JNK 及 AP-1 在 thrombin 誘導肺部巨噬細胞 COX-2 及 iNOS 表現所扮演的角色
計畫類別： 個別型計畫
計畫編號： NSC94-2314-B-038-064-
執行期間： 94 年 08 月 01 日至 95 年 07 月 31 日 執行單位： 臺北醫學大學呼吸治療學系
計畫主持人： 江玲玲 共同主持人： 陳炳常
報告類型： 精簡報告
處理方式： 本計畫可公開查詢
中 華 民 國 95 年 10 月 30 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 ■ 成 果 報 告 期中進度報告
（計畫名稱）
JNK及AP-1在thrombin誘導肺部巨噬細胞COX-2及iNOS表現所扮 演的角色
計畫類別：■ 個別型計畫 □整合型計畫 計畫編號：NSC 94-2314-B-038-064
執行期間：94 年 08 月 01 日至 95 年 07 月 31 日
計畫主持人：江玲玲 共同主持人：陳炳常 計畫參與人員：
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：▓精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
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□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查 詢
執行單位:臺北醫學大學呼吸治療學系
中 華 民 國 95 年 10 月 07 日
一、中文摘要
在氣喘等呼吸道的疾病中，呼吸道的 發炎反應扮演著相當重要的病理角色。當 吸入外來的物質時，肺部巨噬細胞為第一 道的防線，可借由吞噬的作用將外來的物 質清除或直接將病原菌殺死來維持肺部的 衡定。此外，肺部的巨噬細胞也會分泌許 多的前發炎的物質，其中包括 NO，最後 導致呼吸道的發炎反應。而 NO 的產生主 要 是 經 由 inducible nitric oxide synthase(iNOS)的表現而來。本計劃我們將 探討在肺部 NR8383 巨噬細胞中，AP-1 及 JNK 在 thrombin 誘導 iNOS 表現。NR8383 巨噬細胞給予 thrombin 可依濃度及時間依 賴曲線誘導 iNOS 的表現。此外，thrombin 也可依濃度及時間依賴曲線誘導 COX-2 蛋 白 的 表 現 。 NR8383 巨 噬 細 胞 給 予 SP600125 (為 JNK 抑制劑)可抑制 thrombin 誘導 iNOS 的表現。同樣地，細胞給予 SP600125 也可抑制 thrombin 誘導 COX-2 蛋 白 的 表 現 。 NR8383 巨 噬 細 胞 給 予 thrombin 可依時間依賴曲線誘導 JNK 的磷 酸化。NR8383 巨噬細胞給予 curcumin (為 AP-1 抑制劑)可抑制 thrombin 誘導 iNOS 的表現。此外，NR8383 巨噬細胞給予 thrombin 也可依時間依賴曲線誘導 c-Jun 的磷酸化。NR8383 細胞給予 SP600125 也 可抑制 thrombin 誘導 c-Jun 的磷酸化。相 反地，PD98059 (為 MEK 抑制劑)則不能抑 制 thrombin 誘導 c-Jun 的磷酸化。經由以 上的結果顯示，在 NR8383 巨噬細胞中，
thrombin 可經由 JNK 及 AP-1 的訊息傳遞 路徑來誘導肺部巨噬細胞 iNOS 及 COX-2 蛋白的表現。
關鍵詞：肺部巨噬細胞﹔thrombin；發炎；
誘導性一氧化氮合成酶(iNOS)；環氧化酵 素 2 (COX-2) ；JNK；AP-1；c-Jun；訊息 傳遞
二、英文摘要
Airway inflammation plays a major
role in the pathophysiology of many lung disease states, such as asthma and pulmonary fibrosis. As the first line of defense against inhaled substances, alveolar macrophages play a crucial role in maintaining lung homeostasis. This is achieved via phagocytosis of foreign material or directly kills pathogens. Besides, alveolar macrophages are able to secrete a large range of proinflammatory mediators.
Among the bioactive substances produced by alveolar macrophages including active form of NO has been found the important mediators of airway fibrosis and inflammation. The NO release is dependent on the COX-2 and iNOS expression. In this project, we would like to investigate the role of JNK and AP-1 on thrombin-induced iNOS expression in alveolar macrophages.
