第三章 實驗方法與步驟
3.4 分析項目及方法
本研究之分析項目包含溫度、灰份、含水率、種子發芽實驗、pH、電 導度、二氧化碳濃度、總揮發性固體物、液相總有機碳、液相凱氏氮、DGGE 等。樣品分析項目、方法及分析儀器如表 3-2 所示。分析步驟如圖 3-7 所 示。
3.4.1 溫度及二氧化碳
生物降解過程中之氣體成份二氧化碳濃度及反應槽溫度則分別由二氧 化碳濃度分析儀及熱電偶進行連續式監測。
3.4.2 pH 及電導度值
pH 及電導度值的測定是將堆肥樣品與去離子水依 1：10 (w/v dry weight basis) 比例混和之後直接量測。
3.4.3 灰份、含水率及總揮發性固體物
含水率及總揮發性固體物分別經由 103OC 24 小時和 550OC 8 小時 後的重量差值計算得來。
3.4.4 堆肥萃取液
由於堆肥所採的樣品是固體物，但許多化性的分析都是分析液相水樣，故 分析前需先將堆肥樣品經前處理得到液相的萃取液。此萃取液的取得步驟 先將堆肥樣品與去離子水依 1：10 (w/v dry weight basis) 比例混和，在機 械震盪下一小時後，以 2000 rpm 離心 10 分鐘，取上澄液經 0.45
Reactor
Sampling, 100 g wet
85 g wet
matter 5 g wet matter 10 g wet matter
80 g wet
滴入內襯有 WHATMAN #1 濾紙之培養皿中，將 50 顆種子 (本實驗所採 用之種子為白蘿蔔) 平均分佈濾紙上，在 20-25OC 暗室下培養 48 小時，
表 3-2. 分析項目、方法及儀器
Analysis
item Method Instrument Model
pH NIEA R208.00T pH meter Suntex sp-2200
EC NIEA W203.51B Electrical
conductivity meter Suntex sc-120 TOC NIEA W532.51C TOC analyzer O‧I Analytical 1010
Moisture NIEA R301, 01C Oven
(103～105OC) RISEN
Ash / TVS NIEA R301, 01C Oven 550OC CO2/O2 CO2/O2 analyzer ABB EL1020
TKN TKN analyzer Gerhardt
Temperature Thermal couple JENCO 791
Weight Platform scales JADEVER JPC-150
觀察發芽狀況，另取 10 ml蒸餾水添加至上述培養皿中作為對照組進行比 較 (Wong et al., 2001)。
3.4.6 分子生物學技術
本研究從堆肥樣品中，抽取微生物的 genomic DNA，再進行 PCR 將 其 16S rDNA fragment 放大後進行 DGGE 電泳分析，分析其電泳圖並找 出可能之優勢菌種後，經過定序後可得知該菌種名稱
3.4.6.1 DNA 萃取
使用萃取 DNA Kit 進行萃取堆肥微生物之 DNA。因為堆肥樣品會吸 取較多水分，不適合直接加入萃取液使用，故先取適當的堆肥樣品加入適 當比例去離子水 (滅菌)，震盪之後再離心取其上澄液備用。詳細的 DNA 萃取步驟參考附錄一。
3.4.6.2 PCR 實驗
將萃取出來之 DNA 當作樣版 (Template)，以適當之 primer 進行 PCR 反應放大 DNA 樣品。本研究以 519fGC 與 907r 作為 primer。取 10 µl PCR master mix 試劑，加入 primer-r-GC 1.5 µl 及 primer-f 1.5 µl， 再加入 2 µl DNA template，最後加去離子水補至 50 µl，稍微震盪離心 10 秒再進行 PCR 程序。
3.4.6.3 DGGE 實驗
不 同 大 小 的 PCR 產 物 ， 因 為 具 有 不 同 的 分 子 量 而 有 適 合 的 Acrylamide 濃度，本實驗經 PCR 反應後的產物約為 200 bp，適合使用 10% acrylamide 濃度的膠 (如表 3-3 所示)。Denaturing 範圍選擇 30%
至 70%。DGGE condition 在 1 倍的 TAE Buffer 中以 56OC、200 V 電 壓，進行 300 分鐘。之後將膠取出以 EtBr 染色後顯像。
表 3-3. 膠體濃度 Acrylamide
concentration
DNA base pair
6% 300-1000bp 8% 200-400bp 10% 100-300bp