第一章 前言
1.2 去氧核醣核酸(DNA)與 DNA 共價鍵結物(DNA adducts)簡介
核酸是以核苷酸(nucleotides)為單元體所鍵結而成的大分子，而核苷酸的組成 為去氧核醣、磷酸、以及含氮鹼基。去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)的 四種含氮鹼基分別為腺嘌呤(adenine, A)、鳥糞嘌呤(guanine, G)、胞嘧啶(cytosine, C)、
與胸腺嘧啶(thymine, T)，如圖 四所示。其中 A 與 T 可形成兩個氫鍵，而 G 與 C 可形成三個氫鍵，因此，A 與 T、G 與 C 易因氫鍵互相吸引，並且由於核甘酸本 身具有許多氫、氧、氮原子，所以在許多地方形成氫鍵，使得 DNA 彼此形成立體 的雙股螺旋結構，使能傳遞遺傳訊息。
DNA 易受親電子試劑(electrophilic reagent)影響，使得含氮鹼基上的親核性位 置(nucleophilic sites)發生改變，在許多親電子試劑的作用下，某些官能基取代了正 修復就會導致突變的發生，當 DNA 持續的改變，造成原致癌基因(proto-oncogenes) 的活化與腫瘤抑制基因(tumour-suppressor genes)的去活性，染色體不穩定的情形 就會導致惡性腫瘤的發生(Hemminki 1993)。
在 DNA 共價鍵結物形成的同時，體內亦具備修復機制，DNA 共價鍵結物的 兩種單股 DNA 修復機制(錯誤! 找不到參照來源。)：(1)鹼基切除修復(base excision repair)：涉及 DNA 螺旋結構扭曲的損傷(可能阻礙轉錄與正常複製)時的
修復機制，修復過程為 DNA 糖基酶(DNA glycosylase)作用移除受損的鹼基(DNA 共價鍵結物上與化學物質鍵結的鹼基)，移除後形成無嘌呤 DNA(AP site DNA)，
接著脱嘌呤/嘧啶内切核酸酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease, AP endonuclease) 再由 3'端將去鹼基位置去氧核醣之磷酸骨架切除形成 DNA 鏈斷裂(DNA strand breakage)，最後由 DNA 聚合酶(DNA polymerase) 填入正確的鹼基與 DNA 連接 酶(DNA ligase)進行修補或 DNA 聚合酶直接由 5'端進行複製直接取代去鹼基位 置的 DNA 之修復途徑(Boiteux and Guillet 2004) (Hoeijmakers 2001)；(2)核苷酸切 除修復(nucleotide excision repair)：針對鹼基上化學結構的改變時的修復機制，
用以修復胸腺嘧啶二聚體(thymine dimer)，首先，解螺旋酶(helicase)分離 DNA 的兩股，接著由內切酶(endonuclease)從 3'端將含去氧核醣之磷酸骨架(包含二聚 體)切除，最後同樣以 DNA 聚合酶(DNA polymerase)與 DNA 連接酶(DNA ligase) 進行修補(Hoeijmakers 2001)。經由以上修復途徑後，這些被切除下來的 DNA 共 價鍵結物會經由尿液排出體外(Singh and Farmer 2006)。
不論 DNA 共價鍵結物是直接經由基因複製造成突變，亦或是修復過程中導致 基因突變，皆是誘導癌症形成的因素(Singh and Farmer 2006)。而這些 DNA 共價 鍵結物的濃度與化學因子的暴露、飲食、生理狀況…有關，當其濃度越高時，
罹患癌症的風險也相對提高，因此，DNA 共價鍵結物的生成量被認為是生物有 效劑量之指標(biologically-effective doses) (Chen and Hong 2001)，分析化學物 DNA 共價鍵結物形成的情形，有助於釐清法定遺傳毒性測試(statutory
genotoxicity assays)與動物的生物毒性測試(animal bioassays)的不尋常或令人費 解處(Phillips, Farmer et al. 2000) 。
1.2.2 環氧黃樟素致癌機制的相關研究
常見的工業原料苯乙烯(styrene)於代謝過程中所形成的環氧代謝產物，為已知 可能人類致癌物質環氧苯乙烯(Styrene-7,8-oxide)，會經由麩胺基硫轉移酵素
6
呤 DNA 共價鍵結物、與 2'-去氧胞嘧啶 N3-、N4-位置取代之胞嘧啶 DNA 共價 鍵結物以及與胸腺嘧啶反應形成 N3-位置取代之胸腺嘧啶共價鍵結物。(Pongracz, Kaur et al. 1989);(Tretyakova, Lin et al. 1997); (Koskinen and Plna 2000);(Koskinen, Vodicka et al. 2000); (Munter, Cottrell et al. 2002); (Boysen, Pachkowski et al. 2009)，