Treatment of NR8383 cells with thrombin caused time-dependent increase in iNOS expression. Similar, thrombin also induced increase in COX-2 expression in time-dependent manner. SP600125 (a JNK inhibitor) inhibited thrombin-induced iNOS expression. Similar, SP600125 also inhibits yhrombin-induced COX-2 expression.
Treatment of NR8383 cells with thrombin caused time-dependent increase in JNK phosphorylation. Treatment of NR8383 cells with curcumin (a AP-1 inhibitor) inhibited thrombin-induced iNOS expression. In addition, cell treatment of thrombin also induces c-Jun phosphorylation. Furthermore, treatment of NR8383 cells with SP 600125 inhibits thrombin-induced c-Jun phosphorylation, but not by PD 98059 (a MEK inhibitor). These results indicate that thrombin activate the JNK and AP-1 signal pathways, which in turn induces iNOS and COX-2 expression in NR 8383 macrophages.
Keywords: alveolar macrophages, thrombin, inflammation, inducible nitroic oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), JNK, AP-1, signal transduction
三、報告內容[前言及文獻探討、研究目
的、研究方法、結果與討論(含結論與建 議)]
前言、文獻探討及研究目的
一般認為肺部巨噬細胞為肺部及血 管分界的保護者，當做第一道防線來防禦 外來的入侵者。它主要利用吞噬的作用將 外來的細菌、病毒或過敏原清除(Sibille and Reynolds, 1990)。此外，在肺部受到感 染時，肺部巨噬細胞在肺部防禦及免疫反 應 扮 演 重 要 的 調 節 角 色 (Sibille and Reynolds, 1990)。當肺部受到大量的細菌 或病毒感染的時候，這些致病原會活化肺 部巨噬細胞，且會誘導巨噬細胞增加前發 炎基因的表現及發炎物質的釋放，例如﹕
cytokines ( 如 ﹕ IL-1 ， IL-6 及 TNF-α)、
chemokines (如﹕IL-8)及proinflammatory mediators (例如﹕COX-2 表現及PGE2的釋 放 ; iNOS 表 現 及 NO 的 釋 放 ) (Haslett, 1999)。而這些前發炎物質會直接將免疫細 胞吸引到發炎部位，最後產生更大的發炎 反應。本計劃研究的主題將探討thrombin 誘導前發炎物質COX-2 及iNOS在肺部發 炎反應所扮演的角色。
Thrombin 為 一 個 多 功 能 serine protease 的物質，在血液凝固的過程中扮 演著重要的角色，其功能可將凝血因子 V、VIII 和 XIII 變成活化態，將 fibrinogen 轉換變成 fibrin，活化蛋白 C 和加強血小 板 的 活 化 ， 參 與 血 液 的 凝 固 。 此 外 ， thrombin 也是一種發炎的物質，可作用至 平滑肌細胞、巨噬細胞及嗜中性白血球，
而引起發炎的反應(Daves, et al., 1993)。而 在慢性肺部纖維化疾病的早期，肺部微血 管的內皮細胞會被瓦解及血管壁內層也會 受到損傷，最後引起微血管的傷害。此時，
thrombin 也會滲透至血管外而作用至呼吸 系統的細胞，而產生許多的反應，例如﹕
