圖一 A 為敤馬魚仔魚馴養在不同濃度（0、10、50 和 100 µM）
的 cisplatin（0.01、0.05 和 0.1% DMSO）。圖一 B 為敤馬魚仔魚馴養 在不同濃度（0、10、50 和 100 µM）的 cisplatin（馴養水）。圖一 A 控制組與馴養 10 µM 的組別，存活率分別約為 92%和 87%，並無顯 著差異，而 50 和 100 µM 的組別，存活率分別約為 74%及 16%，與 控制組相較分別減少了 18%與 76%，呈現顯著差異。而圖一 B 控制 組與馴養 10、50 和 100 µM 的組別，存活率分別約為 92%、91%、90%
和 84%，並無顯著的差異。由圖一 C 的影像為敤馬魚仔魚分別處理 0 和 100 µM cisplatin（馴養水），100 µM cisplatin 馴養的仔魚外觀型態 有生長遲緩的現象，計算其體長有明顯下降（圖一 D），而控制組與 10、50 cisplatin 馴養的仔魚則無顯著差異。
實驗二、長時間（0-96 hpf）處理各種不同濃度的 cisplatin（0、
10、50 和 100 µΜ）馴養敤馬魚仔魚，偵測仔魚卵黃囊體表氫離子濃 度與離子細胞的氫離子排出量，並計算離子細胞數目。
圖二 A 為仔魚馴養在不同濃度 cisplatin （0.01、0.05 和 0.1%
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DMSO；0-96hpf）的組別，圖二 B 為仔魚馴養在不同濃度 cisplatin（馴 養水；0-96hpf）的組別。之後在 96 hpf 以 SIET 測量卵黃囊表面氫離 子排出量，做為整體排酸功能被抑制的指標。可以看到100 µΜ 組別 的氫離子排出皆有顯著下降（圖二 A，B），與控制組相較，氫離子排 出分別減少約 48%和 40%。圖二 C 為仔魚馴養在不同濃度 cisplatin
（0.01、0.05 和 0.1% DMSO；0-96hpf）的組別，圖二 D 為仔魚馴養 在不同濃度 cisplatin（馴養水；0-96hpf）的組別，之後在 96 hpf 以 SIET 測量離子細胞氫離子排出量做為離子細胞功能被抑制的指標。
可以看到在 10、50 和 100 µM cisplatin 的馴養之下，氫離子排出皆有 顯著下降。分別減少約 32%、44%、68%（圖二 C）和 26%、35%、
44%（圖二 D）。
圖三 A、D 和 G 為仔魚馴養在不同濃度 cisplatin（馴養水；0-96hpf）
的 HR cell、NaR cell 和 p63 的影像。圖三 B 為仔魚馴養在不同濃度 cisplatin（0.01、0.05 和 0.1% DMSO；0-96hpf）的組別，圖三 C 為仔 魚馴養在不同濃度 cisplatin（馴養水；0-96hpf）的組別。之後在 96 hpf 計算敤馬魚仔魚的 HR cell（H+-ATPase rich cell）的數目，可以看到 在馴養100 µΜ 濃度之下 HR cell 數目顯著地減少。圖三 E 為仔魚馴 養在不同濃度 cisplatin（0.01、0.05 和 0.1% DMSO；0-96hpf）的組別，
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圖三 F 為仔魚馴養在不同濃度 cisplatin（馴養水；0-96hpf）的組別。
之後在 96 hpf 計算敤馬魚仔魚的 NaR cell（Na+-ATPase rich cell）數 目，結果顯示在馴養 100 µΜ 濃度下 NaR cell 數目顯著地減少。圖三 H 為仔魚馴養在不同濃度 cisplatin（馴養水；0-96hpf）。在 96 hpf 計 算敤馬魚仔魚的表皮幹細胞 p63 數目，結果顯示在馴養 100 µΜ 濃度 下 p63 數目顯著地減少。
實驗三、短時間（30 分鐘）處理各種不同濃度的 cisplatin（0、100、
500、750 和 1000 µΜ）
，測量敤馬魚仔魚（72hpf）卵黃囊體表氫離子濃度與離子細胞的氫離子排出量，並計算離子細胞和富含粒腺體細 胞數目。
圖四 A 為仔魚浸泡在不同濃度 cisplatin（0.5 和 1% DMSO）30 分鐘後，以 SIET 測量卵黃囊表面氫離子排出量，做為整體排酸功能 被抑制的指標。結果顯示控制組與處理組並無顯著差異。圖四 B 為 72 hpf 仔魚浸泡在不同濃度 cisplatin（0.1、0.5、0.75 和 1% DMSO）
30 分鐘的組別，圖四 C 為 72 hpf 仔魚浸泡在不同濃度 cisplatin（馴養 水）30 分鐘的組別。之後再以 SIET 測量離子細胞氫離子排出量做為 離子細胞功能被抑制的指標。可以看到在濃度1000 µΜ 的組別，氫 離子排出有顯著減少，分別減少約 44%和 39%（圖四 B，C）。
