經由流式細胞儀的檢測結果，我們發現 HL-60 經過 morin 處理過後，會使得細 胞產生凋亡的現象。因此，更進一步探討與進行細胞凋亡相關蛋白的活性是否受 到影響。參與細胞凋亡的蛋白質當中，較具有指標性的有 caspase-9、caspase-3、
bcl-2 家族蛋白等。於是藉由西方墨點法檢測這些相關蛋白質的表現量。
HL-60 (1 x 107 cells/mL)給予不同濃度( 0、100、200、300、400、500 µM )的 morin，經過 24 小時培養後，抽取細胞蛋白質，利用西方墨點法分析參與細胞凋 亡之蛋白相對含量變化，再以 alpha Image 2200 軟體量化。
1) caspase-9（46 KDa）與 ß-actin 相對含量分別為 1.1、0.7、0.4、0、0、0；呈現 活性下降的趨勢【圖二十六( B )】。
2) 活化態( active form )之 caspase-9（34 KDa）與 ß-actin 相對含量分別為 0.2、
0.1、0.3、0.4、0.4、0.9；呈現活性上升的趨勢【圖二十六( C )】。 M C 200 300 400 500(μM)
800bp
600bp
400bp
100bp
3) Caspase-3( 32KDa )與 ß-actin 相對含量分別為 2.0、2.3、2.0、1.7、0.9、1.2；
呈現活性下降趨勢【圖二十七( B )】。
4) 活化態之 caspase-3（17 KDa）與 ß-actin 相對含量分別為 0、0、0、1.0、0.5、
0.5；呈現活性上升的趨勢【圖二十七( C )】。
5) 抑制細胞凋亡的 Bcl- xL 與 ß-actin 相對含量分別為 0.89、0.88、0.7、0.3、0.2、
0.005；呈現活性下降趨勢【圖二十八】。
6) 促進細胞凋亡之蛋白 Bax 與 ß-actin 相對含量分別為 0.7、0.8、0.9、0.8、1.2、
1.5；呈現活性上升的趨勢【圖二十九】。
（A）
control 100 200 300 400 500（µM）
Caspase-9
ß-actin
( B )
Morin concentration (µM)
caspase-9 (46KD) / B-actin
0 1 2
0 100 200 300 400 500
( C )
Morin concentration (µM)
caspase-9 (34KD) / B-actin
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 100 200 300 400 500
圖二十六：HL-60 以不同濃度的 morin 培養 24 小時後，細胞內 caspase-9 的表現。
(A) Western blot-gel。
(B) caspase-9( 46KD)與 ß-actin 相對含量。
(C) caspase-9( 32KD)與 ß-actin 相對含量。ß-actin 為 internal control。
（A）
control 100 200 300 400 500（µM）
（B）
Morin concentration (µM)
caspase-3 (32KD) / B-actin
0 1 2 3
0 100 200 300 400 500
Caspase-3
ß-actin
（C）
Morin concentration (µM)
caspase-3 (17KD) / B-actin
0 1 2
0 100 200 300 400 500
圖二十七：HL-60 以不同濃度的 morin 培養 24 小時後，細胞內 caspase-3 的表現。
(A) Western blot-gel。
(B) caspase-3( 32KD)與 ß-actin 相對含量。
(C) caspase-3( 17KD)與 ß-actin 相對含量。ß-actin 為 internal control。
（A）
Control 100 200 300 400 500（µM）
（B）
Morin concentration (µM)
Bcl-XL / B-actin
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 100 200 300 400 500
圖二十八：HL-60 以不同濃度的 morin 培養 24 小時後，細胞內 bcl- xL 的表現。
(A) Western blot-gel。
