宮崎大學 Kanmura 等醫師使用表面強化雷射解吸電離飛行質譜 技術(Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization

(十一十一十一十一) ) ) ) 腫瘤標記︰腫瘤標記︰腫瘤標記︰腫瘤標記︰

理想中的腫瘤標記(tumor marker)能有效鑑別出良性與惡性腫 瘤，最方便取得的方式應該是抽血，以不會太貴的試劑偵測血清中的 蛋白質，可以用於大規模篩檢[44]。其結果要能測得早期癌症、癌症 的復發以及預測對治療的反應，但是目前所使用的 AFP 敏感度不高，

仍然有待開發更好的腫瘤標記[45]。

宮崎大學

Kanmura 等醫師使用表面強化雷射解吸電離飛行質譜

Time-of-Flight Mass Spectrometry，SELDI-TOF/MS)的蛋白質晶片 來找新的腫瘤標記，更快，更多資訊，只需少量的血，但還在實驗室

同一種腫瘤標記在用來篩檢和用來診斷的判讀值應當不同。篩檢 值異常才會引起注意，接受進一步檢查，因此臨界值(cut-off value) 降低，可以提高敏感度，但犧牲了特異度，增加偽陽性率。若提高臨 界值，可以提高特異度，但犧牲了敏感度[4]。

( ((

(十一之一十一之一十一之一十一之一) ) ) ) 甲型胎兒蛋白甲型胎兒蛋白甲型胎兒蛋白甲型胎兒蛋白(AFP)(AFP)(AFP)(AFP)

甲型胎兒蛋白(alpha-fetoprotein，αFP，AFP)屬於 α-1 球蛋 白，是一個分子量 70 仟道耳吞的單鏈糖蛋白，分子結構包含 591 個 胺基酸及 4%碳水化合物，由第四對染色體長臂(4q11-q13)基因調控，

在人類胎兒的肝臟、卵黃囊及胃腸道等處，由中胚葉起源的細胞 (Mesoderm-derived cells)所合成分泌，半衰期 5 到 7 天[47]。可經 由胎兒的腎臟排入尿液、羊水，並通過胎盤進入母體血液中。在正常 妊娠時，胎兒血清之 AFP 濃度於妊娠第一期，約 12-14 週達到最高，

而母體血清中之濃度於 28-32 週間達到最高值。如果羊水或母體血清 中 AFP 超過正常範圍，需考慮母親多次懷孕或胎兒發育異常；諸如：

神經管缺陷、先天性腎病變、腹壁缺陷、腸道閉鎖、死胎、胎兒窘迫 等等，懷有唐氏症兒 Down syndrome 或愛華氏綜合症三染色體 18

(Edward's Syndrome Trisomy 18)之孕婦其血液中 AFP 則偏低。AFP 雖是一項非特異指標，但對產前評估胎兒健康狀態甚具臨床價值，是 幫助檢查胎兒異常的一項篩檢工具。AFP 在正常成人血清中雖低，但 仍測得到。

1963 年 Abelev 等人首先發現老鼠的肝癌會製造甲型球蛋白 (Alpha–Globulin)[48]，次年俄國人 Tatarinov 發現人類肝癌病患 也會產生胎兒甲型球蛋白(Embryo -Specific Alpha -

Globulin)[49]，四十多年以來 AFP 一直被用於篩檢肝癌的血清腫瘤 標記，但敏感度也一直受爭議[4, 50, 51]。在 1990 年代有三篇設計 完善的研究，以 AFP 篩檢肝癌顯示敏感度 39﹪到 64%，特異度 76﹪

到 91%，陽性預測值 9﹪到 32%[38, 39, 52]。2001 年義大利 Trevisani 等比較 170 位肝癌和 170 位慢性肝病患者，選擇 AFP 篩檢值 20 ng/ml 來預測肝癌，敏感度與準確度有最佳平衡，各為 60%與 90%。這表示 要想從慢性肝病、肝硬化的病患中以 AFP 大於 20 ng/ml 來預測肝癌，

