(1) qRT-PCR 引子對及探針設計 ( Taqman )
將已經發表在NCBI 上之 BBrMV 病毒鞘蛋白以及溫室所保存的 BBrMV 分離株以 Bioedit version 7.0.5.3 進行 alingment，選出保守性
較高的區域，設計一對引子對，並從引子對中選出一段18 個核苷酸
的區域作為probe，此 probe 之 5’ 端及 3’端分別帶有 reporter dye ( 6-FAMTM ) 以及 quencher ( MGB ) 。（引子對序列及探針見表一）
(2) 標準曲線的建立
反轉錄後的產物轉殖進Topo TA® cloning Vector (pCR® 2.1-TOPO)內：4 μL PCR 產物與 1 μL salt solution, 1 uL pCR® 2.1-TOPO vector，混勻，室溫下作用 30 分鐘。將上述產物加入 100 μL 勝任細 胞中(大腸桿菌)混合，冰浴 5 分鐘。接著放入 42 ℃水浴槽中 heat shock 40 秒，再冰浴 5 分鐘，加入 500 μL 的 LB 培養基 recover 30-45 分鐘並以2500 rpm 離心 2.5 分鐘，吸除多餘液態培養基，再將菌塊 懸浮。轉殖好之大腸桿菌塗於含有50 μg/ mL kanamycin、40 μL 100 mM IPTG 與 40 μL X-gal ( 40 mg X-gal in DMF) 的 LB 固態培養基 以37℃培養 12~16 小時，挑選白色菌落至新的 LB 固態培養基上繼
代培養，並以colony PCR 確定產物已轉殖成功。將轉殖成功之菌落 挑至 LB 液態培養基中以 37℃ 培養 12 小時，菌液以 Plasmid miniprep purification Kit 抽取質體 DNA。
(3) 抽取質體 ( plasmid ) DNA
菌液於室溫下以12000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉上清液後加入 200 μL solution I 懸浮菌塊。加入 200 μL solution II 混合，靜置 1 分 鐘後加入 300 μL Solution III 輕輕混勻後以 12000 rpm 離心 5 分鐘。
取上層液加入管柱中，以12000 rpm 離心 1 分鐘。倒掉濾液後加入 700 μL wash solution，以 12000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉濾液後再以 12000 rpm 離心 3 分鐘將剩餘酒精去除。管柱移至新的 eppendorf，
於 65 ℃ 烘乾 5-8 分鐘，加入 50 μL 65 ℃ ddH2O 靜置 1 分鐘，以 12000 rpm 離心 1 分鐘，即得到質體 DNA。
(4) 胞外轉錄 in vitro transcription
將plasmid DNA 以 BamHI 酵解三小時，以 PCI/CI 去除蛋白，
並以6 μL DEPC 水回溶。使用 T7 mMESSAGE Kit，遵照操作手冊：
線性化DNA 6 μL，加入 10 μL 2X NTP/CAP、2 μL 10X reaction buffer、2 μL enzyme mix，於 37℃ 反應 30 分鐘後加入 1 μL 15mM GTP，再反應 30 分鐘後再加入 1 μL 15mM GTP；再於 37℃反應 2 小 時後即可得到標準品。
(5) 反轉錄
將樣品之RNA 濃度以 Nanodrop 測定，並調整至 100 ng/ uL，將 樣品以BBrMV 324 reverse primer 反轉錄（見附表）並加入反應溶
液，包含3.5 ug RNA，2 uL 10 pmole reverse primer、4 uL 2.5Mm dNTPs，補 ddH2O 至 13 uL，於 65℃作用 5 分鐘後，移至冰上冷 卻，加入4 uL 5X RT buffer、2 uL 100 mM DTT、1 uL ( 100U ) MMLV reverse transcriptase，混勻後於 42℃反應 50 分鐘，所得 cDNA 再 25 倍稀釋以進行 real-time PCR。
(6) qPCR 反應
反應溶液總體積為10 uL 包含 5 uL 2X FastStar Universal Probe Master Assay Mix、0.5 uL 20X BBrMV assay mix、1 uL 25X cDNA、
