先天免疫(innate immune system)

細胞會以非特異性方式來辨識並抵禦外來物感染，此免疫機制不提供

2 II. 後天免疫(adaptive immune system)

後天免疫系統為特異性免疫系統，通常需要接觸特定的病原體，產生 antigen gene-1 derived peptide-based)型疫苗，其開發過程為先找尋在人類黑 色素瘤上能驅使 T 細胞進行免疫反應的胜肽片段，再自行合成一段與此相

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同的片段來觀察能否得到相同的反應[5]。胜肽疫苗多數為人工合成，相較 於另一類蛋白質疫苗，其不會有細胞表現量不足的情況，且安全性及穩定 性更好[6]，但由於胜肽分子量較小，引發免疫反應能力較弱，因此還是需 要與其它蛋白結合來刺激免疫反應。

三、人類乳突病毒(human papillomavirus, HPV)

人類乳突病毒(human papillomavirus, HPV)主要感染在人類的上皮及 黏膜組織上，其在世界各地都被報導出具有極高的發病率及死亡率，多數 感染 HPV 的患者都因性行為而傳染至生殖器及週邊皮膚。目前約有 170 種類型的 HPV 被判別出，多數感染至人類後約六個月會被人體的免疫系 統進行排除，然而部分類型的 HPV 病毒會造成感染部位病變並發展為癌 症，依感染部位可分為皮膚型和黏膜兩型，黏膜型可再分為高風險型 (high-risk type)及低風險型(low-risk type)。第 16、18、31、33、45、52 及 58 型等則為高危險型代表，其中第 16 及 18 型最為重要。病毒致癌原因最 的 HPV 疫苗為 Gardasil 和 Cervarix，此兩種疫苗均可預防高危險型 HPV-16 與 HPV-18 這兩種型態的病毒，而 Gardasil 還可而外預防 HPV-6 與 HPV-11 的感染，現今許多國家都以倡導年輕女性或男性可接種疫苗，預防及降低 HPV 的感染。

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四、主要組織相容性複合體 (major histocompatibility complex, MHC)

I. 概述 球抗原(human leukocyte antigen, HLA)；小鼠則座落於第 17 號染色體，稱 為組織相容性抗原 II (histocompatibility antigen-II, H2)。而 HLA 複合體由 360 萬個鹼基對組成，為目前人類已知染色體中基因密度最高，多態性 (polymorphism)最豐富的區域，也因此病原體在感染人類細胞後，更佳容 易被免疫系統進行偵測，運用此特色在疫苗發展上相當具有潛力[11]。在 不同地理區域的人種上 HLA 的表現型態也會有所不同，以實驗中的對象 HLA*02 舉例說明，此對偶基因座所產生之 MHC class I，是第一個經由 X-Ray 確認其結構之 HLA class I，目前經由統計發現在全球人口中 HLA*02 的表現以歐美國家的人種最為大宗約佔 63%，亞洲地區的人種則約為 37%，

藉由此資訊來針對不同地區的人種，研究不同 HLA class I 型態，讓疫苗的 設計上能更具其專ㄧ性並發揮最大預防機制[12]。目前也有許多 MHC 胜肽 鍵結預測分析系統，如 SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/)[13, 14]以及 immune epitope database (http://www.iedb.org/)[15-19]能針對 MHC 胜肽進行 預測以及整理出已被確認之 MHC 胜肽。MHC 主要可分為兩種類型，第一 型主要組織相容性複合體(MHC class I)及第二型主要組織相容性複合體 (MHC class II)。

5 (endoplasmic reticulum)上的抗原加工相關性傳遞蛋白(transporter associated with antigen processing, TAP)導入至內質網中，並與 MHC class I 結合成一 複合體，最後經由高基氏體(Golgi apparatus)將其傳至細胞膜表面(圖 1)，內 質網上的 TAP 通常對於 9 個胺基酸左右所組成的胜肽有較好的傳輸效率，

因此與 MHC class I 結合的胜肽片段通常較短，由 8 到 10 個胺基酸所組成，

並以 N 端或 C 端作結合[11, 21, 22]，而免疫細胞 CD8⁺ T 細胞可以對呈現 出的胜肽片段進行辨識進而啟動免疫反應，MHC class I 的型態以人舉例可 細分為 HLA-A、HLA-B、HLA-C。

III.第二型主要組織相容性複合體(MHC class II)