警示應啟動進一步放射線檢查，會發生 40%肝癌病患因為 AFP 小於 20 ng/ml 而沒有啟動進一步放射線檢查，導致延誤診斷[53]。

一般取篩檢值 20 ng/ml 以上要懷疑有肝癌[53]。約 75%的進行 性肝癌其血清 AFP 值高於正常值，但是急、慢性病毒性肝炎合併嚴重 壞死性發炎、肝硬化、肝臟損傷、孕婦、睪丸癌等患者，其血中 AFP

值也會上升到 10 到 500 ng/mL 甚至 1000 ng/mL 卻不是肝癌[54]。急 慢性肝炎患者，其血中 AFP 常隨著肝細胞壞死後再生而升高，其高峰 往往在轉胺酶的高峰之後，其升高程度間接地反應肝細胞壞死(橋聯 壞死，Bridging Hepatic Necrosis)後的再生能力，因此常被用來作 為病理變化及病程預後的參考，可能與肝臟幹細胞(橢圓細胞，oval cell)有關[55, 56]。雖然在慢性肝炎的病患也可能出現 AFP 高達 2520 ng/ml 的情況[56]，在其他惡性腫瘤及非癌肝病只有 0.8 %病患的 AFP 會高於 400 ng/ml[57]，因此肝癌的 AFP 診斷值通常設定為 400 ng/ml，門檻低於 1974 年設定的 500 ng/ml[58]。

臨床上若診斷出肝癌時 AFP 已經升高，也可用 AFP 來評估治療效 果，追蹤有無復發或轉移[59]。大約 40%左右的肝癌病人其 AFP 值仍 小於 20 ng/ml [53]，若未加做腹部超音波的檢查也無法察知有小型 肝癌，因此以 AFP 單獨作為肝癌篩檢的工具並不恰當。這也是 Sherman 批評 McMahon 自從 1980 年代中期在地廣人稀的阿拉斯加單獨使用 AFP 作為肝癌篩檢的工具，未加做腹部超音波的檢查的做法仍不適當的原 因，他們以濾紙上乾燥的血滴(室溫可以保存一個月以上[60])檢驗 AFP 濃度，陽性才後送到安克拉治進一步檢查，雖然號稱敏感度 94.1%，特異度 99.9%，但發現的可能都是晚期肝癌[61-63]。

AFP 的表現特性不因慢性 B 型或 C 型肝炎的感染不同而有差異

[53]。比較五篇研究分析 AFP 與慢性 C 型肝炎相關的肝癌的關係，發 現取 AFP 值大於 20 µg/L(ng/ml)為篩檢標準，敏感度只有 41﹪到 65%，準確度有 80﹪到 94%；取 AFP 值大於 200 µg/L 為篩檢標準，則 敏感度只有 20﹪到 45%，準確度有 99﹪到 100%[64]。若混入其他原 因造成的肝癌(慢性 C 型肝炎相關的肝癌約占 50%，混入慢性 B 型肝 炎相關或酒精性肝硬化相關)分析，則 1158 位病患中有 46% AFP 值小 於 20 ng/ml，36% AFP 值介於 21 到 400 ng/ml，18% AFP 值大於 400 ng/ml，取 AFP 值大於 20 ng/ml 為篩檢標準，敏感度只有 54%[65]。

以免疫組織染色染肝癌組織的 AFP 表現，染色強度及總面積與血 清中 AFP 值有相關[66]。早期報告血中 AFP 值與肝癌細胞組織型態無 關，但同一位病患的 AFP 與腫瘤持續變大、切除後復發與轉移有正相 關[59]。後續報告肝癌屬於分化不良的患者，血中 AFP 值較高[57]。

AFP 值大於 400 ng/ml 與肝癌分化不良(Edmonson score)有正相關 [65]。

AFP-L3 則是 AFP 的一種糖型(glycoform)。AFP 與凝集素(lectin) 中的小扁豆凝集素(lens culinaris agglutinin，LCA)結合力不同可 分成的三種不同的糖型：AFP-L1、AFP-L2 及 AFP-L3。AFP-L3 能和小 扁豆凝集素結合，故直稱 Lens culinaris agglutinin reactive AFP。

