(Low Density Lipoprotein, LDL-C)
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2. 測量葉酸、維生素 B12含量 :
利用免疫競爭法 (Competitive immunoassay) 分析，於室溫下以化學 冷光技術 (chemiluminesent technology)，採用 Bayer 公司分析葉酸、維 生素 B12之 kit package (ACS : 180® automated hemiluminesence system)。
血清葉酸正常值為 > 6.36 nmol/L，維生素 B12正常值為 > 124.98 pmol/L。
(C) 血 漿 部 分 : 分 析 受 試 者 磷 酸 比 哆 醛 (Pyridoxal 5’-phosphate ， PLP)、同半胱胺酸 (Homocysteine) 濃度。
1. 血漿磷酸比哆醛 (PLP) 濃度測定 : (a) 操作方法 --
由於維生素B6極易受到光線破壞 (Leklem, 1991)，故維生素 B6的 分析皆在微弱黃光下進行。參考Bates 等人 (1999)的方法，以高 效能液相層析法 (High Performance Liquid Chromatography
，HPLC) 分析 PLP 之濃度。於暗室冰浴條件下，加入 160 µL 血 漿、240 µL 二次水以及 400 µL TCA (10%)，混合均勻後，置於 50
℃恆溫水浴槽5 分鐘。取出，冷卻至室溫後，以高速離心機離心
(10000 rpm，4℃，10 分鐘)，取 400 µL 上清液置入另一 microtube 中，與140 µL 3.3 M K2HPO4混合均勻，再加入40 µL KCN (4 mM)，混合後，置入 50℃恆溫水浴槽 25 分鐘。取出，冷卻至室溫 後，於溶液中加入50 µL H3PO4 (2.86 M)，混勻，以過濾膜 (0.45 µm ; Millipore filter)過濾後，取 100 µL 分析。磷酸比哆醛 (PLP) 滯留 時間約為4.0 ~ 4.3 分鐘，以 PLP 標準品 (附錄 4)，作出標準曲線 (R2 > 0.99)，算出受試者血漿中 PLP 濃度 (ng/mL)，經換算後以 nmol/L 單位呈現結果。實驗的組間變異係數 (Inter-assay) 為 0.37
% (n = 20)，組外變異係數 (Intra-assay)為 1.17 % (n = 5)，再現性 (Recovery) 為 100.1 ± 2.1 % (n = 3)。以血漿 PLP 濃度 20 nmol/L 作為切點 (cut-off point)，< 20 nmol/L 視為維生素 B6缺乏 (Lui et al., 1985)。
(b) 設定 --
1) 移動相 (mobile phase)
包含75 mmol/L 的 Semicarbazide hydrochloride 及 50 mmol/L 的 KH2PO4，以 H3PO4調整酸鹼值至 2.85。
2) 幫浦流速為 1.5 mL/min 3) 螢光偵測器
excitation 波長為 325 nm emission 波長為 418 nm
4) 管柱為 Symmetry Shield RP8 (內徑 5 µm，4.6 ×250 mm I.D.，
Waters 公司，愛爾蘭)。
(c) 藥品
1) Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) : 99 %，Merck 公司，
Darmstadt，德國。
2) Phosphoric acid (H3PO4) : SHOWA 公司，昭和化學株式會社，
東京，日本。
3) Potassium cyanide (KCN) : Merck 公司，Darmstadt，德國。
4) Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) : 99.3 %，Fisher 公司，紐 澤西，美國。
5) 4-pyridoxic acid (4PA) : 95 %，Aldrich 公司，威斯康辛，美國。
6) Pyridoxal-5-phosphate (PLP) : SIGMA 公司，密蘇里，美國。
7) Trichloroacetic acid (TCA) : 99 %，Lancaster 公司，Morecambe，
英國。
8) Semicarbazide hydrochloride (H2NCONHNH2•HCL) : 99 %，Aldrich 公司，威斯康辛，美國。
(d) 儀器 – 高效能液相層析儀 (HPLC)
1) 幫浦 (Pump) : Model L-7100，HITACHI，東京，日本。
2) 自動取樣器 (Autosampler) : Model L-7200，HITACHI，東京，
日本。
3) 溫度控制器 (Temperature Controlled Rack) : HITACHI，東京，
日本。
4) 螢光檢測器 (Fluorescence Detector) : Model F-1050，HITACHI，東 京，日本。
2. 血漿同半胱胺酸 (Homocysteine) 濃度測定 : (a) 操作方法 --
