八、細菌生長曲線之測定
將pCAMBIA1302 載體中的水母綠螢光蛋白基因 (Green fluorescent protein, GFP) 以PCR方法選殖並轉接至pBS和pET24b載體上，利用的PCR引子分別為：
GFP-1, 5’-CAGGGATCCG AGT AAA GGA GAA GA -3’ (底線為Bam HI切點) 和 GFP-2, 5’-CTCAAGCTT GTA TAG TTC ATC CAT G -3’ (底線為Hind III切點)。
隨後將pBS、GFP/pBS和Osm30/pBS等三種載體分別轉形入E. coli XL1-Blue菌 株，而GFP/pET24b和Osm30/pET24a也分別轉形入E. coli BL21 (DE3) 菌株中。前 培養是分別挑取單一菌株至 3 ml含合適抗生素 (pBS和pET24 載體分別使用 50 mg/L amplicillin和 50 mg/L kanamycin) 的LB培養液中，在 37℃以 200 rpm轉速震 盪過夜培養；預培養是取40 μl培養過夜的菌液，加至 3 ml LB培養液中，培養至
有三個蛋白質呈現此一特性。將這些可水解glycol chitin 的蛋白質帶自活性膠體 YWGQN GDEXS LADA』，其中有一個胺基酸無法判讀以 X 表示，經與 GenBank 資料庫進行序列比對 (BLASTP) 後得知，Osm30 的 N 端胺基酸序列與植物的第 GenBank資料庫中登錄編號為D55713 (Nagasaki et al., 1997) 的cDNA比較，除了 短少從5’端開始的 78 個核苷酸序列之外，兩者其他部份的序列完全相同。由於 Osm30 為一被分泌到培養液中的蛋白質，故推測D55713 與Osm30 其實為同一個 基因，而D55713 5’端多出來的 78 bp應為生成Osm30 蛋白質之分泌訊息序列的基 因片段。而在水稻基因組資料庫中搜尋的結果則顯示，Osm30 基因是位於水稻第 一對染色體上 (Os01g47040)。此外，Osm30 的序列中含有第 18 族醣苷水解酵素 所特有的兩段與活性有關之保守區位：「SXXG」—「98 VKVILSIGG 106」和
「DXXDXDE」—「145 LDGVDFDIE 153」(圖二，繪實線區域)。
由於Osm30 在蛋白質層次的表現分析，需要有抗體作為檢測的探針，因此，
柱純化重組蛋白質。由於鎳離子吸附管柱純化出的 Osm30 重組蛋白質樣品，仍 含有少數不相干的蛋白質，為確保 Osm30 抗原的純度，我們將鎳離子吸附管柱 純化的 Osm30 重組蛋白質樣品，進行 SDS-PAGE 分離，並在染色後，切下含 Osm30 重組蛋白質的膠條，經回收蛋白質並定量後，對兩隻紐西蘭白兔分別進 行一系列的免疫注射。免疫注射完成後，抽取白兔的血液，並分離血球，隨後將 血清進行系列稀釋，以檢測抗體的效價範圍。結果顯示稀釋了十萬倍的抗血清，
仍可檢測到含量約30 ng 的 Osm30 蛋白質。在後續的實驗中，我們利用三萬倍 的抗體稀釋液，來進行免疫轉漬分析試驗，以檢測水稻細胞中 Osm30 蛋白質的 表現情形。
三、Osm30 在水稻細胞的生理表現情形
北方轉漬分析的結果顯示 (圖三 A)，Osm30 的 mRNA 在水稻細胞進行繼代 培養後的 3-12 小時之間會被誘導增加表現，隨後表現量逐漸降低，於培養 3-7 天時已降低到幾乎無法被偵測的含量。西方轉漬分析的結果則顯示，在懸浮培養 的過程中，水稻細胞內的Osm30 蛋白質呈現持續且穩定的表現 (圖三 B)；而在 培養過程中，其在培養液內的含量則隨培養天數的增加而持續累積 (圖三 B)。
四、真菌感染會增加 Osm30 表現
已知許多種植物之幾丁質酶在真菌感染、誘引劑，或其他多種逆境因子的 刺激而誘導表現 (Collinge et al., 1993; Patil et al., 2000)。為了解真菌病原菌是否 會誘導 Osm30 基因的表現，我們在水稻細胞繼代培養時，於懸浮培養液中分別 接種 4 種水稻的病原菌：Rhizoctonia solani、Sarocladium oryzae、Gibberella fujikuroi 和 Bipolaris oryzae。處理 12 小時後，收集水稻細胞，並萃取其 RNA 以 進行北方轉漬分析，同時收集培養液，以分析 Osm30 蛋白質的分泌量。結果發 現，上述的四種病原菌都會使Osm30 幾丁質酶基因增強表現 (圖四 A)；其中以 G. fujikuroi 的誘導效果最佳，B. oryzae、S. oryzae 和 R. solani 依序次之。而西方 免疫轉漬分析的結果也顯示，感染病原菌三天後的水稻細胞培養液中，含有比對 照組較高的Osm30 蛋白質含量 (圖四 B)。
五、Osm30 重組蛋白質會抑制細菌生長
我們利用了兩種不同型態的載體來裝載Osm30 的 CDS (coding sequence 不 含分泌訊息序列)：選殖型載體 pBS 和表現型載體 pET24，並分別將其轉形到大