AFP-L3 診斷肝癌的敏感度 36%到 96%，特異度 53%到 94%[67]，雖然

有報告指出以 AFP-L3 在 AFP 中所佔比率升高大於 10%，比單一 AFP 值有較高的診斷能力[68]。但考慮到 AFP-L3 若在 AFP 小於 18 ng/ml 的 情 況 下 ， 會 有 92% 測 不 到 而 沒 有 數 據 值 (non-dectable or non-reportable value)[67]，且只能將血清郵寄到美國 Wako 公司檢 測，提供數據值，報價很高，若又是很多測不到數據值，在研究經費 有限的情況下，我們放棄 AFP-L3 的研究。

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(十一之二十一之二十一之二十一之二) ) ) ) 脫羧基凝血酶原脫羧基凝血酶原脫羧基凝血酶原脫羧基凝血酶原(DCP(DCP(DCP(DCP，，，PIVKA，PIVKAPIVKA-PIVKA---II)II)II)II)

脫羧基凝血酶原(des-γ-carboxy prothrombin，DCP或protein induced by vitamin K absence or antagonist II，PIVKA-II)是異 常凝血酶原。凝血酶原(Prothrombin)是一個分子量72仟道耳吞的糖 蛋白，是倚賴維生素K的血漿凝血因子，由肝臟製造，含有一個天門 冬醯胺(asparagine)糖基複合物。凝血酶原的前驅物的胺基端結構域 (NH2-terminal domain)包含10個麩胺醯胺(glutamine)的醯胺殘基 (amide group)，在維他命K存在或是它由肝細胞粗糙內質網排出時，

其醯胺殘基會接受γ羧化(γ-carboxylation)而形成活性凝血酶原。

當凝血酶原不正常時，其中的部分或全部10個麩胺醯胺殘基 (glutamic acid residues)都不會被作用，稱為脫羧基凝血酶原 (des-γ-carboxy prothrombin，DCP)或通過維生素K缺乏或拮抗劑誘

導的蛋白質(protein induced by vitamin K absence or antagonist II，PIVKA-II，異常凝血酶原)，半衰期40到72小時[69, 70]。肝癌 組織因為基因缺損不能合成羧基化凝血酶原，以致血清中出現此種異 常凝血酶原，不具有凝血功能[71]。PIVKA II的缺點是血液中維生素 K低下的病人即使沒有肝細胞癌也能出現陽性反應，長期阻塞性黃 疸、肝內膽汁鬱積維生素K低下、服用Warfarin、維生素K及某些抗生 素都會影響到PIVKA II的正確度[70, 72, 73]。

Liebman等於1984年首度報告以多株抗體進行放射免疫分析 (Radioimmunoassay，RIA)發現肝癌病患有較高的血清PIVKA-II濃度 [74]。其後PIVKA-II就被當成肝癌的血清腫瘤標記之一，因為慢性肝 炎與肝硬化的病患血清PIVKA-II很少升高，對肝癌較有特異性，但敏 感度極低，尤其是小肝癌，變成和AFP一樣無法偵測出早期肝癌 [75-77]。其後以血清酵素免疫分析法(Enzymeimmunoassay，EIA或 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)發展出新一代高敏感 度分析組(high-sensitive assay kit)[78]，就有了比較好的偵測效 果[79-83]。目前的臨界值設為40 mAU/ml (1 arbitrary unit 等於1 μg/ml凝血酶原)，各篇報告的敏感度有48﹪到62%，特異度有81﹪到 98%，正確性有59﹪到84%[70, 84-91]。相對於這些文章中的AFP敏感 度有40﹪到54%，特異度有88﹪到97%，並不遜色。研究報告DCP陽性

的肝癌比DCP陰性的肝癌有更高比率的肝內轉移、門靜脈侵犯、肝靜 脈侵犯、包膜侵犯[74, 92-95]及較差的存活率[72]。

因為DCP與AFP彼此都不相關，兩者的敏感度也都不太好，義大利 Grazi報告將兩者混合測試能提高準確度，DCP及AFP的敏感度、特異 度及準確度分別為:53.3﹪，88.1﹪，71.1%與54.9﹪，97.4﹪，76.6%，

