(五) 芝麻 lignan compounds 於大白鼠的代謝途徑

1. Sesamol、Sesaminol triglucoside 及 Sesaminol 之胃腸道模擬系統穩定試驗及大鼠肝臟酵素代謝反應在Sesamol、Sesaminol triglucoside 及 Sesaminol 之分析方法確立，標準曲線和樣品處理回收率分別為：Sesaminol triglucoside 標準曲線為 y = 0.1554x + 0.0077 R² = 0.9954，在胃液回收率 129.12 ± 2.89％，

在腸液回收率138.34 ± 3.00 ％，於肝臟酵素系統回收率 112.64 ± 0.134 ％；Sesaminol 標準曲線為 y = 0.4939x - 0.0194 R² = 0.9999，在胃液回收率 71.91 ± 0.36 ％，在腸液回收率 87.39 ± 11.0 ％，於肝臟酵素系統回收率70.98 ± 3.12 ％；Sesamol 標準曲線為 y = 0.3733x + 0.0036 R² =0.9999，在胃液回收率 92.62

± 2.20 ％，在腸液回收率 93.62 ± 1.47 ％，於肝臟酵素系統回收率 91.34 ± 0.31 ％。

Sesamol、Sesaminol triglucoside 在胃腸道模擬系統中，胃酸的低酸性環境下，並未造成 Sesamol 及 Sesaminol triglucoside 降解，如圖三十二及圖三十三所示，且胃腸模擬液酵素並未對此兩種化合物產生作用。在大鼠肝臟酵素代謝試驗中，Sesamol、Sesaminol triglucoside 並未受到肝臟酵素代謝成其他代謝物。對於Sesaminol 在胃液中並不穩定(圖三十一)，在很短反應時間產生降解作用，經過 LC/MS/MS 分析後，確認生成Sesaminol isomer，但是此兩種物質在酸性環境下，皆不穩定推測可能降解成其他物質。

相同的，Sesaminol 經大鼠肝臟酵素代謝反應後，則有產生 methylenedioxyphenyl 基團產生開環之代謝產物，如圖三十所示。

2. Sesamol、Sesaminol triglucoside 及 Sesaminol 之大鼠體內代謝物分析

在Sesamol 代謝物分析試驗中，以管灌餵食 100mg/kg BW Sesamol，結果發現在大鼠尿液經 phase II 酵素(sulfatase 及 β-glucuronidase)水解後 TMS 衍生化分析中，如表二十七所示，以氣相層析質譜儀發現測得分子量210、284 及 342 代謝物，代謝物分子量 210 其子離子片段 195、165、137、97 及 73，而分子量284 其子離子片段 241、185、129 及 73，另外在分子量 342 其子離子片段 342、327、267、254、

239、211、179 及 73。

Sesaminol 經過 LC/MS/MS 分析後，可產生分子量 m/z 369 之[M-H]^-離子，並使用離子撞擊片段化分析(collision induced dissociation, CID)，因此可得到母離子之碎片資訊，其 MS/MS 離子片段則有 m/z 339、219、191、163 之[M-H]^-片段(如圖二十九所示)。

在大鼠模式餵食Sesaminol 及 Sesaminol triglucoside，分別給予 220、500mg/kg。進行大鼠體內各組織中代謝物生成，並以LC/MS/MS 分析，依離子片段解析其代謝物結構。

在餵食Sesaminol triglucoside 組別，如表二十五所示，在直腸部位測得 MST-3(m/z 359)、MST-7 (m/z 297)及 MST-1 (m/z 369；不帶糖基 Sesaminol)之[M-H]^-離子；在大腸部位測得MST-3 (m/z 359)、MST-2 (m/z 357)、MST-7 (m/z 297) 及 MST-1 (m/z 369)之[M-H]^-離子。在盲腸部位測得MST-3 (m/z 359)、MST-2 (m/z 357)、MST- 7 (m/z 297) 及 MST-1 (m/z 369)之[M-H]^-離子；而在大鼠血漿中則可測得MST-3 (m/z 359)、

