分析項目及方法

(一) 動物犧牲及樣品收集

動物隔夜禁食，秤量體重後，以乙醚進行麻醉，自腹腔靜脈採血，

收集於含有肝素 (heparin) 的採血管中。取下肝臟及結直腸部位組織，

以生理食鹽水清洗瀝乾後，冷凍存於-80 ℃，以供日後分析使用。各組 織樣品處理方式為：

血液：血液於 3000 × g；4 ℃下，離心 15 分鐘，取上層血漿儲存於-20 ℃，

以供日後分析使用。

肝臟：以 phosphate buffer saline (PBS) 灌洗肝臟，去除肝臟中血液，清 洗後的肝臟瀝乾秤重。之後每個肝臟切 0.5 × 1 × 2 cm 浸泡在 10%

福馬林當中，利用 hematoxylin and eosin (H & E) 染色做觀察。

剩餘肝臟則儲存於-80 ℃冰箱中。

結腸：各組部分動物 (4 隻/組) 取下結腸至肛門段並記錄長度，依縱切 方向剪開直腸，去除糞便測量重量，將其分為盲腸端、中段及肛 門端三段，置於兩張濾紙間，浸泡在放有福馬林塑膠培養皿中，

以封口膜封口，固定 24 小時待觀察其 aberrant crypt foci (ACF)。

結腸黏膜：各組其餘動物 (6 隻/組) 將結直腸分為盲腸端、中段、肛門 端三段，洗淨去除糞便，刮除結直腸上黏膜，收集於微量離 心管中，並儲存於-80 ℃冰箱中。

(二) 黃豆皂素粗萃取物成分分析 皂素分析：

利用市售黃豆皂素 (192-08851, Wako) 配置 1000 ppm 標準品；樣品 配製則是取 0.01 g 黃豆皂素粗萃取物溶於 1 mL 水中。以 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 分析，利用 ChromQuest 4.X 軟體分析比較。HPLC 分析條件，使用 C18 管柱 (Inertsil 6, ODS-3, 4.6 × 250 mm, Vercopak)，注射容積為 20 μL，流速為 1 mL / min，利用 溫度控制箱 (Super CO-150, Enshine) 將溫度控制在 30 ℃，UV 吸收值 為 260 nm，移動相給予濃度梯度，條件如下表。

表 3-2、皂素 HPLC 分析移動相給予梯度濃度條件 Table 3-2. The condition of HPLC analysis of soy saponins.

Time scale Solvent A Solvent B

0.05 % trifluoroacetic acid acetonitrile in water

01 - 12 min 63%  60% 37%  40%

12 - 37 min 60%  52% 40%  48%

37 - 38 min 52%  0% 48%  100%

38 - 40 min 0% 100%

40 - 45 min 0%  63% 100%  37%

異黃酮素分析：

利用 25 ppm Daidzin (30408, Fluka)；Daidzein (Wako)；Genistein

(G6649, Sigma)；Genistin (G0897, Sigma) 作為標準品；樣品配製則是取 0.5 g 黃豆皂素粗萃取物溶於 20 mL 80% methanol (MS1992, Tedia)中。以 HPLC 分析，利用 ChromQuest 4.X 軟體分析比較。HPLC 分析條件，

使用 C18 管柱 (Inertsil 6, ODS-3, 4.6 × 250 mm, Vercopak)，注射容積為 20 μL，流速為 1 mL / min，溫度控制在 40 ℃ (Super CO-150, Enshine)，

UV 吸收值為 248 nm，移動相給予濃度梯度，條件如下表。

表 3-3、異黃酮素 HPLC 分析移動相給予梯度濃度條件 Table 3-3. The condition of HPLC analysis of isoflavones.

Time scale Solvent A Solvent B

acetonitrile 0.1 % acetic acid 01 - 04 min 15%  35% 85%  65%

04 - 48 min 35% 65%

49 - 52 min 35%  15% 65%  85%

(三) 血漿異黃酮素分析

取50 μl血漿加入 3 ml tert-butyl methyl ester (TBME) 混勻 1 分 鐘，震盪 10 分鐘，以 6500 × g 離心 3 分鐘，取上層並抽乾有機溶劑，

加入250 μlmethanol-0.05 M ammoium acetate (pH 4.7) (30:70) 溶液，以 HPLC 分析，利用 ChromQuest 4.X 軟體分析比較。HPLC 分析條件，

