uridine（BrdU）取代 DNA 上的 thymine。再加上 1974 年 Perry and Worff
(44)發展出 Hoechst 33258 作用及吉氏染劑（Giemsa）的染色方法，使 姊妹染色分體交換可由染色深淺對比情形，藉一般普通光學顯微鏡觀
（Giemsa）會與 DNA 結合，所以 BT-BB 染色在照射紫外光後，BB
染色分體著色就比 BT 染色分體淺。
3. 抽煙習慣：為目前已被確定的影響因素，且大部分的研究結
6. 藥物：部分抗癌藥和 nalidxic acid 治療及 metranidazole、
actinomycin D 等致突變性藥物治療後 SCEs 會增加，但無統計 上顯著的意義。
7. 職業性致癌劑、致突變劑暴露：許多研究皆已證實職業性致 癌、致突變劑的暴露會促使 SCE 增加。
（二）與淋巴球培養有關的因子(culture associated factors)
1. BrdU 的濃度：培養基中 BrdU 的濃度影響最大，當 BrdU 濃度
5. 培養基中所使用的血清：Mcfee 和 Sherrill 以四種不同的血清分 頻率。Fanconi’s 貧血症的細胞經由 alkylating agents 的誘發使 SCEs 產 生 變 化 。 著 色 性 乾 皮 病 (Xeroderma pigmentosum) 在 alkylating agents 或 Ultraviolet light 的誘導下其 SCEs 會產生變 化。
四、姊妹染色分體交換與 DNA 修復酵素
1990 年 Hartwig(60)等人，以 SCE 作為 DNA 損傷的一個指標，
探討不同鉛離子濃度(1μM, 5μM 及 10μM)對 V79 細胞之影響。
發現在培養液中只有鉛離子存在時，SCE 不會隨著鉛離子濃度的增 加而遞增。但是，不同的鉛離子濃度加上相同劑量的 UV 照射後，
其 SCE 頻率顯著的高於只用 UV 照射。1987 年 Frenkel 等人指出 80-150μM 的醋酸鉛濃度，會抑制 HeLa 細胞切除修補機制中的 DNA 聚合酵素α及 RNA 聚合酵素 II(polymerase II)之功能，1979 年 Popenoe 等人的結果顯示出低濃度(10μM)的鉛會抑制 DNA 聚合酵 素β及連接酵素(ligase)，250μM 氯化鉛會抑制修復系統造成 DNA 損傷的增加，進一步造成 SCE 交換頻率的增加。
第參章、材料與方法
一、供試藥物
A、 SCE ( Sister Chromostid Exchange ) 1. RPMI 1640 (GIBCO BRL)
2. Foetal Bovine Serum (GIBCO BRL) 3. Phytohemagglutinin (GIBCO BRL) 4. 5-Bromo-2'Deoxyuridine ( Sigma) 5. Penicillin-Streptomycin (GIBCO BRL)
6. KaryoMAX Colcemid® Solution (GIBCO BRL) 7. 0.075N Potassium Chloride
8. 醋酸 (Merck) 9. 甲醇 (Merck)
10. 磷酸緩衝液( Sigma) 11. Giemsa’s solution(Merck) 12. Hoechst 33258
B、 PCR(Polymorphism chain retraction)ALAD Genotype 1. DNA Extraction WB Kit (Wako)
2. Isopropanol (GIBCO BRL) 3. Agarose (Sigma)
4. Ethidium Bromide Solution 5. 1.5 mM 10X PCR buffer 6. 2.5 mM DNTP all4
7. ALAD (F) primer secquence (Applied Biosystems) AGACAGACATTAGCTCAGTA
ALAD (R) primer secquence
GGCAAAGAACACGTCCATTC
8. Template
9. Taq Polymease (Protech)
10. Msp I restriction enzyme(Protech) 11. RE 10X buffer
12. BSA