呼 吸 道 平 滑 肌 及 肺 部 纖 維 細 胞 的 增 生 ((Malik & Horgan, 1987)。此外，thrombin 也可以誘導前發炎物質的產生，例如在老 鼠腹部巨噬細胞、人類大腸的上皮細胞及 人類呼吸道上皮細胞中，thrombin 可以誘 導 MMP-12、COX-2、IL-6 及 IL-8 基因的 表 現 (Asokananthan et al., 2002) 。 雖 然 thrombin 在其它的組織可誘導發炎基因的
表現，然而查詢之前的文獻得知，thrombin 在肺部巨噬細胞所扮演的角色研究卻相當 少，這促使我有興趣研究 thrombin 在肺部 巨噬細胞所扮演的角色。是否 thrombin 可 以誘導肺部巨噬細胞 COX-2 及 iNOS 的表 現，其誘導的作用是經由何種作用機制來 調控。希望能借著 thrombin 在肺部巨噬細 胞的研究清楚得知 thrombin 在肺部疾病及 發炎過程所扮演的角色。
目 前 已 知 thrombin 可 經 由 protease-activated receptors (PARs)而產生 許外生理或病理的反應。直到目前為止 PARs有四種，分別為PAR1、 PAR2、 PAR3 及PAR4。PARs為一種G蛋白偶合的受體，
為穿透細胞膜七次的受體，PAR1 (Vu et al., 1991)，PAR3 (Ishihara et al., 1997)和PAR4 (Xu et al., 1998)可被thrombin所活化，但 PAR2 不行，卻可受到trysin、trypase及凝 血 因 子 VIIa 和 Xa 的 活 化 (Camerer et al., 2000)。當thrombin與PARs結合的時候，
thrombin會將PARs的N端抑制性的peptide 切除，使得PARs變成活化態，產生一連串 的訊息傳遞，而產生許外的生理反應(Vu et al., 1991)。有趣的是一些合成的peptide類 似PARs的 N端序列卻具有類似thrombin 的作用(Vu et al., 1991)。PAR1 可與G12/13、 Gq及Gi蛋白偶合，活化下游二級訊息傳遞 物 質 ， 而 產 生 一 連 串 的 反 應 (Coughlin, 2000)。PAR1 與G12/13蛋白偶合之後，G12/13
會 與 Rho GEFs (guanine-nucleotide exchange factors)結合，活化Rho蛋白，加 速血小板變形。PAR1 與Gi蛋白偶合之後，
會抑制adenylyl cyclase，可促進血小板的 反應。PAR1 與 Gq蛋白偶合之後，活化 phospholipase Cβ，使得phosphoinositide水 解產生IP3及DAG，使細胞內鈣離子濃度增 加及活化PKC，可進一步活化鈣離子依賴 激酶 (CaMK)、ERK及p38 MAPK等，來 調控血小板凝集及增加肺部纖維細胞和內 皮細胞轉錄的功能和基因的表現(Rahman et al., 1999; Ludeicka-Bradley et al., 2000)。而然在肺部的巨噬細胞中，thrombin 所扮演的角色研究卻十分的缺乏，這促使 我興趣研究thrombin是否可誘導COX-2 及 iNOS基因表現？ JNK和轉錄因子AP-1 所 扮演的角色為何？它們之間利用何種的分
子 機 制 來 調 控 COX-2 和 iNOS 蛋 白 的 表 現？希望能夠找出thrombin在肺部巨噬細 胞所扮演的角色。
在巨噬細胞中COX-2 為參與發炎反 應的重要基因之一。COX-2 是身體內一個 重要的酵素，其主要的作用是將花生四烯 酸 (arachidonic acid) 代 謝 成 前 列 腺 素 (prostaglandins, PGs)，其中包括PGE2, PGI2
和 TXA2。目前已知COX具有兩種不同的 同功酵素分別是COX-1 及COX-2 (Xie et al., 1991)。COX-1 稱為固定存在型，存在 很多的細胞，包括內皮細胞及血小板，它 們所產生的前列腺素主要扮演維持細胞 恆定的功能(Mitchell et al., 1995)。COX-2 稱為誘導型，當受到一些發炎性物質如 lipopolysaccharide (LPS)或cytokines (如:
IL-1β, TNF-α)的刺激會誘導COX-2 的表 現，進一步釋放出PGE2而產生發炎反應 (Mitchell et al., 1994, 1995)。