MST-5 (m/z 361)、MST- 7(m/z 297)及 MST-1 (m/z 369)之[M-H]^-離子；但在大鼠腦部只能測得MST-1 (m/z 369；不帶糖基 Sesaminol)之[M-H]^-離子；在肺臟只能測得MST- 3 (m/z 359)之[M-H]^-離子；在心臟則有測得MST- 3(m/z 359) 及 MST-1 (m/z 369)之[M-H]^-離子；在腎臟只能測得MST-1 (m/z 369；不帶糖基 Sesaminol) 之[M-H]^-離子；在肝臟測得MST- 7(m/z 297) 及 MST-1 (m/z369；不帶糖基 Sesaminol)之[M-H] -離子。

在餵食Sesaminol 組別，如表二十六所示，在小腸部位測得 MS-2 (m/z 359)、MS-3 (m/z 373)、MS-5 (m/z 345)、MS-4 (m/z 361)、MS-1 (m/z 357)及 MS-7 (m/z 297)之[M-H]^-離子；在直腸及大腸部位測得MS-2 (m/z 359)之[M-H]^-離子；在盲腸部位測得MS-2 (m/z 359)、MS-4 (m/z 345)、MS-3 (m/z 373)、MS-5 (m/z 361)、MS-1 (m/z 357)及 MS-7 (m/z 297)之[M-H]^-離子；在其他組織只有腦部及腎臟測得MS-2 (m/z 359) 之[M-H]^-離子。

在大鼠排除物之代謝物LC/MS/MS 分析，如表二十四所示，餵食 Sesaminol triglucoside 組別中，在糞便中測得MST-3 (m/z 359)、MST-2(m/z 357)、MST-6 (m/z 301)、MST-4 (m/z 377)、MST-7 (m/z 297)及 MST-1 (m/z 369；不帶糖基 Sesaminol)之[M-H]^-離子；代謝物經體循環後於尿液中，可測得MST-3 (m/z 359)、MST-2 (m/z 357)、MST-5 (m/z 361)、MST-7 (m/z 297)及 MST-6 (m/z 301)之[M-H]^-離子。餵食 Sesaminol 組別中，在糞便中測得 MS-2 (m/z 359)、MS-6 (m/z 377)、MS-8 (m/z 297)及 MS-7 (m/z 301)之 [M-H]^-離子；代謝物經體循環後於尿液中，也可測得MS-2 (m/z 359)、MS-1 (m/z 369)及 MS-7 (m/z 301) 之[M-H]^-離子。

在Sesaminol 及 Sesaminol triglucoside 代謝物經 LC/MS/MS 分析，在大部分組織及排泄物中，測得分子量m/z 301、297 (MST-7 及 MS-8)之[M-H]^-離子，此化合物與Jansen 等人(2005)質譜結果，經 LC/MS/MS 二次質譜分析，在則有相同離子片段(m/z 253、189)，推測此物質為 enterolactone，所以 Sesaminol 及 Sesaminol triglucoside 由大鼠消化吸收後， lignan 受腸內菌經去糖基、還原、去甲基及去氫氧基反應後，

降解成enterolactone。

在天然物中lignan 之代謝途徑，Lampe 等人(2006)指出植物 phytoestrogen 之 lignan 化合物受到腸道微生物作用，代謝生成enterodiol、enterolactone，secoisolariciresinol diglucoside 在人體攝取後，經腸道微生物代謝及腸道吸收，攝取後8-10 小時可在血漿中測得，結合態代謝產物 sulfate 及 glucuronic acid 在腸壁及肝臟產生結合作用，主要結合態代謝產物為glucuronides。Lignan 在植物體中，大部分以配糖體形式存在，經攝取後被水解成aglycone，受到腸道微生物之 β-glucosidase 及小腸絨毛上 β-glucosidase 水解(Rowland et al., 2003)。Aglycone 經吸收或由微生物代謝成 enterolignans，matairesinol 及