13. 100bp Ladder(Protech) 14. 5X TBE buffer (Amresco)
C、 Blood Lead Levels 1. 去離子水
在 25℃下其比電阻（Specific resistance）至少為 18.3M Ω-cm 以上。
6.混合血液（pooled whole blood），正常人全血（血鉛濃度小於 10ug/dl 者）約 50ml。
二、試驗材料
1.紫頭採血管 2.綠頭採血管 3.22 號真空採血針
4.Pipetted ( 1ml,2ml,5ml,10ml ) 5.酒精燈
6.15ml 離心管
7.燒杯（100ml,250ml,500ml,1000ml）
8.乳頭吸管
9.載玻片(Micro Scope Slides)FEA 10. 蓋玻片(Marienfeld)
11. 量筒（100ml,250ml,500ml,1000ml）
12. 試管架
13. reach pipet tips (白、黃、藍) 14. 鉛元素中空陰極燈管
15. 熱解塗覆處理石墨管(Pyrolytically coated graphite tube)
三、試驗儀器
1.高速離心機(Kubota 5100,1300) 2.無菌操作台 Bio-Hazard Safety Hood 3.Incubate(Espec BNA-211)
4.4℃雙門冰箱
5.恆溫水浴槽 Firstek Scientific 6.電動吸取器 Stripettor (Costar) 7.電動馬達 Motor division (Emerson) 8.slide warmer(Fisher)
9.UV 照射系統
10. DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer)
11. 電泳槽 Mini Gel Migration Trough (Cosmo-Bio) 12. -20℃冰櫃(Caravell)
13. PH meter 320(Corning) 14. Mettler Toledo AG245 15. Type 16700 Mixer 16. Nikon Type 104
17. Polaroid 簡易型照相系統
18. Model TC-312A Transilluminator(312nm Ultraviolet) 19. 原子吸收光譜儀
20. 石墨爐電熱原子化裝置 21. 轉動混合機
第一節、研 究 對 象
選 取 中 部 某 鉛 蓄 電 池 工 廠 作 業 員 工 26 名 作 為 高 暴 露 組 ， 並 隨 機 選 取 行 政 人 員 31 名 作 為 低 暴 露 組 ， 且 以 性 別 、 年 齡 、 抽 煙 習 慣 之 條 件 配 對 選 取 30 名 健 康 人 作 為 對 照 組 ， 共 計 87 名 。 皆 建 立 完 整 的 問 卷 資 料 。
第 二 節 、 研 究 方 法
一 、 問 卷 (附 錄 六 )
本 研 究 針 對 鉛 作 業 工 廠 及 考 慮 影 響 SCEs 之 相 關 因 素 後 設 計 問 卷 ， 問 卷 資 料 之 收 集 是 以 個 人 訪 視 方 式 進 行 ， 內 容 包 括 個 人 基 本 資 料 （ 姓 名 、 年 齡 、 教 育 程 度 、 婚 姻 狀 態 ）、 工 作 的 年 資 、 及 生 活 習 慣 （ 如 抽 煙 、 喝 酒 、 喝 茶 、 喝 咖 啡 、 或 服 用 其 他 藥 物 等 習 慣 ）。
二 、 血 液 樣 本 之 收 集 與 儲 存
血 液 為 避 免 外 在 污 染 ， 採 樣 個 案 在 接 受 採 樣 前 採 樣 部 位 需 徹 底 進 行 消 毒 ， 每 名 研 究 對 象 接 抽 取 10 ml 的 靜 脈 血 ， 其 中 5 ml 置 於 含 有 EDTA 試 管 中 作 為 抽 取 DNA 及 血 中 鉛 的 測 定 用，另外 5 ml 置 於 含 有 Heparin 試 管 中，做 為 細 胞 培 養 用 。 未 能 立 即 分 析 之 血 液 樣 本 皆 儲 存 於 4℃ 冰 箱 ， 所 有 樣 本 均 需 在 一 星 期 內 分 析 完 畢 。
三、姊妹染色體交換頻率之測定(附錄五)