3.5 uL ddH2O，以 StepOneTM Real-Time PCR System, ABI 進行反應，
條件為：50℃，2 分鐘；95℃，10 分鐘；35 cycle【95℃，15 秒；
60℃，1 分鐘】，每樣品 3 重複。以標準品做出之標準曲線換算得到 copy numbers ( CNs ) 。
五、 香蕉苞葉嵌紋病毒田間染病情形調查
調查BBrMV 於田間的染病情況，在南投國姓；雲林莿桐；嘉義中埔、
頂埔；臺南白河；高雄大寮；屏東縣屏東市、長治、佳冬、高樹、麟洛、林 邊、崁頂、萬巒、內埔、車城等地採集有mottling 狀或 chlorosis 的香蕉葉 片，帶回實驗室後萃取總核酸並以RT-PCR 檢測是否帶有 BBrMV。品種以華 焦系 ( Cavendish, AAA ) 為主，包含北蕉、寶島蕉、台蕉五號、台焦七號、
大北蕉、烏龍蕉、矮腳蕉，還有Saba ( ABB ) 單一園區以及芭蕉類。另外也 有台灣香蕉研究所保存種原的三尺蕉/矮腳蕉 ( AAA )。
採回之樣本也以總核酸萃取法以及RT-PCR 的方式偵測其他三種重要香 蕉病毒，包含Cucumber mosaic virus、Banana bunchy top virus 與 Banana streak virus。所用之引子對如表一所示。
六、 香蕉苞葉嵌紋病毒之親緣關係分析
將田間採得有BBrMV 的核酸以 BBrMV 902（馮，2006）進行 RT-PCR 增幅，獲得之PCR 產物為鞘蛋白序列。將 PCR 產物轉殖進 Topo TA®
cloning Vector (pCR® 2.1-TOPO)內：4 uL PCR 產物與 1 uL salt solution, 1 uL pCR® 2.1-TOPO vector，混勻，室溫下作用 30 分鐘。將上述產物加入 100 uL 勝任細胞中(大腸桿菌)混合，冰浴 5 分鐘。接著放入 42 ℃ 水浴槽中 heat shock 40 秒，再冰浴 5 分鐘，加入 500 uL 的 LB 培養基 recover 30-45 分鐘並 以2500 rpm 離心 2.5 分鐘，吸除多餘液態培養基，再將菌塊懸浮。轉殖好 之大腸桿菌塗於含有50 ug/ mL kanamycin、40 uL 100 mM IPTG 與 40 uL X-gal ( 40 mg X-X-gal in DMF) 的 LB 固態培養基以 37℃培養 12~16 小時，挑選 白色菌落至新的LB 固態培養基上繼代培養，並以 colony PCR 確定產物已轉
殖成功。之後送交源資國際生物科技股份有限公司進行定序。（引子對序列
見表一）
將所得序列與已知序列以Mega 7 進行 alignment，並使用 Neighbor joining method，以 bootstrap replication number 為 1,000 繪出親緣關係圖，並 比較序列一致性（identity）。
肆、 結果
皆達90 %；Umalag - V63 及 Umalag-Philippines 接種成功率最高，皆為 100 %（表二、圖二 A）。資料經 SAS 9.4 軟體 GLM 分析，北蕉、Rahan - Israel 與烏龍發病率較其他品系低，具有顯著差異（P<0.05）。
隨葉片成長，病斑較不明顯，但老葉上可見上述條斑或紡錘狀病斑 轉變成為鮮黃色。
各華蕉 ( Cavendish, AAA ) 品系香蕉於接種後三個月內皆可觀察到 明顯病徵，除Rahan - Israel 與烏龍蕉因植株還很小時便因藥害死亡，其
他品種發病時於幼葉的病徵級數皆可達到三級（圖三）。但隨著植株成
長成熟，新長出來的幾片葉子病徵可能會有康復的現象，嚴重程度變得
較不嚴重；但隨著時間拉長後又會產生出明顯病徵（圖四）。
2.
BBrMV 感染各 AAA 品系組培蕉苗之潛伏期各華蕉 ( Cavendish, AAA ) 品系之潛伏期平均值皆介於 25.5 天到 46.7 天之間大北蕉最短，北蕉最長。分別為北蕉 46.7 天、寶島蕉 28 天、台蕉五號32.7 天、台蕉七號 31.8 天、大北蕉 25.5 天、烏龍蕉 28 天
（僅一棵）、Umalag - V63 29 天、Umalag- Philippines 33.5 天、Rahan- Israel 36.5 天（圖二 B 與表二）。
3.