由表可知 N3-、N1-/6-取代之腺嘌呤共價鍵結物與 N7-取代之鳥糞嘌呤共價鍵結 物是環氧代謝產物與雙股螺旋 DNA 反應生成最多之 DNA 共價鍵結物，而環氧 黃樟素的結構與環氧苯乙烯相似，因此，Qato 等人將環氧黃樟素分別與小牛胸 腺 DNA 和 2'-去氧鳥糞嘌呤行體外反應，搭配32P-後標籤法分析發現有至少九種 DNA 共價鍵結物的產生，同時進行動物實驗，卻無法在暴露單一劑量環氧黃樟 素(600 μmol/kg)之老鼠體內偵測到 DNA 共價鍵結物(Qato and Guenthner 1995)，
而作者推論主要原因為環氧黃樟素能夠經由麩胺基硫轉移酵素(glutathione S-transferase)和環氧化合物水解酶(epoxide hydrolases)去毒化過程中被代謝(Luo, Qato et al. 1992) (Luo and Guenthner 1994) (Luo and Guenthner 1995)。我們實驗室 的沈瑮卿學姐使小鼠暴露單一劑量之環氧黃樟素(30 mg/kg body wt)後，分別收 集 24、48、72 小時的尿液，發現可以在尿液中偵測到環氧黃樟素在 N7-位置取 代之鳥糞嘌呤 DNA 共價鍵結物
(N7-(3-benzo[1,3]dioxol-5-yl-2-hydroxypropyl)guanine, N7γ-SFO-Gua)，而其半衰 期約 60 小時，證實環氧黃樟素能夠在動物體內生成 DNA 共價鍵結物(Shen, Chiang et al. 2012)，與前人研究證實在環氧黃樟素處理過的小鼠的紅血球細胞中 的微核和 DNA 鏈斷裂的頻率增加的結果是一致的，環氧黃樟素對於小鼠具有基 因毒性(Chiang, Lee et al. 2011)，然而，為了探討環氧黃樟素是否也是黃樟素的 致癌機轉之一，仍需作進一步研究。
1.2.3 DNA 共價鍵結物的分析方法
目前有數種用以定量 DNA 共價鍵結物的方法，分別是32 P-後標籤法 (32
P-post-labelling)、螢光與電化學檢測法(fluorescence and electrochemical detection)、
免疫分析法(immunological methods)、質譜法(mass spectrometry)，以上方法之優 劣如表 二 (Brown 2012)。32 P-後標籤法的發展始於 1980 年代初期，此方法利 用 T4聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)將[γ-32P]ATP 上的32P 標記之磷酸基 團(32 P-containing phosphate group)轉移至帶有共價鍵結物的去氧核糖
(2-deoxyribose)上的 5’-OH 端(圖 六)(Phillips and Arlt 2007)，雖然此方法具有高 靈敏度以及較小的樣本量(1-10 μg DNA)，卻不適合用以分析核苷鍵不穩定之 DNA 共價鍵結物，也不具有高專一性(Himmelstein, Boogaard et al. 2009) (Koc and Swenberg 2002) (Swenberg, Fryar-Tita et al. 2008)。螢光與電化學檢測法則是根據 部分共價鍵結物固有的特性，特別是螢光或氧化還原的性質，可分別使用螢光 光譜儀與電化學偵測儀器搭配高效能液相層析儀(high performance liquid
chromatography, HPLC)或電泳(electrophoresis, CE)去分析，高專一性但缺乏靈敏 度，且只能夠分析具有螢光、電化學活性特性的共價鍵結物(Brown 2012)。免疫 分析法分成數種，主要原理為利用抗原與抗體結合之特異性，在附著抗原的免 疫分析盤(well)加入含有抗體的分析物，若是分析物存在共價鍵結物，則抗體與 共價鍵結物結合；若無，則抗體與分析盤上抗原結合，經由沖洗後，含有共價 鍵結物與抗原結合物會被移去，分析盤經由酵素、受質(substrate)處理後進行定 量分析，具有高專一性但缺乏靈敏度(Santella 1999) (Brown 2012)。質譜法的基 本原理為使有機或無機的化合物產生離子，除了可提供化合物構造外，也能利 用分子產生離子的質荷比(mass-to-charge ratio, m/z)來區分不同的化學物質，達到 定性的功能，以及以波峰面積(peak area)達到定量的功能，因為質譜法能同時定 已知的同位素稀釋質譜法(isotope dilution mass spectrometry, IDMS) (Vogl and