以含 Heparin 之真空採血器採血，並於當天完成細胞培養。每一 次 的 培 養 與 製 片 過 程 均 採 同 一 步 驟 。 於 培 養 基 中 加 入 PHA (Phytohemagglutinin) 刺 激 淋 巴 球 生 長 分 裂 ， 並 加 入 Brdu (5-Bromo-2’deoxyuridine, 10ug/ml)取代 Thymidine 進行複製，再於培 養 68 小時後加入 Colcemid，使染色體中止於 metaphase，而後再於 70 小時時進行採收及滴片。
採收時，加入 0.075N 的 KCL 低張溶液使淋巴球脹大，再以 Methanol：Glacial Aceticacid = 3：1 之溶液進行固定。玻片染色則採 Fluorescence plus Giemsa 方法。
計算 SCE 時，每一人將隨機取 30 個染色對比清楚的第二個細胞 週期之細胞計數其 SCE，以此 30 個細胞之 SCE 平均值代表每一人的 SCE。而整個計數過程均採盲目措施且使用同一台顯微鏡。
SCEs 的檢出
觀察中期染色體的細胞，每個對象皆觀察 30 個細胞，發生於著 絲點的交換，可能為染色分體扭轉之現象，故不列入 SCEs 計算。排 除抽煙者後，對照組中所有細胞之 SCEs 累積分布可得小於 5%的細 胞定義為高姊妹染色分體交換頻率細胞（High Frequency Cel1s，簡 稱 HFCs），每個對象若於所計算的 30 個細胞中有 4 個等於或大於 HFCs 之值，則此對象定義為異常個體。
SCEs 重複計數
N Cell Mean ± SD P-value 第一人 10 300 5.69 ± 0.65 0.805 第二人 10 300 5.67 ± 0.61
姊妹染色分體交換頻率圖
（箭頭處即計數為一次交換）
四、基因型檢定
ALAD 基因是否有缺失，可利用聚合酵素鏈鎖反應檢測。聚合 酵素鏈鎖反應是由白血球萃取所得之 DNA 1ug，加入增幅所需的引 子(primer)『ALAD (F) primer secquence AGACAGACATTAGCTCA GTA (R) primer secquence GGCAAAGAACACGTCCATTC』，去氧核 甘三磷酸(dNTP) 、10X 聚合酵素緩衝溶液以 94℃ 3min 、55℃
3min 進行 3 cycle 的 pre-PCR 步驟反應後再加入 Taq 聚合酵素(Taq polymerase)最後體積以 dH2O 調成 50 ul。反應條件為 94℃ 2 分鐘 使雙股 DNA 變性；依引子序列而計算出重旋(annealing)所需之溫度 55℃ 10s、71℃ 30s、94℃ 30s 的條件循環反應 35 次，最後在增 幅後由 MspI endonuclease 消化酵素（含突變點），會產生長度為 511 及 582 二種。MspI 在 37℃、1 小時會被消化，其產物由 3% agarose
gel 電泳產生。ALAD1-1 phenotype 個體其 PCR 產物為 582bp，
ALAD1-2 phenotype 個體其 PCR 產物為 582、511bp，ALAD2-2 phenotype 個體會出現 511bp(見下圖)。
此圖為 ALAD 基因電泳攝影圖
（其中 2、7 為 1-2 基因型，其餘均為 1-1 基因型）
五、血液中鉛元素之測定（石墨爐原子吸收光譜法）
將全血經一定比例稀釋後，再將樣本注入已經標準校正的石 墨爐原子吸收光譜儀中 Perkin Elmer 5100 AAS 中，進行鉛元素 的測定。
(1) 樣本前處理
取混合均勻的全血加 0.9ml 的 1%Triton X-100(Merck)，以 1：
9 稀釋，檢體均質化之後，利用 autosampler 系統，送入原子吸收
916bp 916bp
582bp 511bp
8 7 6 5 4 3 2 1 M
光譜儀測定。
Background Zeeman background correction Tube type Pyro/Platform
Sample volume 20ul
使用 ZPP Hematofluorimetry(Aviv/Model 206，Biomedical Inc.)
直接測量 ZPP 值。
測定方法
1.測定前先溫機 20 分鐘。
2.以空白標準蓋玻片（AVIV，ZPP 測定專用）將儀器校正為 零。
3.以三種不同濃度的標準血液做儀器校正，其前後兩次校正之 變異均小於 3％。
4.從混合均勻之試管取一滴血在蓋玻片上，放入儀器中測定，
取其連續三次之平均值，做為 ZPP 之測定值。