三、重組質體的確認

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肆、結果

一、SCA2 Ataxin-2 基因 CAG 重複分析

目前已分析179 位正常人(378 條染色體)以及 15 位運動失調症患 者(30 條染色體)、124 位失智症患者(248 條染色體)、137 位帕金森氏 症患者(274 條染色體)、84 位震顫患者(168 條染色體)以及 41 位舞蹈 症患者、肌張力異常症等其他神經相關疾病患者(82 條染色體)。在正 常人族群中,CAG 三核苷重複次數的分布範圍為 17 ~ 29 次,其中 92.9%等位基因(allele)其 CAG 三核苷重複次數為 22 次,其他族群等

位基因 CAG 重複的數目為 22 個的頻率為 89.5% (失智症患者) ~ 97.6% (其他神經相關疾病患者) (圖九)。所分析的 590 位個體中,異 型合子率(heterozygosity)為 13.4% (79 位)。各族群間 CAG 重複分佈情 形之詳細結果列於表二

二、SCA14 PRKCG 基因表現子 4 及 5 定序分析

PPRKCG 基因表現子 4 及 5 的定序研究中,總共分析了三十 個帕金森氏症徵候群病人,結果並沒有發現任何突變(圖十)。

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三、重組質體的確認

(一) pGEX-5X-3m-GST-fTBP-Q20/Q45/Q61重組質體

以限制酶 EarI 切割 pGEX-5X-3m-GST-fTBP-Q20/Q45/Q61重組質 體,經洋菜膠體電泳檢查,分別切出包含Q20、Q45、Q61的150、225、

273 bp 片 段 (圖 十 一 A,lanes 2 、 3 、 4) , 以 限 制 酶 PstI 切 割 pGEX-5X-3m-GST-fTBP-Q20/Q45/Q61 重組質體,經洋菜膠體電泳檢

查,包含Q20、Q45、Q61的 TBP 5’端 cDNA 在 4 kb 片段上,包含完整 TBP 3’端 cDNA 在 1.7 kb 片段上(圖十一B,lanes 2、3、4)。

(二) pGEX-5X-3m-GST-nTBP-Q20/Q45/Q61重組質體

以限制酶 EarI 切割 pGEX-5X-3m-GST-nTBP-Q20/Q45/Q61重組質 體,經洋菜膠體電泳檢查,分別切出包含Q20、Q45、Q61的150、225、

273 bp 片 段 (圖 十 二 A,lanes 2 、 3 、 4) , 以 限 制 酶 PstI 切 割 pGEX-5X-3m-GST-nTBP-Q20/Q45/Q61 重組質體,經洋菜膠體電泳檢 查,包含Q20、Q45、Q61的 TBP 5’端 cDNA 在 4 kb 片段上,包含不完 整TBP 3’端 cDNA 在 1.2 kb 片段上(圖十二B,lanes 2、3、4)。

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(三) pGEX-5X-3-GST-HMGB1 重組質體

以限制酶 EcoRI 切割 pGEX-5X-3-GST-HMGB1 重組質體,經洋 菜膠體電泳檢查,切出包含HMGB1 的 700 bp 片段(圖十三,lane 2),

以限制酶 BamHI 切割,則切出包含 HMGB1 5’端 cDNA 的 300 bp 片 段(圖十三,lane 4)。

(四) pcDNA3-nTBP-Q20/Q45/Q61、pcDNA3-fTBP-Q45/Q61重組質體

以 限 制 酶 EcoRI 切 割 pcDNA3-nTBP-Q20/Q45/Q61 、 pcDNA3-fTBP-Q45/Q61重組質體,經洋菜膠體電泳檢查,分別切出包

含不完整 TBP-Q20、-Q45、-Q61或完整 TBP-Q45、-Q61的 475、550、

598、1050、1098 bp 片段(圖十四A,lanes 2~6); 限制酶 EarI 則分別 切出包含Q20、Q45、Q61的150、225、273 bp 片段(圖十四B,lanes 2~6);

限制酶 PstI 切割時,TBP Q20、Q45、Q61包含在4 kb 片段上,不完整 及完整的TBP 3’端 cDNA 則分別包含在 200、700 bp 片段上(圖十四 C,lanes 2~6)。

(五) pcDNA3-GST-HMGB1 重組質體

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以限制酶 BstBI 切割 pcDNA3-GST-HMGB1 重組質體,經洋菜膠 體電泳檢查,切出包含HMGB1 及 GST 3’端的 3 kb 片段(圖十五,lane 2),以限制酶 HindIII + EcoRI 切割,則切出包含 GST 的 660 bp 片段(圖 十五,lane 4)。

四、GST 融合重組蛋白的表現

利用細菌的轉型作用,將上述二組包含完整 N 端 TBP 蛋白及全 長TBP 的重組質體送入表現宿主 BL21(DE3)細胞內,以 1 mM IPTG 誘導 3 小時後,將細胞蛋白於 12% SDS-PAGE 電泳膠中分離、進行 Coomassie blue 染色,可發現大量表現之 GST-TBP 融合蛋白,再以親

和性管柱純化融合蛋白。圖十六為pGEX-5X-3、pGEX-5X-3m-fTBP- Q20/Q45/Q61質體送入表現宿主細胞後,以IPTG 誘導 3 小時後的 12 % SDS-PAGE 電泳照片。圖中明顯可見 GST-fTBP-Q20/Q45/Q61融合蛋白 在誘導三小時的時間點下即有表現。

圖十七顯示結構、組成正確的重組質體在宿主細胞內表現的純化 後的GST-nTBP-Q20/Q45/Q61 (lanes 1 ~ 3)、GST-fTBP-Q20/Q45/Q61 (lanes 4 ~ 6)、GST (lane 7)、GST-HMGB1 (lane 8)融合蛋白。Coomassie blue

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(GST-nTBP-Q20/Q45/Q61)、62、65、67 (GST-fTBP-Q20/Q45/Q61)、26 (GST)、50 (GST-HMGB1) kDa 融合蛋白。

五、西方轉漬分析 TBP 與 HMGB1 在 HEK293FT 細胞中 的表現

如圖十八所示,我們可以在HEK-293FT 細胞中,以 GST 抗體(圖 十八 A,lane 2)以及 HMGB1 抗體(圖十八 B,lane 2)染色,來觀察 GST-HMGB1 重組蛋白的表現(約 50 kDa),以 TBP 抗體染色,來觀察 nTBP-Q61重組蛋白的表現(約 30 kDa) (圖十八C,lane 2)。

六、QCM 分析 TBP 與 HMGB1 交互作用

如圖十九所示,不同多麩醯胺長度之 N 端或全長 TBP 蛋白與 HMGB1 交互作用時,都發生頻率改變的現象。在較高濃度(0.5 mg/mL)

時,以nTBP-Q45的結合力最強(ΔHz = 13.0),nTBP-Q61的結合力最弱 (ΔHz = 4.3)。N 端和全長 TBP 蛋白與 HMGB1 的交互作用力,則無太 大的差異(nTBP-Q45、fTBP-Q45之 ΔHz 分別為 13.0、13.4)。在較低濃 度(0.2 mg/mL)時,nTBP-Q45 的結合力(ΔHz = 2.7)也大於 nTBP-Q20 (ΔHz = 2.2)、nTBP-Q61 (ΔHz = 1.7),但與全長 TBP 蛋白與 HMGB1

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的作用時頻率改變的情形並不一致(fTBP-Q20 ΔHz = 2.2,fTBP-Q45

ΔHz = 1.7,fTBP-Q61 ΔHz = 1.7)。

數據

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參考文獻

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