兩者合測為74.2﹪，87.2﹪，80.9%[88]，其他的報告也有提高肝癌 偵測敏感度、特異度的效果[72, 91, 96]。將DCP與AFP-L3混合測試 也能提高肝癌偵測敏感度[97]。

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(十一之三十一之三十一之三十一之三) ) ) ) 磷脂肌醇蛋白聚糖磷脂肌醇蛋白聚糖磷脂肌醇蛋白聚糖磷脂肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)3 (GPC3)3 (GPC3)3 (GPC3)

磷脂肌醇蛋白聚糖 3(Glypican-3 ，GPC3)是硫酸乙醯肝素糖蛋 白(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)的一個成員，分子量 69 仟道耳吞，分子結構包含 580 個胺基酸，調控基因 GPC3 位於 X 染色 體長臂(Xq26.1)[98]。它藉由糖基化磷脂醯肌醇(glycosyl-

phosphatidylinositol)共價結合而錨定在細胞表面。硫酸乙醯肝素 糖蛋白(HSPG)廣泛存在於哺乳動物的細胞表面，主要有兩大類：一類 屬於穿越膜的蛋白聚醣，稱為粘結蛋白聚醣(syndecan)，已發現有 4 種，共同構成一個家族；另一類是通過與糖基磷脂酰肌醇共價結合而 錨定在細胞表面，稱為磷脂肌醇蛋白聚糖(glypican)，已發現有 6 種，共同構成一個家族[99-101]。Glypican-4 與 Glypican-6 可以在

成人肝臟中找到[102, 103]。

台灣大學許輝吉教授發現 GPC3 mRNA 可在 74.8%的原發及復發性 肝癌上測得，但正常肝臟中只有 3.2%測得到。在肝癌組織中 GPC3 mRNA 比 AFP 更容易測得(88%比 55%)，在小於 3 公分的肝癌又更明顯 (77%比 43%)[104]。瑞士 Zhu 醫師發現 75%的肝癌有 GPC3 mRNA 的過 度表現，但在局部增生性結節(focal nodular hyperplasia)及肝硬 化中並沒有，因此推論 GPC3 應該是一個能夠區分良性及惡性肝組織 的標記[105]。韓國 Sung 醫師進一步以免疫組織染色研究發現 72%的 肝癌細胞株陽性，但正常肝臟及良性肝病變則沒有[106]。以血清酵 素免疫分析法研究發現 40﹪-53%的肝癌病患血清陽性，而健康捐血 者及慢性肝炎病患則沒有，加拿大 Capurro 醫師報告 20 位慢性肝炎 相關的肝硬化只有一位血清呈陽性，日本 Nakatsura 醫師檢測 13 位 肝硬化，34 位慢性肝炎及 60 位健康捐血者皆呈陰性[107, 108]。

GPC3 與 AFP 彼此不相關，診斷肝癌的敏感度各為 53%與 54%，兩 者混合測試肝癌也可以增加敏感度至 82%，卻未降低特異度[108]。

東京大學 Hippo 等人檢測 69 位肝癌，38 位肝硬化及 96 位健康 者，觀察到 GPC3 的胺基端(NH2-terminal)在 Arg358 和 Ser359 之間 與錨定於細胞膜的羧基端(COOH-terminal)斷離，胺基斷端可以釋放 溶解到血液中(soluble GPC3，sGPC3)而被偵測到，選擇 sGPC3 篩檢

值 2 ng/ml，敏感度 51%，特異度 90%，AFP 篩檢值 20 ng/ml，敏感 度 55%，特異度 90%。AFP 與可溶性 GPC3 不相關，兩者皆測可將敏感

值 2 ng/ml，敏感度 51%，特異度 90%，AFP 篩檢值 20 ng/ml，敏感 度 55%，特異度 90%。AFP 與可溶性 GPC3 不相關，兩者皆測可將敏感