secoisolariciresinol diglucoside 經 dehydroxylated 及 demethylated 生成 enterolactone 和 enterodiol。微生物可將enterodiol 氧化成 enterolactone，但是在體內試驗則無法將 enterolactone 還原成 enterodiol (Setchell et al., 1988)。然而，以人類糞便與 lignan 共同培養，則可生成 enterolactone 和 enterodiol (Thompson and others, 1991, Rickard and others, 1996, Borriello and others 1985)。matairesinol 及 secoisolariciresinol diglucoside 為植物體中常見lignan 化合物，除此之外尚有 pinoresinol diglucoside、7-hydroxymatairesinol 及 lariciresinol 皆可經由腸道微生物可轉變成enterolactone 和 enterodiol (Heinonen et al., 2001 和 Wang et al., 2001)。並且發現lignan 化合物在人類糞便微生物則有不同轉化率，secoisolariciresinol 轉化成 enterolactone (21 %) 和enterodiol (50 %)，pinoresinol diglucoside 轉化成 enterolactone (19 %)和 enterodiol (32 %)，另外 lariciresinol 轉化成 enterolactone (46 %)和 enterodiol (55 %)，相反的，isolariciresinol 則不法轉化代謝成 enterolignan，而 matairesinol 只能轉化成 enterolactone (62 %)( Heinonen et al., 2001)。Wang 等人(2001) 在 secoisolariciresinol diglucoside 腸道代謝分離出 Petostreptococcus sp. SDG-1 及 Eubacterium sp. SDG-2，可 進行demethylation 及 dehydroxylation。Clavel 等人(2005)鑑定出 P. productus SECO-Mt75m3 及 Eggerthella lenta SECO-Mt75m2 為進行 demethylation 及 dehydroxylation 反應之菌株。然而這些 lignan 化合物並非進 行相同代謝途徑，例如arctiin 在人類糞便共同培養，則只生成 enterolactone (Xie et al., 2003)。在給予 secoisolariciresinol diglucoside 後，經吸收後 lignan 代謝物 enterolactone 從尿液排除相當少或沒有(Kuijsten et al., 2005；Lampe et al., 1994；)。在 secoisolariciresinol diglucoside 轉化 enterolactone 實驗中，以 tRFLP (terminal restriction fragment length polymorphism)分析腸道微生物 16S rRNA 基因序列，發現 Bacteroides (78, 138, 220 及 258 bp)、B. distasonis (207 及 235 bp)及 Peptostreptococcus sp. (199, 297 及 305 bp)，然而，

Peptostreptococcus sp.則是影響 secoisolariciresinol diglucoside 轉化 enterolactone 之中間產物生成(Liu et al., 1997；Wang et al., 2000；Clavel et al., 2005)。

Lignan 化合物及其代謝物經吸收後，於腸道上皮細胞及肝臟之 UDP-glucuronosyl- transferases (UGT) 及sulfotransferases 進行結合態反應，並從尿液或膽汁排除，而經由膽汁排出 glucuronide，在腸道中則受

到微生物β-glucuronidase 去結合作用，可再進行腸肝循環被吸收利用(Setchell et al., 1988)。Lignan 在尿液排除形式主要為結合態，enterolactone 和 enterodiol 排除以 monoglucuronides 為主(分別為 95 %及 85

%)，而較少以 monosulfates(2-10 %形式)，另有 0.3-1 %為 free aglycones (Adlercreutz et al., 1995)。影響結合態或非結合態化合物排除作用，在腸細胞中主要為ATP (adenosine triphosphate)依賴型轉運蛋白質，可將代謝物排除胞外，例如：MRP2 (multidrug resistance associated protein 2)，在高劑量時則會影響

enterolactone 和 enterodiol 吸收(Lania-Pietrzak et al., 2005)。在人類肝臟微小體共同培養，則發現

enterolactone 和 enterodiol 可進行 aliphatic 及 aromatic hydroxylation 反應，生成二次代謝產物(Jacobs et al., 1999)。這些二次代謝產物在尿液中，已確認為結合態形式(佔總 lignan ≦5 %)。enterolactone 和 enterodiol 經過Phase I 酵素作用很少，而在腸道上皮細胞(Jansen et al., 2005)和肝臟(Dean et al., 2004)快速進行 glucuronidation 反應。Kuijsten 等人(2005)先將樣品經由酵素(β-glucuronidase 及 sulfatase)水解成

aglycones，檢測血漿中 enterolignan 總量，以時差式螢光(Time-Resolved Fluoremetry)檢測 enterolactone 濃度(0.35nM)，GC/MS 偵測 enterolactone 和 enterodiol 濃度為(0.2-1.0 nM)，而 LC/MS 則檢測出