NO為一種自由基的氣體可以煤介許 多 動 物 器 官 之 連 繫 (Moncada et al., 1991)。目前有三種NOS被分離出來，且已 被證實(Knowles and Moncada, 1994)。腦 (type I)及內皮(type III) NOS為持續表現型 的酵素，其酵素的活性可受到鈣離子的調 控。然而誘導(type II) NOS (iNOS)可表現 在許多種的細胞中，而產生大量的NO，例 如﹕巨噬細胞產生的NO可以將細菌或癌 細胞殺死。在巨噬細胞中，許多的物質，
例如﹕LPS及IL-1β可經由增加iNOS的轉 錄 作 用 ， 使 得 iNOS 基 因 表 現 增 加 (Lorsbach et al., 1993)。iNOS蛋白可催化
L-Arg之terminal guanidine nitrogen atom而 釋放出NO，而扮演著抵禦外來入侵物質的 角色。然而在急性過氧肺部受傷的過程 中，所誘導iNOS表現則會釋放出大量的 NO而產生肺部的發炎反應(Hesse et al., 2004)。如此，假如我們能夠深入了解iNOS 基因的表現及其活化的作用機轉將有助於 對呼吸系統疾病有更深入的了解。
一般而言，要增加iNOS基因的表現，
主要是經由許多轉錄因子來調控。目前已 知在iNOS基因的核酸序列中具有多種轉 錄因子結合的位置，其中包括NF-κB、AP-1 及NF-IL-6等轉錄因子(Lowenstein et al.,
1993)。AP-1便是誘導iNOS重要的轉錄因 子，其組成主要是Fos和Jun所組成。AP-1 主要以homodimer或是heterodimer的型式 如Jun/Jun、Fos/Jun及ATF-2/Jun等方式存在 而結合在AP-1的作用位置(Karin, 1995)。
AP-1最早發現是PMA可經由AP-1轉錄因 子來增加metallothionein IIA基因轉錄的作 用，後來陸陸續續發現許多的物質包括生 長因子、神經傳遞物質及cytokines皆可活 化AP-1來增加基因的表現(Kaminiska et al., 2000)。另外，MAPKs也可以經由幾種 方式來增加AP-1的活性 (Karin, 1995)。第 一，ERK可經由磷酸化ELK1轉錄因子而增 加Fos蛋白表現，最後使AP-1複合體的濃 度增加，而增加其轉錄的活性。第二，JNK 或p38 MAPK會將Jun或ATF2磷酸化，而增 加Jun蛋白的表現，使得AP-1的複合體濃度 增加，最後增加AP-1與DNA結合的親合力 及轉錄的作用(Semal et al., 1991)。第三，
新合成出來的Fos會與Jun結合成為穩定的 複合體，此時ERK會將Fos的Ser 374位置 磷酸化(Deng & Karin, 1994)，而JNK會將 Jun的Ser 63及Ser 73位置磷酸化，最後增 加AP-1的活性。此外，p38 MAPK也可經 由磷酸化ATF2的作用來增加AP-1與DNA 結合的能力(Karin, 1995)。然而，thrombin 是否可經由JNK來增加AP-1與DNA結合 的 親 合 力 及 轉 錄 能 力 來 誘 導 COX-2 及 iNOS蛋白的表現將是本計劃要探討的課 題。
目前已知MAPKs參與許多基因的表 現，其中也包括COX-2及iNOS (Lin et al., 2001) 。 有 關 MAPK 家 族 的 分 類 乃 依 其 phospho-Thr 及 -Tyr 中 間 之 胺 基 酸 而 分 成 p44/42 MAPK (ERK1/2)、c-jun N-terminal kinase (JNK)和p38 MAPK，都屬於 Ser/Thr kinases，其Thr和Tyr受到上游MAPK kinase 的磷酸化後才會被活化，而MAPK kinase (MEK1/2、SEK1/MKK4 和MKK3/MKK6) 又會受到MAPKK kinase之磷酸化而活化 (Nishida & Gotoh, 1993)。MAPKs此路徑通 常會受到生長因子及G蛋白偶合受體的刺 激而活化(Blumer & Johnson, 1994)。其中 JNK主要是受到高滲透壓、UV照射和前發 炎細胞激素等刺激而被活化(Hambleton et