由於Homocysteine 極易受到光線破壞 (Dudman et al., 1996)，故 Homocysteine 的分析在微弱黃光下進行。參考 Araki 及 Sako 等人 (1987)的方法，利用 HPLC 分析 homocysteine 之濃度。於暗室冰浴 條件下，加入200 µL 血漿、20 µL NAC (1.1mM)以及 20 µL TBP (12.3%) / DMF (1N)，混合均勻後，靜置於 4℃恆溫環境 60 分鐘。
取出後加入200 µL TCA (10%) / EDTA (1mM)並混合均勻，以高速 離心機離心 (11000 rpm，4℃，10 分鐘)，取 100 µL 上清液置入另 一microtube 中，與 250 µL Borate (0.125M) / EDTA (4 mM) Buffer (PH=9.22) 混合均勻，加入 20 µL NaOH (1.5 M)，再加入 100 µL SBD-F 混勻後，置於 60℃恆溫水浴槽 1 小時。取出冷卻至室溫後，
再經過濾，取50 µL 分析。同半胱胺酸 (homocysteine) 滯留時間 約為5.1 ~ 5.4 分鐘，以 homocysteine 標準品 (附錄 5)，作出標準 曲線 (R2 > 0.99)，算出受試者血漿中 homocysteine 濃度，單位以 µmol/L 呈現。此實驗的組間變異係數 (Inter-assay) 為 2.15 % (n = 11)，組外變異係數 (Intra-assay)為 2.87% (n=5)，再現性 (Recovery) 為99.3 ± 2.9% (n = 3)。血漿 homocysteine 濃度以 14 µmol/L 作為 切點 (cut-off point)，大於 14 µmol/L 視為高同半胺酸血症 (Selhub
(b) 設定 --
1) 移動相 (mobile phase)
包含0.1M 的 Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 及 35 mL/L Acetonitrile (CH3CN)，以 85 % H3PO4調整酸鹼值至 3.5。
2) 幫浦流速為 1.2 mL/min 3) 螢光偵測器
excitation 波長為 385 nm emission 波長為 515 nm
4) 管柱為 LiChrospher® 100 RP-18e (內徑 5 µm，4.0 ×250 mm I.D.，
Merck 公司，德國)。
(c) 藥品
1) Acetonitrile (CH3CN) : TEDIA 公司，Fairfield，美國。
2) Borate (H3BO3) : FERAK 公司，柏林，德國。
3) N,N-dimethyl-formamide (DMF) : SIGMA 公司，密蘇里，美國。
4) Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) : 99+ %，SIGMA 公司，
密蘇里，美國。
5) DL-homocysteine : SIGMA 公司，密蘇里，美國。
6) Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) : 99.3 %，Fisher 公司，紐澤西，美國。
7) N-acetyl-L-cystein (NAC) : > 99 %，SIGMA 公司，密蘇里，美國。
8) Phosphoric acid (H3PO4) : SHOWA 公司，昭和化學株式會社，
東京，日本。
9) 7-Fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazole-4-sulfonic acid (SBD-F) : SIGMA 公 司，密蘇里，美國。
10) Sodium hydroxide (NaOH) : FERAK 公司，柏林，德國。
11) Tri-n-butylphosphine (TBP) : 99 %，STREM 公司，紐澤西，美國。
12) Trichloroacetic acid (TCA) : 99 %，Lancaster 公司，Morecambe，英 國。
(d) 儀器 – 高效能液相層析儀 (HPLC)
1) 幫浦 (Pump) : PU-1580，Jasco，東京，日本。
2) 自動取樣器 (Autosampler) : AS-1555，Jasco，東京，日本。
3) 螢光檢測器 (Fluorescence Detector) : FP-1520，Jasco，東京，
日本。
四. 統計方法
資料分析使用 SAS statistical software (Version 8; SAS Institute, Inc., Cary, NC)。利用 Student’s t-test 或 Wilcoxon Two-Sample Test 比較 OSA 組與 Non-OSA 兩組體位測量、血液生化值、葉酸、維生 素 B12、血漿 PLP、homocysteine 濃度以及營養素攝取情況之差異。
利用 Chi-square 或 Fisher’s exact test 比較兩組在睡眠問卷各項問題 之差異。以 Pearson correlation 比較 RDI 與各項因子的相關性。以 multiple logistic regression，探討 OSA 與相關危險因子的危險對比 值 (odds ratio, OR)。
研究統計結果之數值皆以平均值加減標準差 (mean ± SD) 表示；統計結果設定在p ≦ 0.05，才具有統計上的意義。