結構由四個蛋白質所組成，主要由一個 α 鏈及一個 β 鏈所組成，其都

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現在細胞表面。MHC class II 鍵結的胜肽片段較 MHC class I 長，約 9 到 22 個胺基酸所組成，由胜肽之 N 端或 C 端結合[23]。辨識 MHC class II 的免 疫細胞為 CD4⁺ T 細胞，以人類的 MHC class II 型態舉例，可在分為 HLA-DP、

HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DN 和 HLA-DO。

五、液相層析分離技術 效能液相層析(multidimensional high performance liquid chromatography, MD HPLC)目前廣泛應用於蛋白質體學的分析，此技術彌補傳統電泳在分

實驗使用二維液相層析(two-dimensional liquid chromatography, 2D-LC)

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技術，結合兩種不同層析法進行分離，此分離機制能提高層析的解析度及 訊號數目(peak capacity)[25]。2005 年 Gilar 利用多種二維液相層析法彼此 分離之正交性(orthogonality)與訊號數目，探討二維層析分離系統的分離效 能，並依據樣品性質設計串聯不同的分離技術，以達到理想的分離效能[26, 27]。iTRAQ 標定實驗分離策略中，以一維強陽離子交換(strong cationic exchange, SCX)層析法，搭配二維逆相(reverse phase, RP)層析法最為常見，

其依據胜肽電荷數與親水性之不同分離，此搭配具有良好的正交性，進而 提高樣品分離效能[28]。

實驗中共選用三種不同的分離方法當作第一維分離。第一種為強陽離 子交換(strong cationic exchange, SCX)層析法，其為一種離子交換層析法 (ion exchange chromatography, IEC)，管柱是由親水性及陰離子聚合物的樹 脂所構成，可分離複雜樣品中性質相似的大分子，其分離原理為依據分析 物質的酸鹼性，即陰陽離子的不同。電荷不同的分析物對於管柱上的離子 交換樹脂會產生不同的親和力，藉由改變沖堤液的離子強度及 pH 值使分 析物質依序從層析管柱中沖堤出。實驗使用 poly (2-sulfoethyl aspartamide) 是強陽離子交換材料中的ㄧ種，為了使胜肽趨於帶正電荷，配置緩衝溶液 時必須使 pH 值小於胜肽等電點(isoelectric point)，再配置 KCl 溶液並將其 濃度逐漸提升，藉此將胜肽從管柱中沖堤出。

第二種所使用的一維分離方法為親水性交互作用層析法 (hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)[29]，此項技術在 1990 年 Alpert 等人提出，且於 2003 年後開始大量應用在研究上[30]。就性質而言，HILIC 固定相的材質與正相層析(normal-phase chromatography, NP)相似，但其移 動相組成較相似於逆相層析(reversed-phase chromatography, RP)，除此之外 HILIC 也如離子層析(ion chromatography)般能分析具電荷之分析物，相較 於 NP-LC 及 RP-LC，HILIC 具有許多優點，例如 HILIC 能解決 RP-LC 無 法完全分離之複雜樣品，且樣品在 HILIC 水相中溶解度有所提升，能克服

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在 NP-LC 中溶解度不佳的情況，除此之外使用 HILIC 時不需要使用昂貴 的離子對試劑，因此也能串聯至質譜並直接分析，HILIC 本身能分離具電 荷之分析物，若分析物為兩性物質，但極性太大以至於無法滯留於 RP-LC 管柱中，也能使用 HILIC 分離[31]。綜合以上能發現，HILIC 同時具有 NP-LC、

RP-LC 及 IC 的性質外也能提供不同層析技術間互補的效果，此外也有文 獻提出在二維層析技術中，使用 HILIC-RP 替代目前最廣泛使用的 SCX-RP 來分離胜肽是具有相當的潛力[29]。就目前的資訊中得知分析物會依極性 及電荷來進行分離，但詳細的作用機制目前還無法了解，實驗所使用 HILIC 的固定相材質為 silanol，而移動相使用不同比例乙腈(acetonitrile, ACN)及 固定濃度甲酸銨(ammonium formate)進行配置，依比例將乙腈由高濃度逐 漸降至低濃度來進行沖堤，使分析物進行分離。

最後以 OFFGEL 等電聚焦分級分析儀 (solution isoelectric focusing, sIEF)當第一維分離(圖 3)，並以 RP 層析進行第二維分離[32-34]。2008 年 Guette 等人使用 OFFGEL 以及 SCX 進行一維分離來分析 iTRAQ 標定的胜