al., 1996)。之前的報告已證實LPS可以經 由JNK的路徑來增加COX-2基因的表現 (Bennett et al., 2001)。此外，在老鼠腹部 巨噬細胞中，thrombin可經由JNK的路徑來 增 加 COX-2 基 因 的 表 現 (Kang et al., 2003) 。 因 此 ， JNK 活 化 的 路 徑 在 誘 導 COX-2及iNOS基因的表現扮演著非常重 要的角色。先前的報告已證實thrombin可 活化JNK (Marinissen et al., 2003)。因此本 計 劃 將 針 對 JNK 是 否 參 與 thrombin 引 發 COX-2及iNOS的表現加以探討，其中包括 JNK被活化之後是否會經由活化轉錄因子 例如﹕AP-1來誘導COX-2及iNOS基因的 表現？此外JNK可經由何種分子的傳遞路 徑來誘導這些轉錄因子的活化？
綜合以上的介紹，肺部的發炎反應在 呼吸系統疾病例如氣喘及慢性阻塞性疾病 中扮演著重要的角色。因此在本計劃中，
我們主要探討thrombin在肺部巨噬細胞中 誘導COX-2及iNOS蛋白表現的調控機制 及其訊號傳遞路徑。我們將探討JNK的訊 息傳遞路徑所活化的AP-1在thrombin誘導 COX-2或iNOS蛋白表現所扮演的角色。希 望能藉此計劃能更進一步找出thrombin在 呼吸道疾病所扮演的角色及其作用機轉，
進而發展出呼吸道阻塞性疾病治療的新方 向。
研究方法
1. 細 胞 培 養 : 將 人 類 肺 部 巨 噬 細 胞 株 NR8383 培養在 Ham’s/F12K 含有 10%胎牛 血清及抗生素(100 units/ml penicillin 及 100 µg/ml streptomycin)中以進行下列的實 驗。2. 西方點墨法:測定 COX-2、iNOS、
JNK-p、JNK、c-Jun 及 c-Jun-p 等蛋白的變 化。3.統計方法:所有實驗數據皆以平均值
± 標 準 差 (mean ± S.E.M) 表 示 ， 並 以 Analysis of Variance (ANOVA) 配 合 Dunnet’s test 分析比較各組間是否有顯著 差異。p < 0.05 視為有統計上的意義。
結果
Thrombin 誘導 iNOS 及 COX-2 的表現 首先我們將 NR8383 巨噬細胞給予 thrombin 處理 0-48 小時，收集其蛋白質分 析 iNOS 的表現。將 NR8383 巨噬細胞給
予 thrombin (10 U/ml)刺激，發現 iNOS 蛋 白表現在 8 小時就有增加，且在 48 小時達 到最大 (Fig. 1)。
Figure 1
Thrombin 誘導 COX-2 蛋白表現
接下來我們也要觀察另外一個發炎 蛋白 COX-2 表現的情形。NR8383 巨噬細 胞 給 予 thrombin 處 理 不 同 時 間 ， 發 現 thrombin (10 U/ml)依時間依賴曲線增加 COX-2 蛋白表現。Thrombin 誘導 iNOS 蛋 白表現在 4 小時就有增加的情形，且在 12 小時具有明顯的增加作用，且持續到 48 小時之久(Fig. 2)。經由以上面結果的確在 肺部巨噬細胞中，thrombin 可以誘導發炎 物質 iNOS 及 COX-2 蛋白的表現。
Figure 2
SP600125 抑制 thrombin 引發 iNOS 蛋白 的表現
由前面的實驗證實了 thrombin 可以刺 激 iNOS 蛋白的表現。接下來我們將來觀 察 JNK 是否貢獻在 thrombin 所誘導 iNOS 蛋 白 的 表 現 當 中 。 將 細 胞 以 SP600125 (JNK 抑制劑; 3 及 10 µM)前處理 30 分鐘，
再以 thrombin (10 U/ml)刺激 24 小時後，
以西方點墨法的方法來分析 iNOS 蛋白表 現的情形。發現 SP600125 的確可依濃度 依賴曲線抑制 thrombin 誘導 iNOS 蛋白的 表 現 。 SP600125 在 10 µM 明 顯 抑 制 thrombin 誘導 iNOS 的表現(Fig. 3)。
Figure 3
SP600125 抑制 thrombin 引發 COX-2 蛋 白的表現
經由前面的實驗證實 SP600125 可抑 制 thrombin 刺激 iNOS 蛋白的表現。同樣 地我們將來觀察 JNK 是否貢獻在 thrombin 所誘導 COX-2 蛋白的表現中。將細胞以 SP600125 (JNK 抑制劑; 3 及 10 µM)前處理 30 分鐘，再以 thrombin (10 U/ml)刺激 24 小 時 後 ， 以 西 方 點 墨 法 的 方 法 來 分 析 CXO-2 蛋白表現的情形。發現 SP600125 的確可依濃度依賴曲線抑制 thrombin 誘導 iNOS 蛋白的表現。SP600125 在 3 µM 就 有明顯抑制作用，而 SP600125 在 10 µM 完全抑制 thrombin 誘導 COX-2 蛋白的表 現(Fig. 4)。