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圖五 A 和 C 為敤馬魚仔魚（72hpf）分別浸泡在 cisplatin（馴養 水）30 分鐘以 mitotracker 和 rhodamin 123 螢光染劑染富含粒腺體細 胞數目的影像。圖五 B 和 D 分別為浸泡 cisplatin（馴養水）30 分鐘 分鐘後的量化圖。在1000 µΜ cisplatin 的處理之下，敤馬魚仔魚富含 粒腺體細胞數目有顯著下降，分別減少約 30%和 34% （圖五 B 和 D）。
圖六 A 和 C 為敤馬魚仔魚（72hpf）分別浸泡在 cisplatin（馴養 水）30 分鐘 HR cell 和 NaR cell 的影像。圖六 B 和 D 分別為浸泡 cisplatin
（馴養水）30 分鐘分鐘後的量化圖。在 1000 µΜ cisplatin 的處理之下，
敤馬魚仔魚離子細胞數目皆無顯著下降（圖六 B 和 D）。
實驗四、長時間（0-96 hpf）處理各種不同濃度的 cisplatin（0、
10、50 和 100 µΜ）馴養敤馬魚仔魚，偵測仔魚側線毛細胞對鈣離子 流入量的影響。
圖七 A 為仔魚馴養在不同濃度 cisplatin（0.01 和 0.05 % DMSO；
0-96hpf）的組別。圖七 B 為仔魚馴養在不同濃度 cisplatin（馴養水；
0-96hpf）的組別。在 96 hpf 以 SIET 測量毛細胞機械性通道的鈣離子 流入量做為毛細胞功能的指標。可以看到 cisplatin 馴養濃度 10 和 50 µΜ 的組別，鈣離子流入量減少約 67%、74%和 51%，呈現顯著差異。
實驗五、抗氧化水對毛細胞的保護作用。長時間（0-96 hpf）處理各
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種不同濃度的 cisplatin（0、10、50 和 100 µΜ）馴養敤馬魚仔魚，偵 測仔魚側線毛細胞對鈣離子流入量的影響，並計算毛細胞數目。
圖九 A 為敤馬魚仔魚（0-96 hpf）分別馴養在 cisplatin（馴養水）
及 cisplatin（抗氧化水）之下，可以看到在 10 µΜ cisplatin（馴養水）
的處理之下毛細胞的鈣離子流量明顯的減少約 59%。而在 10 µΜ cisplatin（抗氧化水）的處理之下毛細胞的鈣離子流量則沒有減少。
圖八 A 和 B 為敤馬魚仔魚（0-96 hpf）分別馴養在 cisplatin（馴 養水）及 cisplatin（抗氧化水）之下，側線毛細胞的共軛焦顯微鏡
（confocal）影像。圖八 C 和 D 分別為 cisplatin（馴養水）及 cisplatin
（抗氧化水）細胞數目量化圖。可以看到在10 µΜ cisplatin（馴養水）
馴養之下，毛細胞數目顯著減少約 52% （圖八 C），而在 10 µΜ cisplatin（抗氧化水）馴養之下毛細胞數目則沒有減少，無顯著差異。
實驗六：長時間（0-96 hpf）處理不同濃度的 cisplatin（0 和 100 µΜ）
馴養敤馬魚仔魚，測量 ROS 含量。
圖九 B 為 ROS 含量，10 µΜ cisplatin（馴養水）的處理之下 ROS 含量明顯增加約 247%，而在 10 µΜ cisplatin（抗氧化水）的處理之 下 ROS 含量則沒有顯著變化。
實驗七：短時間（30 分鐘）處理各種不同濃度的 cisplatin（0、100、
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250、500 和 1000 µΜ）
，測量敤馬魚仔魚（72hpf）側線毛細胞對鈣離子流入量的影響。
圖十 A 和 B 為仔魚（72 hpf）分別浸泡在不同濃度 cisplatin（0.1、
0.25、0.5 和 1% DMSO）和 cisplatin（馴養水）30 分鐘的處理。之後 以 SIET 測量毛細胞機械性通道的鈣離子流入量做為毛細胞功能的指 標。可以看到在 500 和 1000 µΜ 的處理之下鈣離子流入有明顯減少，
與控制組比較約減少 80%、86%和 67%、78%。
實驗八：短時間（連續 30 分鐘）處理 cisplatin（500 µΜ）測量敤馬 魚仔魚（72hpf）同一顆神經丘上毛細胞的鈣離子流入量。
圖十 C 以 SIET 連續測量毛細胞 30 分鐘，紅色箭頭為加入 500 µM cisplatin（馴養水），在加入 cisplatin 後毛細胞鈣離子流入逐漸降低，
在 20 至 30 分鐘時，鈣離子流入約減少 66%。
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討論
DMSO 的毒性
DMSO 是給藥時常用的溶劑，然而在最近的研究（Uribe et al., 2013）中，指出 DMSO（Dimethyl sulfoxide；0.5%）會加劇 cisplatin 誘發敤馬魚仔魚側線毛細胞的死亡。在文獻研究中，比較 5 dpf（day postfertilization）敤馬魚仔魚處理 1 mM cisplatin 4 個小時，以及除了 cisplatin 之外另外加入不同濃度 DMSO（0.001%、0.005%、0.01%、