0.15-3.5nM，LC-coularray 則檢測出 1.9-2.1nM。Enterolignan 攝取 8-10 小時後，進入體循環，enterolactone 和enterodiol 在血漿中最高濃度時間分別為 19.7 及 14.8 小時；平均滯留時間 (mean residence time；MRT) 分別為35.8 及 20.6 小時；血漿中最高濃度為 56 及 73 nmole/L (Kuijsten et al., 2005)。同樣的，Penalvo 等人(2005)給予受試者芝麻(50 g)，24 小時在血漿中分別測得 enterolactone 和 enterodiol 濃度為 567 及 699 nmol/L。Horner 等人(2002)以 193 受試者中，測得 enterolactone 濃度為 24.7 ± 26.1 nmol/L，而有 17 %受試者enterolactone 濃度低於 1.2 nmol/L。在人類乳癌細胞株(MCF-7)發現高劑量 enterolactone (20-90 μM) 可以抑制DNA 合成，但是低劑量(0.1-10 μM)則可誘導 DNA 合成，在 Horner 等人(2002)之人體試驗中，

enterolactone 在體內濃度很低，在此濃度下，對人類乳癌細胞株(MCF-7)則是進行誘導細胞生長作用，而非抑制作用(Wang et al., 1997；Wang et al., 2002)。另外在 enterolignan 對於雌激素受體(ERs；estrogen receptor)α 及 β 親和性試驗，enterolactone 對於 ERs α 及 β 之 IC50 (抑制螢光標記 estradiol 與 ER 鍵結)分別為6.7 ± 4.3 μM 及 39 ± 22 μM，相對親和力(以 diethylstilbestrol 親和力為 100)方式表示，enterolactone 對於ERs α 及 β 分別為 0.07 及 0.01。

在Sesaminol triglucoside 代謝途徑，如圖三十四所示，首先去除糖基之部位為十二指腸及空腸，所存在部位有：腸腔(intestinal lumen)、刷狀緣水解酶(brush border hydrolase)、水解酶胞內(intracellular hydrolase)，經由水解成 aglycone 再運送至腸道細胞（enterocyte）內，由腸道中酵素去除糖基，並運送黏膜(mucosal)及漿膜層(serosal)( Crespy et al., 2001)，或受到腸內菌 β-glucsidase 水解成 sesaminol (MST-1)，接著可進行三種代謝途徑，由還原反應及去甲基化作用產生 MST-2，另有還原反應及去甲基化作用產生MST-3，此兩種代謝物可由還反應生成 MST-5。另外 MST-1 可直接還原 methylenedioxyphenyl 基團產生開環，進而產生MST-4 代謝物。MST5 及 MST-4 分別進行還原、去羥化、去甲基化及去甲氧基作用，生成MST-6 (enterodiol)，最終氧化成 MST-7 (enterolactone)。另外在 MST-4 可進行另外一條代謝途徑，進行enterodiol 代謝途徑 I 及 II。

Sesaminol 代謝途徑，如圖三十五所示，經還原反應及去甲基化作用，生成具有 catechol 基團之 MS-1 及MS-2 代謝物，若只進行還原反應則產生 MS-3 代謝物，而 MS-1 代謝物進行還原反應及去甲基化作用，

生成具有dicatechol 基團之 MS-4 代謝物。MS-2 及 MS-3 代謝物結構上 hydrofuran 產生開環反應，分別產生MS-5 及 MS-6。具有 dicatechol 基團之 MS-4 代謝物，則可受到 catechol-O-methyltransferase 酵素，

催化SAM 轉移甲基至 MS-4 之 catechol 基團上，轉變成 MS-2。在含有 catechol 基團之 MS-4、MS-5 及 MS-6 代謝物，分別進行還原反應、去羥化、去甲基化及去甲氧基作用，生成 MS-7 (enterodiol)，最終氧化成MS-8 (enterolactone)。另外在 MS-6 可進行另外一條代謝途徑，進行 enterodiol 代謝途徑 I 及 II。