Figure 4
Thrombin 誘導 JNK 的磷酸化
經由以上的實驗發現 JNK 的確貢獻 在 thrombin 誘導 iNOS 及 COX-2 蛋白的表 現當中。接著我們將進一步探討 JNK 是否 會因 thrombin 的刺激而活化。我們將利用 利用特異性磷酸化 JNK 的抗體來偵測 JNK 被磷酸化的情形。將 NR8383 細胞給 予 thrombin 刺激不同的時間(0-60 分鐘)，
發現 JNK 的活性在 10 分鐘時就有增加，
且在 30 分鐘達到最大，60 分鐘之後慢慢 的下降(Fig. 5)。由此可見，thrombin 的確 可以活化 JNK 的訊息傳遞路徑來促使 iNOS 及 COX-2 蛋白的表現。
Curcumin 抑制 thrombin 誘導 iNOS 蛋白 的表現
之前的研究顯示 AP-1 在前發炎物質 的表現扮演者重要的角色。接著我們將探 討 thrombin 刺激 iNOS 的表現是否經由 AP-1 的 訊 息 傳 遞 路 徑 而 來 。 細 胞 以 curcumin (AP-1 抑制劑，0.1-1 µM)前處理 30 分鐘，再以 thrombin (10 U/ml)刺激 24 小時，發現 curcumin 可依濃度反應曲線抑 制 thrombin 誘導 iNOS 蛋白的表現(Fig.
6)。顯示 thrombin 可經由 AP-1 的活化來 誘導 iNOS 蛋白的表現。
Figure 6
Thrombin 引發 c-Jun 磷酸化
由 前 面 實 驗 證 實 了 thrombin 刺 激 iNOS 蛋白的表現受到轉錄因子 AP-1 的調 控。接下來我們將來觀察 thrombin 是否可 活化 AP-1 之次單元 c-Jun 的磷酸化。我們 將利用利用特異性磷酸化 c-Jnu 的抗體來 偵測 c-Jun 被磷酸化的情形。將 NR8383 細胞給予 thrombin 刺激不同的時間(0-60 分鐘)，發現 c-Jun 的磷酸化在 20 分鐘時就 有增加，且在 60 分鐘達到最大(Fig. 5)。由 此可見，thrombin 的確可以活化 c-Jun 使 轉錄因子 AP-1 的活化來促使 iNOS2 蛋白 的表現。
Figure 7
SP600125 抑制 thrombin 引發 c-Jun 的磷 酸化
由前面的實驗證實了 thrombin 刺激 iNOS 蛋白的表現受到 JNK 的調控。接下 來我們將來觀察 thrombin 所活化的 c-jun
是否可被 JNK 抑制劑 SP600125 所抑制。
將細胞以 SP600125 (10 µM)前處理 30 分 鐘，再以 thrombin (10 U/ml)刺激 60 分鐘 後，發現 SP600125 的確可抑制 thrombin 誘導 c-Jun 磷酸化的現象(Fig. 8)。相反地，
給予 MEK 抑制劑 PD98059 (30 µM)並不會 抑制 thrombin thrombin 誘導 c-Jun 磷酸化 的現象(Fig. 8)。顯示 thrombin 活化 c-Jun 是經由 JNK 的訊息傳遞路徑而來。
Figure 8 討論(含結論與建議)
綜 合 以 上 的 實 驗 證 明 顯 示 ， 在 NR8383 肺部巨噬細胞中，thrombin 經由 活化 JNK 的訊息傳遞路徑及 AP-1 的活 化，進一步誘導前發炎物質例如 iNOS 及 COX-2 的表現。經由本計畫及之前在肺部 上皮細胞的研究也發現 thrombin 可經由 PKCα及 Rac/PI3K/Akt 的訊息傳遞路徑，
將 IKKα/β磷酸化來增加 NF-κB 的活化，
而誘導 IL-8/CXCL8 的表現及釋放來產生 更大的發炎反應。如此，希望能够透過本 計劃的研究，能够更清楚了解 thrombin 在 肺部濃度增加時所產生的發炎反應的作用 機轉，對往後發展治療肺部的疾病貢獻一 自之力。
五、參考文獻
Asokananthan, N., Graham, P.T., Fink, J., Knight, D.A., Bakker, A.J., McWilliam, A.S., Thompson, P.J. and Stewart, G.A.