組培蕉苗株齡與發病相關性以台蕉五號為實驗材料，分為10 - 20 公分、20 - 30 公分、>30 公 分三組，10 - 20 公分組別發病率為 75 % ( 3/4 )、20 - 30 公分組別發病 率為 66 % ( 4/6 )、>30 公分組別發病率為 33 % ( 1/3 )。而 10-20 公分組 別出現病徵的平均時間約為 32.6 日；20-30 公分組別出現病徵平均時間 約為73 日；>30 公分組別最則在感染後 130 日才出現病徵。（表三，圖 五）
4.
溫度與病徵表現之關係以寶島蕉及台蕉七號為實驗材料，接種後確認帶病後於四月份別置
於25 度有冷氣之溫室及無溫度調控之溫室（溫度範圍介於 28 - 38 度）
種植2 個月，觀察其病徵變化。置於兩溫度下之罹病蕉株病徵表現及嚴
重程度無明顯差異（圖六A、B、C、D）。
三、 北蕉與其衍伸品系對黃葉病 ( Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4, Foc 4 ) 之抗病性與對香蕉苞葉嵌 紋病毒 ( BBrMV ) 之感病性之關聯性
本次使用之華蕉 ( Cavendish ) 品系包含北蕉、寶島蕉、台蕉五號、
台蕉七號、大北蕉等品系。其中北蕉對於黃葉病 ( Foc 4 ) 為感病品種，
而寶島蕉、台蕉五號、台蕉七號、大北蕉等品種則對黃葉病 ( Foc 4 ) 有
中度抗病性至高度抗病性。從接種BBrMV 之發病率來看，北蕉發病率
較低 (30% )，對於 BBrMV 較為抗病；而寶島蕉、台蕉五號、台蕉七 號、大北蕉發病率極高 ( 90% )（表二、圖二）。以本次接種 BBrMV 之 結果歸納得出，在北蕉與其衍伸品系中，對黃葉病抗病的品種則對 BBrMV 較為感病；而對黃葉病較為感病的品種則較為抗 BBrMV，即北 蕉品系對BBrMV 之感病性與對黃葉病 ( Foc 4 ) 之抗病性具有關聯性。
四、 香蕉苞葉嵌紋病毒中間寄主之探討
本實驗使用之受試植物包含野薑花 ( Hedychium coronarium ) 、美 人蕉 ( Canna spp. )、紅花月桃 ( Alpinia purpuata )、姑婆芋 ( Alocasia odora ) 等蕉蚜之寄主，實驗中可發現傳毒時，蕉蚜多半有逃離之現 象。但若有嫩葉或是幼嫩組織則會有少量幾隻停留群生其上。
蕉蚜蟲傳結果顯示，BBrMV 能在紅花月桃與姑婆芋內增殖。但該
病毒僅能在紅花月桃造成病徵（圖七A )，而感染姑婆芋則無病徵，成
健康狀（圖八A、B）。以 RT-PCR 檢測病毒存在，受感染之紅花月桃能 持續地偵測到BBrMV（圖七 B），而姑婆芋雖然在接種後 1 個月到 1.5 個月即可利用RT-PCR 偵測到，但不穩定，六棵內僅有兩株直到六個月 都還可偵測到（圖八C）。而野薑花及美人蕉則無出現病徵也無法以 RT-PCR 偵測到 BBrMV 的存在，對 BBrMV 免疫。
各物種接種成功比率如下野薑花 ( Hedychium coronarium ) 0 % ( 0/6 )；美人蕉 ( Canna spp. ) 0 % ( 0/4 )；紅花月桃 ( Alpinia purpurata ) 50 % ( 5/10 )；姑婆芋 83.3 % (5/6)（表四）。
五、 香蕉苞葉嵌紋病毒田間感染情形調查
因臺灣栽種大宗是以華蕉系 ( Cavendish, AAA ) 的北蕉品系為主，
調查品種/品系包含北蕉（7 園）、烏龍蕉（4 園）、寶島蕉（4 園）、台蕉 五號（10 園）、台蕉七號（5 園）、大北蕉（4 園），及 1 園的 Saba ( ABB )，還有其他包含矮腳蕉與芭蕉類（7 園）。地點包含南投（4 園）、雲林（2 園）、嘉義（2 園）、台南（2 園）、高雄（3 園）及屏東
（29 園）（表五）。
1. RT-PCR 檢測 BBrMV 之結果