3. Sesamol 代謝途徑探討

Sesamol原型態(benzo[d][1,3]dioxol-5-ol)分子量為138，受到TMS衍生化後，結構上具有氫氧基，接上三甲基矽(TMS 72Da)，其m/z為210；而分子量為284代謝物之經體內還原後，產生methylenedioxyphenyl 基團開環反應，生成catechol或methoxy catechol基團，結構上具有兩個氫氧基，可接上兩個三甲基矽(TMS 72 Da) 其m/z為284 (2-methoxybenzene-1,4-diol)。另外分子量342為methoxy catechol經去甲基化作用後，

結構上具有三個氫氧基，可接上三個三甲基矽(TMS 72 Da) 其m/z為342(benzene-1,2,4-triol)，這些結果與 Nakai等人(2003)及Liu等人(2006)動物實驗中，sesamin之methylenedioxyphenyl基團有相同代謝反應。由此可推測Sesamol受到腸道微生物作用，如圖三十七所示，可將Sesamol原型態(benzo[d][1,3]dioxol-5-ol) 經還原反應及去甲基化作用，生成methoxy catechol或catechol基團或受到腸道細胞內

catechol-O-methyltransferase (COMT) 酵素將benzene-1,2,4-triol甲基化，再經腸道吸收後，並由肝門靜脈 運送至肝臟代謝，或再透過膽汁至腸道排除，而透過肝臟代謝後，進入體循環，代謝物可經由血液運送至腎臟排除。

Murray等人(2000)發現sesamin經由氧化反應之生物轉化作用，及對於methylenedioxy- phenyl基團去甲基化作用，生成hydroxylated catechol代謝物。而在這些反應所進行位置， Scott等人(2001)發現在人類小腸上皮細胞對於口服來源物質，可先與胞內酵素cytochrome P450 (CYP 450)進行代謝反應。通常酚類化合物之結合態代謝物主要在肝臟生成，但是Phase II反應則是在腸道發生(Jansen e al., 2005)。Sesamol 及其結合態代謝物可經由腸道吸收後，透過肝門靜脈運送，最後以Phase II結合態或catechol代謝物形式排除。另有排除機制經由腸道細胞之ATP-binding cassette transporters排除至腸腔中。

4. Sesaminol 及 Sesaminol triglucoside 代謝成 enterodiol 代謝途徑探討

在大鼠模式餵食Sesaminol 及 Sesaminol triglucoside，分別給予 220、500mg/kg，進行大鼠體內各組織中代謝物生成，並以LC/MS/MS 分析，依離子片段解析其代謝物結構，如表二十八所示。在餵食 Sesaminol triglucoside 組別，在尿液部位測得分子量 m/z 359 之[M-H]^-離子(不帶糖基 Sesaminol)；而 enterolactone 及 enterodiol 代謝物之質譜結果，發現在 enterodiol 代謝途徑 I 中 MI-1 (377)、MI-2 (359)、

MI-3 (373)及 MI-4 (387)之[M-H]^-離子，而enterodiol 代謝途徑 II 中 MII-1 (377)、MII-2 (359)、MII-3 (373)、

MII-4 (355)、MII-5 (355)及 MII-6 (326)之[M-H]^-離子。其子離子片段在enterodiol 代謝途徑 I 中，MI-1 代謝物可測得283、271、257 及 231 [M-H]^-離子，MI-2 代謝物可測得 359、341、329、311 及 221 [M-H] -離子，MI-3 代謝物可測得 373、343、325、306、293、265、233、218 及 203 [M-H]^-離子，MI-4 代謝物可測得389、307、263 及 229 [M-H]^-離子。而enterodiol 代謝途徑 II 中，MII-1 代謝物可測得 283、271、

257 及 231 [M-H]^-離子，MII-2 代謝物可測得 359、341、329、311 及 221 [M-H]^-離子，MII-3 代謝物可測得373、343、325、306、293、265、233、218 及 203 [M-H]^-離子，MII-4 代謝物可測得 355、308、292 及252 [M-H]^-離子，MII-5 代謝物可測得 355、308、292 及 252 [M-H]^-離子，MII-6 代謝物可測得 325、

315 及 297 [M-H]^-離子。

在Sesaminol triglucoside 及 Sesaminol 代謝途徑，如圖三十六所示，中間產物 MST-4 及 MS-6 可進

在文檔中以大鼠模式探討芝麻lignan compounds 的生物可利用性(3/3) (頁 27-74)