0.05%、0.1%和 0.5%），結果顯示在有加入 DMSO（0.01%、0.05%、
0.1%和 0.5%）的組別比單獨處理 cisplatin，其仔魚側線毛細胞的死亡 數目顯著的增加。而在本論文實驗結果顯示，由 Fig. 1 的結果可得知 DMSO（0.05%和 0.1%）會加劇 cisplatin 所導致敤馬魚仔魚（0-96 hpf）
的死亡。然而並不影響敤馬魚仔魚側線毛細胞和離子細胞的發育與功 能（Fig. 2、3、7）。雖然還不知道 DMSO 增加 cisplatin 藥性的機制，
在將來使用 DMSO 為藥物溶劑時必頇考慮到他對藥物的協同作用 (synergistic effect) 。
利用 SIET 測量敤馬魚仔魚體表離子細胞做為腎毒性藥物篩 選方法的建立
在前人（Shiraishi et al., 2000）的研究中，使用大鼠（5mg/ kg）
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做為模式，給予cisplatin兩天後，觀察到H⁺-ATPase活性明顯的下降，
這結果表示cisplatin造成腎臟上皮細胞的損傷，進而影響了腎小管的 功能，導致近端腎小管的酸中毒。以敤馬魚仔魚做為cisplatin腎毒性 藥物測詴的研究（Hentschel et al., 2005）中，藉由注射到仔魚（48 hpf）
心臟靜脈竇（4.6 nl，濃度1.5 mg/ml）的方式，在96 hpf 觀察到菊糖 清除率下降，前腎管的病理組織學呈現上皮細胞空泡化
（vacuolization）、刷狀緣（brush border）部分消失的現象。因此cisplatin 在哺乳動物所引發的腎毒性，也在敤馬魚仔魚的前腎器官上出現典型 的病理組織學變化及腎功能的下降。然而在魚類仔魚時期，前腎大部 份的功能是在仔魚體表執行的，因此仔魚體表的細胞功能與型態都與 腎臟的功能與型態比較相近（Chang and Hwang, 2011）。本論文以仔 魚體表組織為模式，分析cisplatin的確對子魚體表離子細胞功能的影 響。
在本論文實驗結果顯示長時間（0-96 hpf； Fig. 2A、B）處理 cisplatin的敤馬魚仔魚，可以發現在100 µΜ的濃度處理之下顯著地抑 制敤馬魚仔魚體表整體的排酸。而在10、50和100 µΜ的濃度處理之 下顯著地抑制離子細胞的細胞功能（Fig. 2C、D）。從細胞染色的結 果也可發現在100 µΜ的濃度處理之下仔魚卵黃表皮HR cell
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（H+-ATPase rich cell）與NaR cell（Na+-ATPase rich cell）的數目顯著 地減少（Fig. 3A－F）。以p63抗體標定表皮幹細胞的結果顯示在100 µΜ的濃度處理之下，表皮幹細胞數目也同樣顯著地減少（Fig. 3H）。
這些結果顯示cisplatin不但會降低單一離子細胞的排氫功能，也會降 低離子細胞的發育以及數目，最後使得仔魚整體的排酸降低。
另一方面在短時間（30 min）處理cisplatin的實驗結果顯示，仔 魚整體的排酸並沒有顯著降低（Fig. 4A），但測定單一顆離子細胞的 功能則可以發現在1000 µΜ的處理之下顯著地降低細胞氫離子排出 的流量（Fig. 4B、C）。顯示在1000 µΜ的濃度之下，雖然整體看不出 影響，但在細胞的層次上已經可以看到有抑制的現象。
由於文獻指出cisplatin會造成粒線體的傷害（Miller et al., 2010），
所以本論文以短時間（30 min）浸泡cisplatin並以粒線體染劑標定仔 魚（72 hpf）體表的細胞粒線體。在1000 µΜ處理下敤馬魚仔魚富含 粒線體細胞數目顯著下降（Fig. 5B、D）。而離子細胞數目並無減少
（Fig. 6B、D）。由富含粒腺體細胞數目降低可知cisplatin確實會降低 粒線體數目，而粒線體數目的降低減少了ATP的產生進一步可能影響 敤馬魚仔魚離子細胞氫離子經由H+-ATPase的排出。
在本實驗中以SIET技術做為測量敤馬魚仔魚體表整體排酸與單
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一顆離子細胞氫離子排出功能，相較於前人的方法，本實驗更為直接 觀察到cisplatin對於敤馬魚仔魚體表排酸與離子細胞排酸功能的影響，
提供更直接的數據顯示出cisplatin如何影響此類專門進行離子運輸功 能的離子細胞的影響。
利用SIET測量cisplatin對於敤馬魚仔魚側線毛細胞機械性通 道功能的影響
在評估cisplatin造成毛細胞受損與死亡的研究中，前人使用5 dpf
在評估cisplatin造成毛細胞受損與死亡的研究中，前人使用5 dpf