使用 C18 管柱 (Inertsil 6, ODS-3, 4.6 × 250 mm, Vercopak)，注射容積為

20 μL，流速為 1.2 mL / min，溫度控制在 40 ℃ (Super CO-150, Enshine)，

UV 吸收值為 248 nm，移動相給予固定濃度，條件為 methanol-0.1 M ammoium acetate (pH 4.7) (40:60)。

(四) 血脂分析

利 用 全 自 動 分 析 儀 (Dri-Chem 3500, Fuji) 、 TG 試 片 (440804, Fujifilm) 及 TCHO 試片 (240707, Fujifilm) 測量血漿中三酸甘油酯和總 膽固醇含量，每次樣品所需量為 10 μl。

(五) Aberrant crypt foci 染色觀察

以 10% 福馬林之固定液固定 24 小時後，取出結腸，以水清洗黏附 在濾紙，過一次食鹽水，再以 0.5% 亞甲藍 (methylene blue) 染色約 1 分鐘，於食鹽水清洗，將染色過的結腸組織置於載玻片上，在顯微鏡 40 倍率下觀察，由左至右、由上至下計算數目。發現有 aberrant crypt foci (ACF)，紀錄座標並在 400 倍率顯微鏡下拍照。將所觀察到的 ACFs 作 以下分類，A 為正常腺窩細胞；B 為有一個異常腺窩的 ACF，標示為 1 AC/ACF；C 為 2 AC/ACF；以此類推 (圖 3-3)。並且依照 Cassand 等人 (1997) 將一至三異常腺窩的 ACFs 定義為小型 ACFs；大於三個異常腺 窩的 ACFs 定義為大型 ACFs。計算其大小型 ACFs 數目及 ACFs 的總數。

圖 3-3、ACFs 分類

Figure 3-3. The classification of ACFs.

(六) 老鼠結腸黏膜組織中 COX-2 蛋白質表現量 細胞蛋白質之萃取：

將 500 μl均質化緩衝液 (1X RIPA buffer, 20-188, upstate : Protein Inhibitor, p8340, Sigma = 200 : 1) 加入黏膜組織中，在冰上均質，均質液 在 4 ℃下以 19300 x g 離心 20 分鐘，取上清液至新的微量離心管，即為 所需之蛋白質萃取液。

蛋白質之定量：

使用蛋白質分析試劑 (BCA1 and B9643, Sigma) 定量細胞中蛋白 質的含量，以 Bovine serum albumin (BSA) 為標準品做出標準曲線，濃 度為 31.25 μg /mL~1 mg / mL。標準品以水稀釋 1X、2X、4X、8X、16X 及 32X，取 10 μL 至 96 孔培養盤；而蛋白質樣品 (細胞蛋白質萃取液) 加水稀釋 1X、2X 及 4X，取 25 μL 至 96 孔培養盤，加入 200 μL之 BCA 蛋 白 質 分 析 試 劑 (Bicinchoninc acid solution : Copper sulfate

Normal crypt 1 AC / ACF

A B

2 AC / ACF 3 AC / ACF

C D

pentahydrate 4% solution = 50 : 1)，混合均勻在 37 ℃下作用 30 分鐘利用 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 光度計讀取波長 562 nm 的吸光值。

硫酸十二酯鈉－聚丙烯醯胺凝膠電泳：

利用十二基硫酸鈉電泳法 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 和西方墨點法 (Western blot) 來分析 COX-2 及 iNOS 蛋白質的表現。COX-2 及 iNOS 的分子量分別為 70 kDa、

130 kDa。選用 10% resolving gel 和 7% stacking gel 之 SDS-PAGE 進行 分析，並以β-actin (42 kDa) 作為 internal control。

取 80 μg之蛋白質樣品，加入四分之ㄧ體積量的 5 倍樣品緩衝液 (sample buffer)，於 97 ℃下加熱 3 分鐘，使蛋白質變性。處理後即可注 入已製作完成之電泳膠片的齒孔中，另注入 2.5 μL 的蛋白質標記 (LC5925, invitrogen)，並於電泳槽內外注入適量電泳液 (Tank buffer)，

於室溫下先以 60 伏特電壓跑膠 30 分鐘，當蛋白質完全通過 stacking gel 後，再施以 90 電壓跑膠 2 小時，使蛋白質可依分子量大小於凝膠上展 開。

西方墨點法：

SDS-PAGE 電泳結束後取下凝膠，置於濕潤之 3M 濾紙上並覆蓋上

一層 polyvinyldene diflouride (PVDF) 膜，應注意避免覆蓋所產生之氣泡 而影響通電，組裝完成以轉移緩衝液 (Towbin transfer buffer) 在冰上，