(2002) Activation of protease-activated receptor (PAR)-1, PAR-2, and PAR-4 stimulates IL-6, IL-8 and prostaglandin E2 release from human respiratory epithelial cells. J. Immunol. 168, 3577-3585.
Bennett, B.L., Sasaki, D.T., Murray, B.W., O'Leary, E.C., Sakata, S.T., Xu, W.,
Leisten, J.C., Motiwala, A., Pierce, S., Satoh, Y., Bhagwat, S.S., Manning, A.M.
and Anderson, D.W. (2001) SP600125, an anthrapyrazolone inhibitor of Jun N-terminal kinase. Proc. Natl. Acad. Sci.
U S A. 98, 13681-13686.
Blumer, K.J. and Johnson, G.L. (1994) Diversity in function and regulation of MAPK kinase pathways TIBS, 19, 236-240.
Camerer, E., Huang, W. and Coughlin, S.R.
(2000) Tissue factor- and Factor X-dependent activation of PAR2 by factor VIIa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5255-5260.
Coughlin, S.R. (2000) Thrombin signaling and protease-activated receptors. Nature 407, 258-264.
Daves, K.E., Gray, A.J. and Laurent, G.J.
(1993) Thrombin stimulates fibroblasts chemotaxis and replication. Eur. J. Cell.
Physiol. 128, 96-104.
Deng, T. and Karin, M. (1994) c-Fos transcriptional activity stimulated by H-Ras-activated protein kinase distinct from JNK and ERK. Nature 371, 171-175.
Hambleton, J., Weinstein, S. L., Lem, L. and DeFranco, A. L. (1996) Activation of c-Jun N-terminal kinase in bacterial lipopolysaccharide-stimulated
macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 93, 2774-2778.
Haslett, C. (1999) Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. Am. J. Respir. Crit.
Care. Med. 160, S5-S11.
Hesse, A.K., Dorger, M., Kupatt, C. and Krombach, F. (2004) Proinflammatory role of inducible nitric oxide synthase in acute hyperoxic lung injury. Respir Res.
5, 11.
Ishihara, H., Connolly A.J., Zeng, D., Kahn, M.L., Zheng, Y.W., Timmons, C., Tram, T. and Coughlin, S.R. (1997) Protease-activated receptor 3 is a second thrombin receptor in humans. Nature 386, 502-506.
Kaminiska, B., Pyrzynska, B., Ciechomska, I. and Wisniewska, M. (2000) Modulation of the composition of AP-1 complex and its impact on
transcriptional activity. Acta Neurobiol.
Exp. 60, 395-402.
Kang, K.W., Choi, S.Y., Cho, M.K., Lee, C.H. and Kim, S.G. (2003) Thrombin induces nitric-oxide synthase via Galpha12/13-coupled protein kinase C-dependent I-κBα phosphorylation and JNK-mediated I-κBα degradation. J Biol Chem. 278, 17368-17378.
Karin, M. (1995) The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J. Biol. Chem. 270, 16483-16486.