(B) bcl- xL 與 ß-actin 相對含量。ß-actin 為 internal control。
Bcl- xL ß-actin
（A）
Control 100 200 300 400 500（µM）
（B）
Morin concentration ( µM)
Bax / B-actin
0 1 2
0 100 200 300 400 500
圖二十九：HL-60 以不同濃度的 morin 培養 24 小時後，細胞內 Bax 的表現。
(A) Western blot-gel。
(B) Bax 與 ß-actin 相對含量。ß-actin 為 internal control。
Bax ß-actin
第六章 討論
腫瘤細胞的最基本特徵是細胞的成長失控，而失控增生的根本原因就是細胞 週期調控機制的破壞，包括驅動機制和監控機制的破壞（Hartwell and Kastan, 1994；Hunter and Pines , 1991；Marx , 1994；King and Cidlowwski , 1998）。監控 機制破壞可發生在損傷感應 、生長停滯、DNA 修復和凋亡機制的任何一個環節 癌基因又是細胞週期調控機制的組成部分。如 p53、Rb、p21、cyclin、c- myc 等。
因此，在腫瘤發展過程中，監控機制的異常會使細胞週期調控機制進一步惡化，
並導致細胞週期驅動機制的破壞，細胞週期的驅動能力異常強化，細胞進入失控 生長狀態，導致細胞出現癌變性。
細胞週期的檢查哨（cell-cycle checkpoints），其作用是監控細胞 DNA 是否受 到傷害，目的使受損的細胞無法繼續分裂而停滯或延遲細胞週期的進行。癌細胞 之所以不斷的增生，與細胞週期失去正常監控有著密不可分的關聯性。
負責調控細胞 G2/M checkpoint 的主要蛋白有 cyclin B1、cdc2、cdc25c、wee1、
p21、chk2 等分子，而細胞能否進行 G2/M transition 主要取決於 cdc2/cyclin B1 complex 是否活化。當 cdc25c 受到 chk2 於 ser216 的磷酸化、wee1 的活化及 p21 的活化，都會進一步使 cdc2/cyclin B1 complex 的活性受到抑制，此時細胞週期 會停滯在 G2 期。
本研究藉由流式細胞儀檢測 HL-60 的細胞週期，發現 HL-60 給予 morin 後，
有 G2/M arrest；進一步檢測 G2/M checkpoint 相關蛋白的表現，發現 wee1 kinase、
p21 的活性隨著 morin 濃度增加而上升；而 cyclin B1、cdc25c、chk2 的活性隨著 morin 濃度增加而下降。又 morin 是先經由破壞細胞 DNA 後，造成 DNA 損傷而 啟動 G2/M checkpoint，導致細胞週期停滯。此外，HL-60 是 p53 mutant 的癌細 胞，通常癌細胞受到 chemo-therapeutic agent 刺激後，擁有 wild-type p53 的細胞 往往會促使細胞停滯於 G1 期；而 p53 mutant 的癌細胞大多會停滯於 S 期或 G2 期素依賴性蛋白激? CDK（Cyclin-dependent kinase）和 CDK 的抑制性蛋白 CDKI
（Jacks and Weinberg , 1996；Nasmyth , 1996；Jacks and Weinberg , 1998）。 不同 分子的 Cyclin 和 CDK 及 CDKI 與其他相關調控蛋白精確調控細胞週期的每一個 定機制四個功能機制組成。一旦，細胞發生 DNA 損傷或複製錯誤（replication error），DNA 損傷首先啟動損傷感應機制，將 DNA 損傷轉化成信號，由信號傳 導傳給生長停滯機制，使細胞停止生長，進而啟動 DNA 修復機制，修復損傷的
DNA。最後，如果 DNA 損傷得到完全修復，細胞週期可進入下一個 phase，細
Bcl-2 family 依 Bcl-2 homology（BH）domain 及功能分為兩個 subfamily：（1）
Bcl-2 subfamily 擁有 BH 1~4 domain，如 Bcl-2、Bcl- xL，具有抑制細胞凋亡的功 能。（2）Bax subfamily，又可分為兩群，擁有 BH 1~3 domain，如 Bax、Bak；只 擁有 BH 3 domain，如 Bad、Bim，有促進細胞凋亡的功能（Wang et al., 1996；