第五節 討論 α-amylase 基因的表現會受醣分的代謝調控；而 α-amylase 基因的啟動子則被開發 應用於導引異源基因的表現 (Chan et al., 1994)。本實驗室選用水稻懸浮培養細胞 之目的，主要想針對水稻細胞在懸浮培養過程中，所分泌出的蛋白質，進行一系 列的功能性鑑定。我們先前的研究已發現有一些與植物抗病防禦機制有關的 PR 蛋白質，會被分泌至水稻細胞培養液中，例如：thaumatin-like protein 和第 I 型幾 丁質酶等 (data not shown)，而本論文則主要針對一個新鑑定的第 III 型幾丁質 泌序列之外，其餘序列與GenBank中登錄為D55713 (Nagasaki et al., 1997) 的 cDNA clone完全一致。Osm30 若包含分泌序列，全長含有 301 個胺基酸，根據 ExPASy (http://www.expasy.org/) 上的軟體推算，Osm30 的分子量為 31 kDa；扣 掉分泌序列的胜肽鏈，則估算出的分子量為28.3 kDa，此結果與其在SDS-PAGE 上的 30 kDa有些差距，推測可能是由於轉譯後的修飾作用所造成；而醣化位的 分 析 結 果 顯 示 ， 在Osm30 的 C 端 胺 基 酸 序 列 中 ， 有 一 個 可 能 的 N- 醣 化 位 (N-glycosylation site)：「292 NFS 294」 (圖二)，由此可推測Osm30 可能是在醣化 作用後，導致其分子量增加為30 kDa。此外，分泌於培養液中的Osm30 (不包含
分泌訊息)，其等電點為pI 4.1，顯示Osm30 為酸性幾丁質酶；在pH值比其等電點 高的環境中，Osm30 的淨電荷為負值，因此不會吸附於陽離子交換管柱，且在 pH 10 的native gel中可輕易地往陽極移動，並在活性膠上保有原來的結構，故可 在膠上偵測到其幾丁質酶的活性。
Osm30 除了在酵素活性膠中呈現幾丁質酶的活性之外，我們也在其胺基酸 序列中發現含有醣苷水解酵素第十八家族的兩段活性位置：「98 VKVILSIGG 106」 和「145 LDGVDFDIE 153」(圖二)。已知植物第III和第V型幾丁質酶都是屬於醣苷 水解酵素第十八家族的成員，雖然第V型幾丁質酶亦有此兩段保守區域，但其分 子量比第III型幾丁質酶為大，介於 41-43 kDa之間 (Melchers et al., 1994)，故 Osm30 所呈現的序列特徵應屬於第III型的幾丁質酶。
但到了12 小時之後，表現量逐漸減少，到了第 3 天之後，Osm30 的表現量已降 表現；但當以四種病原菌：Rhizoctonia solani、Sarocladium oryzae、Gibberella fujikuroi 和 Bipolaris oryzae 感染水稻細胞時，雖然程度上會有所不同，但是無論 在RNA 或蛋白質層次上，Osm30 的表現量都有增加的現象 (圖四)，顯示病原菌 的感染會誘導水稻細胞產生更多的幾丁質酶。
Osm30 在水稻細胞內到底有何生物功能呢？植物的幾丁質酶除了可水解真 菌 的 幾 丁 質 細 胞 壁 外 ， 也 可 能 因 作 用 後 釋 放 出 乙 醯 葡 萄 醣 胺 寡 醣 (N-acetylglucosamine oligomer)，而誘發植物細胞產生植物殺菌素和表現 PR 蛋白 質等，故有許多文獻報導，植物的幾丁質酶主要是參與植物的防禦反應 (Collinge et al., 1993; Patil et al., 2000)。其次，也有報導 (de Jong et al., 1992) 指出，某些 幾丁質酶的作用對象並非真菌的細胞壁，而是分解植物細胞的內生性受質，包括 醣脂質 (glycolipids) 和醣蛋白 (glycoproteins) 等，而其水解產物則可能成為植 物發育所需的訊息分子，例如：胡蘿蔔的酸性幾丁質酶在其體胚發育初期，即被
植物被病原菌感染或受傷時，會產生誘引劑，來刺激植物體內產生相關的 植物生長調節劑，例如SA、JA 和乙烯，並主要藉由 JA 訊息傳遞路徑 [ethylene (elicitor)/JA-dependent pathway] 或 SA 訊息傳遞路徑 (SA-dependent pathway)，來 調控防禦機制中相關基因的表現 (Pieterse and van Loon, 1999)。我們的實驗結果 (cis-acting element)，包括：兩個與 JA 調控路徑有關的 GCC-box (GCCGCC, -1005 和-1100) (Fujimoto et al., 2000)；一個與 ABA 和 JA 訊息路徑皆有關，且已證實 可被AREB (ABA-responsive element binding protein, bZIP) 及 Myc (bHLH) 轉錄 因子所調控的G-box (ACGTG, -600) (Abe et al., 2003; Boter et al., 2004)；及一個 與低溫和乾旱逆境之調控路徑有關，可被 CBF1 等轉錄因子所調控的 DRE/CRT box (CCGAC, -1097) (Thomashow, 1999)。以上 Osm30 啟動子的轉錄調控位的分 析結果，與我們先前進行的植物生長調節劑實驗 (圖六) 的結果一致。
結構穩定，還同時兼具幾丁質酶和溶菌酶的雙重酵素活性，相信該蛋白質更具有 被應用於作物抗病育種的潛力。
第二章之圖、表
圖一、水稻細胞分泌性蛋白質的分析
圖一、水稻細胞分泌性蛋白質的分析