9 析物的質量。早期使用的游離法為電子碰撞游離法(electron ionization, EI) 及化學游離法 (chemical ionization, CI)[38]，但此游離法之分析物必需為高 揮發性且分子量不可過大，因此無法有效偵測生物大分子。直到 1980 年 末 Fenn 提 出 使 用 電 噴 灑 游 離 法 (electrospray ionization, ESI)[39] 以 及 Hillenkamp、Tanaka 等人利用基質輔助雷射脫附游離法(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)[40]偵測到蛋白質分子，游離法的技術才有所 突破，並促使質譜技術由分析小分子拓展至生物大分子，而在蛋白質分析 領域中更是成為了一項不可或缺的工具[41]。

電噴灑游離法(圖 4)為實驗中所使用的游離法，毛細管在正電場模式

10 價電荷的氣相離子進入質量分析器。ESI 具備 concentration-dependent 的特 性，實驗參考 Goodlett 提出的 nanoLC 分流進樣系統[43](圖 5)並做進一步 的改進，可增加質譜偵測微量樣品的靈敏度，系統的組成包含 Agilent 1100 series HPLC、QSTAR XL 質譜儀上的十向閥、peek microtee (IDEX Health &

Science, US)接頭、連接高電壓的 metal union、pre-column、RP-µ LC column 及提供背壓(back pressure)連接系統各段的管路毛細管(50 µm I.D.)。當系統 為 load-mode，連接於質譜上的十向閥為開啟的狀態，而 RP-µLC column 提供高背壓因此分析物及移動相皆通過 pre-column，此時分析物會被保留 於 pre-column 中，未被滯留於管柱中的物質及移動相則進入廢液桶，經由 一段時間沖堤達到 on-line 去鹽的效果；處於 injection mode，十向閥為關 閉的狀態，因此移動相則在通過 pre-column 後直接通往 RP-µLC column，

在 metal union 上提供高電壓，並經由 liquid junction 使通過 RP-µLC column 的分析物及移動相進行電噴灑游離。

串聯式質譜法(tandem mass spectrometry, MS/MS)是現今鑑定蛋白質最 佳的工具[44-46]。實驗設計上將 iTRAQ 標定的樣品以 SCX、HILIC 及 sIEF 進行第一維分離降低樣品複雜度，並以 RP-µLC column 作為第二維分離，

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再搭配 Q-TOF 串聯式質譜儀(QSTAR XL, Applied Biosystems Sciex)來鑑定 蛋白質的身分(圖 6)，Q-TOF 的質量分析器包含了四極桿(quadrupole)與飛 (collision-induced dissociation, CID)撞碎[47]，維持 RF-only 模式時內部會填 充少量氣體分子如氮氣或氬氣，氣體分子能增加四極桿的傳輸效率也能與

Q-TOF 的離子偵測器為微通道盤(microchannel plate, MCP)，MCP 會收集 大量電子產生一脈衝電流，並轉換送至 訊號收集儀器 (time to digital

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的衍生物，接者在酸性環境下處理，會使其環化並選擇性將胜肽鍵的 N 端 切除一個胺基酸。在酸性條件下此衍生物不穩定會繼續與胜肽鏈反應，形 成穩定的苯基乙內醯硫脲（PTH）衍生物，通過高效能液相層析儀(high performance liquid chromatography, HPLC)或電泳分析 PTH-胺基酸，多次反 應後便可得到胜肽序列的資訊。此方法已有一套自動化的流程，但多次反 應循環後其效率會逐漸降低，最多只能偵測到 30 個胺基酸，若鑑定的胜 肽過長，可先經由酵素水解成較小的片段，依序分析後再拼湊出完整的序 列資訊。近年隨著質譜技術的發展，於蛋白質身分的鑑定主要有兩種方法:

I.胜肽質量指紋(peptide mass fingerprinting, PMF)

胜肽質量指紋(peptide mass fingerprinting, PMF)[50]，蛋白質在經過純 化分離後會以蛋白水解酶，如 trypsin、Glu-C、Lys-C 等進行水解(digestion)，

而不同的水解酵素所辨認的切點不同，例如 trypsin 會辨識 arginine 及 lysine 的羧基為切點，並將蛋白質水解成胜肽，水解後的胜肽因胺基酸的組合不

而不同的水解酵素所辨認的切點不同，例如 trypsin 會辨識 arginine 及 lysine 的羧基為切點，並將蛋白質水解成胜肽，水解後的胜肽因胺基酸的組合不