Yang et al., 1995；O'Connor et al., 1998）。雖然，Bcl-2 family 調節粒線體膜通透 性的機制仍受爭議 ，但 目 前較為普遍接受的機制是藉由控制 mitochondrial permeability transition pore ( PT pore ) 的開與關，一旦開啟，粒線體 intermembrane space 內的 AIF（apoptosis inducing factor）、cytochrome c 被釋放到細胞質中引發 下游的細胞凋亡機制。
此外，Bcl-2 藉由提高細胞之抗氧化能力，抵禦氧化性壓力所造成之細胞死亡 在這幾年也廣受討論。過去的研究報告指出在 Bcl-2 過量表現的細胞中發現其抗 氧化的能力提高，並且可以成功抵禦自由基所引發的 apoptosis （Feng et al., 1999）；而在 bcl-2 knock out 之老鼠中發現，其體內抗氧化酵素如 catalase 或 Glutathoion peroxidase 其表現量明顯降低（Vairo et al., 2000）。因此對於自由基所 引發的細胞凋亡，Bcl-2 確實有密切的關聯性。本研究發現，隨著 morin 濃度的 增加，Bcl-xL 的表現明顯受到抑制； Bax 的表現增加，呈現 dose-dependent manner；Bcl- xL 活性的降低，意味著 anti-apoptosis 的能力下降；Bax 的活性上升，
表示 pro-apoptosis 的能力增加。研究結果也顯示，粒線體膜電位隨著給予 morin 濃度的增加而下降。因此，本研究更加確定 morin 引起 HL-60 的凋亡是經由粒線 可能刺激了許多胞內酵素如 protease、nuclease 及 hydrolytic enzyme 等，而導致 細胞凋亡（Chakraborti et al., 1999）。本研究發現，HL-60 給予 morin 後，ROS 隨著 morin 濃度的增加而上升；而細胞質內 Ca2＋濃度也確實上升了。然而，究竟
Ca2+濃度的增加及 PT pore 的開啟是 ROS 產生的原因還是結果仍眾說紛紜；雖 然，有研究指出外源性的 ROS 可誘使 PT pore 開；但內源性 ROS 是否造成 PT pore 的開啟仍是個謎（Brookes and Darley-Usmar , 2004；Castilho et al., 1995；Packer and Murphy , 1994）。本研究尚未確定增加之 ROS 為內源性或外源性，可利用 catalase（2H2O2 à 2H2O ＋ O2）進一步探究 ROS 的來源，實驗進行時先加入 catalase，再加入 morin；若 ROS 上升表示 ROS 為外源性，ROS 下降表示 ROS 為內源性。
中草藥的開發是近年來相當熱門的研究方向，如薑黃、大蒜、十字花科植物、
黃酮類及熟知的紫杉醇等，都具有各種不同優越的生物活性。本研究以桑色素給 予人類血癌細胞，探究其抑制癌細胞生長的機制，發現桑色素能明顯抑制血癌細 胞的生長且發生細胞凋亡的現象。然而，本研究僅以體外實驗進行其抗癌機制的 探討，往後仍須配合活體實驗或更詳盡的研究加以確認桑色素的抗癌功效。
圖 三 十 ： 經 由 粒 線 體 引 發 的 細 胞 凋 亡 機 制 。
本圖摘自BioCarta公司，網址http://biocarta.com./pathfiles/h_mitochondriaPathway.asp
第七章 結 論
本研究乃是經由探討細胞增生（proliferation）、細胞週期（cell cycle）及細胞 凋亡（apoptosis）等機制，評估桑色素( morin )對於人類血癌細胞（HL-60）之抗 癌作用。實驗發現，桑色素經由活化 p21 及 wee1，使細胞週期停滯在 G2/M 期 ( G2 / M phase arrest ) ，同時對於人類血癌細胞的增生有抑制作用；又 ROS 上升伴隨 著細胞質鈣離子（Ca2+）濃度上升，粒線體膜電位( MMP )去極化以及經由活化 Bax，抑制 Bcl-xL，使下游 caspase-9 以及 caspase-3 活化，造成染色體 DNA 裂 解( DNA fragmentation )，最後使細胞走向凋亡( apoptosis )。
綜上所論，發現桑色素的抗癌活性在於抑制人類血癌細胞的增生，使細胞週 期停滯在 G2/M 期，且活化 caspase-3 促使癌細胞凋亡。其作用機制如【圖三十 一】。
Morin