(A) 蛋白質的 12% SDS-PAGE 電泳結果。「AmS」為水稻細胞懸浮培養七 天後之培養液，加入硫酸銨至 80%飽和度沉澱濃縮之蛋白質。「MonoS-」為相 同的細胞培養液先收集 60-80%飽和度硫酸銨沉澱的蛋白質，再通過 Mono S 陽 離子交換管柱進行蛋白質吸附，其中不吸附而直接流過的蛋白質樣品即為
「MonoS-」。圖左「M」為蛋白質的標準分子量樣品 (BDH 442642L)。電泳完 畢後，膠片以Coomassie Brilliant Blue R-250 染色。 (B) 水稻細胞分泌性蛋白質 的幾丁質酶活性檢測結果。 「AmS」及「MonoS-」的蛋白質樣品在含 glycol chitin 的native gel 中電泳分離後，以剛果紅染色的結果。圖左的 (－) 與 (＋) 分別代 表陰極與陽極的方位。圖右的箭頭及旁側的數字代表有幾丁質酶活性的位置，及 這些幾丁質酶再以SDS-PAGE 推估出來的分子量。 (C) 為 Osm30 分泌性蛋白質 進行N 端胺基酸微定序的結果。
Figure1. Analyses of the rice proteins secreted by suspension-cultured rice cells.
(A) Medium proteins collected from a 7-d-old suspension culture of rice cells were concentrated by adding ammonium sulfate to 80% saturation (AmS). The collected from the flow-through fraction was designated MonoS-. These protein samples were electrophoretically separated in a 12% SDS gel, followed by staining with Coomassie Brilliant Blue R-250. The molecular masses of protein marker (M;
BDH 442642L) was labeled on the left. (B) Chitinase zymogram assay of medium proteins. Both AmS and Mono S- samples were electrophoretically separated in a native gel (pH 10) with 0.1% glycol chitin, incubated at 37℃for 2h, and stained with Congo red. The protein bands with chitinase activity were then excised and estimated for molecular masses, as shown in the right, in a different SDS gel. (C) The microsequencing result of the Osm30 secretory protein.
圖二、Osm30 的完整基因序列，與轉譯出之胺基酸序列
蛋白質全長為301 個氨基酸 (核苷酸 1-903)，從 N 端開始的前 26 個胺基酸 (核苷酸 1-78 bp) 為分泌訊息序列，劃框處為分泌到培養液中的 Osm30 蛋白質進 行N 端胺基酸微定序所得的序列 (核苷酸 79-135 bp)。圖中兩段繪實線處為第 18 族醣苷水解酵素的兩段保守序列，▲為活性位，繪虛線處指出可能的 N-醣化位，
「*」為轉譯終止密碼 (核苷酸 904-906)。
Figure 2. The nucleotide and deduced amino acid sequences of Osm30.
The predicated amino acid sequence (301 aa) is shown below the nucleotide sequence (903 bp). The first 26 amino acids were predicted to be the secretory signal sequence and the box displays the N-terminal amino acid sequence of Osm30. The underlines indicate the conserved regions of glycosyl hydrolase family 18, the triangle show the active sites, a dotted line show the putative N-glycosylation site and asterisk show the stop codon.
圖三、Osm30 在水稻懸浮培養細胞中的表現情形
圖三、Osm30 在水稻懸浮培養細胞中的表現情形
(A) 為 Osm30 mRNA 的北方轉漬分析結果。「0」為已培養七天，準備進 行繼代培養的細胞，「3 h」- 「7 d」分別代表繼代培養後 3 小時到 7 天的細胞
(A) 為 Osm30 mRNA 的北方轉漬分析結果。「0」為已培養七天，準備進 行繼代培養的細胞，「3 h」- 「7 d」分別代表繼代培養後 3 小時到 7 天的細胞