由田間採樣帶回實驗室後抽取總核酸並以RT-PCR 方式檢測，測 得帶有BBrMV 的樣本為：雲林莿桐的烏龍蕉上採得 2 個樣本、高雄 大寮的大北蕉上採得1 個樣本、屏東長治德協台蕉五號採得 1 個樣 本、香蕉研究所內的台蕉七號3 個樣本、香蕉研究所內 Saba 園採得 6 個樣本（表五、表七）。
2. 採得樣本之田間病徵表現
雲林莿桐烏龍蕉上之樣本在葉緣有輕微黃萎與 mottling 現象；
對，相似度除了與原本就與其他序列親緣關係較遠的
KF385478_TN14 與 KF385484_TN16 以外，在核苷酸層級與胺基酸 層級下，序列一致性分別皆在92 % 以上與 91.9 %以上。若加入該兩 序列比較，在核苷酸及胺基酸層級下則最低序列一致性會下降到 75.8 % 與 82.8 %以上。
在核苷酸層級下，與F2 最相似者為 AF071589_TH1 及 AF071584_I3，相似度皆為 98.3 %；與 F16 最相似者為
AF071589_TH1 及 AF071584_I3，序列一致性皆為 98.2 %；而與 F35、F53 及 F92 最相似者為 AF071589_TH1，TH1 與 F35 序列一致 性為98.3 %，與 F53 相似度為 97.7 %，與 F92 相似度為 98.2 %。
在胺基酸層級下，與全部五個序列最相似者為AF071589_TH1
（泰國）與F2、F16、F35、F53 及 F92 之胺基酸序列序列一致性分 別為99.7 %、99.3 %、99.3 %、98.3 %與 99 %。
利用Mega 7 繪製之親緣關係圖 ( phylogenetic tree) 可看出無論 在核苷酸層級或是胺基酸層級，本次採集到之五個分離株與Rodoni 等人於1999 年發表之印度、菲律賓、泰國、西薩摩亞共和國、越南 以及Zhang et al. 於 2016 年發表之夏威夷 Red ginger 分離株在同一群 ( Rodoni et al. 1999; Zhang et al. 2016 )（圖十一 C、D）。
4. 採得樣本接種於感病品種與實驗室菲律賓分離株之比較
將於香蕉研究所Saba 蕉園採得之強毒分離株接種於寶島蕉，並與實 驗室保存之BBrMV-PHI-S1 之病徵相互比較，兩者相似。皆出現 BBrMV 之典型紡錘狀嵌紋病班（圖十二 A、B）。於田間亦採集到輕 病徵之弱毒分離株，待後續探討。
5. 姑婆芋於香蕉研究所感染 BBrMV 蕉園之採樣結果
於香蕉研究所內感染BBrMV 之 Saba 園與台蕉七號園對姑婆芋 進行採樣，以RT-PCR 偵測，未偵測到 BBrMV（表六）。
6. BBrMV、CMV、BBTV 與 BSV 四種香蕉病毒田間染病情形調查 總採集株數為143 株，BBrMV 共 13 株（單獨感染有 10 株），
CMV 共 34 株（單獨感染有 29 株），BBTV 有 7 株（單獨感染有 6 株），BSV 共有 2 株（皆為單獨染病）。BBrMV 與 CMV 複合感染有 3 株，BBrMV 與 BBTV 複合感染有 0 株，CMV 與 BBTV 複合感染 有1 株。未發現其他三種病毒與 BSV 複合感染，也未發現三種以上 病毒複合感染。
六、 即時反轉錄聚合酶連鎖反應 ( Real-time RT-PCR ) 與單步反轉錄聚合酶連鎖反應 one step RT-PCR 敏感 度測試比較
利用所設計出的Taqman 系統之 BBrMV 142 assay 建立標準曲線，
得出回歸曲線公式Ct = -3.527 log (Qty) + 43.224，利用該公式可推算出 copy numbers（圖十三 A、B）。藉由 10 倍序列稀釋原始總核酸濃度 104
得出回歸曲線公式Ct = -3.527 log (Qty) + 43.224，利用該公式可推算出 copy numbers（圖十三 A、B）。藉由 10 倍序列稀釋原始總核酸濃度 104