Knowles, R.G. and Moncada, S. (1994) Nitric oxide synthases in mammals.
Biochem J. 298, 249-258.
Lin, C.H., Kuan, I.H., Lee, H.M., Lee, W.S., Sheu, J.R., Ho, Y.S., Wang, C.H. and Kuo, H.P. (2001) Induction of cyclooxygenase-2 protein by lipoteichoic acid from Staphylococcus aureus in human pulmonary epithelial cells: Involvement of a nuclear factor- -dependent pathway. Br. J. B Pharmacol. 134, 543-552.
Lorsbach, R.B., Murphy, W.J., Lowenstein, C.J., Snyder, S.H. and Russell, S.W.
(1993) Expression of the nitric oxide synthase gene in mouse macrophages activated for tumor cell killing.
Molecular basis for the synergy between
interferon-gamma and lipopolysaccharide. J Biol Chem. 268,
1908-1913.
Lowenstein, C.J., Alley, E.W., Raval, P., Snowman, A.M., Snyder, S.H., Russell, S.W. and Murphy, W.J. (1993) Macrophage nitric oxide synthase gene:
two upstream regions mediate induction by interferon gamma and lipopolysaccharide. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 9730-9734.
Ludeicka-Bradley , A., Tourkina, E., Suzuki, S., Tyson, E., Bonner, M., Fenton II, J.W., Hoffman, S. and Silver, R.M.
(2000) Thrombin upregulates interleukin-8 in lung fibroblasts via cleavage of proteolytically activated receptor-I and protein kinase C-γ activation. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.
22, 235-243.
Malik, A.B. and Horgan, M.J. (1987) Mechanisms of thrombin induced lung vascular injury and edema. Am. Rev.
Respir. Dis. 136, 467-470.
Marinissen, M.J., Servitja, J.M., Offermanns, S., Simon, M.I. and Gutkind, J.S. (2003) Thrombin protease-activated receptor-1 signals through Gq- and G13-initiated MAPK cascades regulating c-Jun expression to induce cell transformation.
J. Biol. Chem. 278, 46814-46825.
Mitchell, J.A., Belvisi, M.G., Akaresereenont, P. Robbins, R.A., Kwon, O.J., Croxtall, J., Barnes, P.J. and Vane, J.R. (1994) Induction of cyclo-oxygenase-2 by cytokines in human pulmonary epithelial cells:
regulation by dexamethasone. Br. J.
Pharmacol. 113, 1008-1014.
Mitchell, J.A., Larkin, S. and Williams, T.J.
(1995) Cyclooxygenase-2: regulation and revelance in inflammation. Biochem.
Pharmacol. 50, 1535-1542.
Moncada, S., Palmer, R.M. and Higgs, E.A.
(1991) Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology.
Pharmacol Rev. 43, 109-142.
Nishida, E. and Gotoh, Y. (1993) The MAP kinase cascades is essential for diverse signal transduction pathways. TIBS, 18, 128-131.
Rahman, a., Anwar, K.N., True, A.L. and Malik, A.B. (1999) Thrombin-induced p65 homodimer binding to downstream NF-κB site of the promoter mediates endothelial ICAM-1 expression and neutrophil adhesion. J. Immunol. 162, 5466-5476.
Semal, T., Binetruy, B., Mercola, D., Birrer, M. and Karin, M. (1991) Oncogenic and transcriptional cooperation with Ha-Ras required phosphorylation of c-Jun on serine 63 and 73. Nature 354, 494-496.
Sibille, Y. and Reynoids, H.Y. (1990) Macrophages and polymorphonuclear neutrophils in lung defense and injury.
Am. Rev. Respir. Dis. 141, 471-501.
Vu, T.K., Hung, D.T., Wheaton, V.I. and Coughlin, S.R. (1991) Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of
receptor activation. Cell 64, 1057-1068.
Xu, W.F., Andersen, H., Whitmore, T.E., Presnell, S.R., Yee, D.P., Ching, A., Gilbert, T., Davie, E.W. and Foster, D.C.
(1998) Cloning and characterization of human protease-activated receptor 4. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95, 6642-6646.