並於 300 安培下進行 2 小時的轉移。轉移後，PVDF 膜標定蛋白質標記 的位置，並將其浸於 25 mL 1% 胎牛血清 (albumin from bovine serum, BSA) 之 TBST (Tris-buffered saline plus 0.1% Tween-20) 溶液中，於室溫 震盪隔夜，進行阻斷 (Blocking)，使之預先排除非專一性之結合。阻斷 後將其浸於 10 mL TBST 溶液沖洗四次，再以 10 mL TBS (Tris-buffered saline) 溶液清洗 PVDF 膜 2 次，每次 10 分鐘，移除 TBS 溶液後，加 入以 1% BSA 稀釋之一級抗體，於室溫環境下搖動作用 2 小時。回收一 級抗體後，使用 TBST 溶液以及 TBS 溶液沖洗 PVDF 膜，再加入以 1%

BSA 溶液稀釋之二級抗體，於室溫環境下搖動 40 分鐘。回收二級抗體 後，再以 TBST 溶液以及 TBS 溶液沖洗 PVDF 膜。最後移除 TBS 溶液，

加 入 1 mL Western Lightning^TM Chemiluminescence Reagent Plus (Perkinelmer life sciences, USA) 反應試劑組避光作用 2 分鐘，用保鮮膜 包覆後固定於壓片匣中，於暗房中將 Fuji medical x-ray film 放進壓片匣 壓片，經 5 分鐘時間反應後將底片取出，以顯影劑及定影劑沖洗 X-ray 底片，顯影後觀察結果。顯影後的底片，掃瞄影像至電腦，利用 Image-Pro Plus 4.5 軟體，計算各個影像密度。

將使用過之 PVDF 膜加入 stripping buffer (Pierce Biotechnology,

Rockford, USA)，正反面在室溫下震盪各 15 分鐘將抗體脫離，再以 TBS 溶液清洗 10 分鐘。處理過的 PVDF 膜即可再進行阻斷繼續和其他抗體 作用。

(七) 老鼠結腸黏膜組織中 PGE2含量

結腸黏膜以均質緩衝液 (Homogenization buffer, 13.69 g phosphate 先加入少許 ddH₂O，調整 pH 值至 7.4 + 357.8 mg EDTA + 3.6 mg indomethacin，以 ddH2O 定量至 1000 mL) 均質，加入 2~4 倍樣品體積 丙酮 (acetone) 震盪，在室溫下反應 5 分鐘，以 1500 × g 離心 10 分鐘後，

取上清液，真空抽乾 acetone，所得樣品以商業試劑配方 (Prostaglandin E₂ EIA Kit, Cayman) 測量黏膜組織中 PGE2含量。

(八) β-glucuronidase 酵素活性測定

β-glucuronidase (GUS) 會 催 化 基 質 p-nitrophenyl β-D-glucuronide (pNPG)，水解產生黃色的生成物p-nitrophenol，測定生成物質的吸光值，

可以推算酵素的活性 (Jefferson et al, 1986)；催化反應如下式：

吸取20 μL的蛋白質樣本，小心注入微量滴定盤中，避免氣泡產生。

每一樣品槽加入200 μL GUS基質液 (pNPG, N-1627, Sigma) 31.5 mg，溶 於100 mL 50 mM Na3PO4, pH 7.0)，混合均勻，每十分鐘以Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 光度計測定波長415 nm之吸光值，共測定 一小時。以上步驟，只可測定GUS 活性的相對大小，並非酵素絕對活性 單位的測定方法。酵素的活性單位定義為：每分鐘所能催化生成物之μ mole數。因此將所測定之單位時間內吸光值的變化，轉換成生成物的莫 耳數，即可求得其真正的活性單位。酵素比活性計算公式 (nmole/min/mg protein) =【V/(E × d × p × v)】× △A415nm/△t (Lowry et al., 1951)。

V= 酵素反應液總溶液 (ml)

E= 分子吸光係數 (E= 6.2 ml/μ mole.cm) d= 光路徑 (光路徑= 1 cm)

p= 肝臟酵素測定液蛋白質濃度 (mg protein/mL) v= 酵素測定液容積 (ml)

△A_415nm/△t= 單位時間內，酵素反應液於 415 nm 時的吸光值變化

(九) 肝臟組織切片

老鼠肝臟組織切片，以 Hematoxylin and eosin (H & E) 染色，由病 理科醫師判定其脂肪病變、發炎和纖維化的情形。