第四章 結果與討論
4.4 實驗分離結果
接下來針對溶劑系統中添加之界面活性劑種類、濃度變異以及使用多 種溶劑系統組成來討論分離結果。
4.4.1 添加界面活性劑月桂硫酸鈉的分離效果
首先選用一般常用之水溶性界面活性劑-月桂硫酸鈉 (SDS)，其臨界微 胞濃度約為7-10mM38。實驗最初選用n-Hexane/Water = 1:1 的比例，添加此 界面活性劑至臨界微胞濃度8mM，卻發現溶劑系統之上層相呈現混濁黏稠 之乳化現象，完全不適用於高速逆流層析儀當中，因此不得不降低界面活 性劑的使用濃度。之後分別嘗試了數十種低於8mM的濃度後發現，上層相 混濁現象隨著界面活性劑濃度降低而越趨澄清，且逆流層析圖之紫外光偵 測基線也隨之趨於平穩，這樣的溶劑系統才適合進行分離工作。最後測試 出可保持溶劑系統穩定以及紫外光偵測基線平穩的最高界面活性劑添加濃 度為 0.83mM，隨即進行Progesterone、(+) - 4 - cholesten - 3 - one、∆4- androstene - 3,17 - dione三種類固醇混合物的分離。實驗之溶劑系統為：
n-Hexane /Water (SDS 0.83mM) = 1:1，實驗之層析圖如圖 21。由實驗結果發 現此溶劑系統僅能將∆4- androstene - 3,17 - dione從其他類固醇中分離開 來，而類固醇Progesterone與(+) - 4 - cholesten - 3 - one在此溶劑系統中並無 滯留現象，因此無法有效分離。
由此溶劑系統之分離結果得知，在溶劑系統內添加的界面活性劑 SDS 遠低於臨界微胞濃度時，由於存在於水相中的界面活性劑分子降低水相的 極性，使原本只溶解於有機相的類固醇有某程度溶於水相中，造成分離物 種在動、靜相間有適當之分佈差異，因此有分離類固醇混合物的能力，但 界面活性劑添加濃度太低導致分離效果有限。
由於在n-Hexane /Water 的溶劑系統中添加界面活性劑 SDS 至臨界微胞
0.6
溶劑系統: n-Hexane/ Water (SDS0.83mM) =1:1
轉速: 700rpm 流速: 2mL/min 注射時間: 0 分鐘注入 靜相滯留量: 85% 樣品注入量: 100µL
(C): (+) - 4 - cholesten - 3 - one (200 mg/L) (A): ∆4- androstene - 3,17 - dione (400 mg/L) (P): Progesterone (300 mg/L)
濃度會出現乳化現象，因此在此溶劑系統內添加大量乙醇當作共溶劑 (co-solvent)，希望藉由乙醇破壞乳化的能力來解決乳化問題。之後實驗選擇 之溶劑系統為:n-Hexane/Water (SDS 8mM)/Ethanol = 2:1:1，經實驗後發現，
添加大量乙醇的溶劑系統確實不再出現混濁濃稠之乳化現象。接著使其進 入逆流層析儀中進行三種類固醇混合物的分離，層析圖如圖 22，實驗後由
層析圖發現此溶劑系統確實有分離三種類固醇混合物之能力，但由於此溶 劑系統尚未找到最佳化的溶劑配置比例以及分離參數，因此溶劑系統並不 穩定，分離過程中有靜相流失之狀況，經過三小時的流析後，靜相完全被 動相帶出分離管柱外，由此實驗結果得知此溶劑系統目前尚無法適用於分
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
AU
Time(min)
圖22 類固醇分離層析圖 分離管柱內體積: 112mL
溶劑系統: n-Hexane/Water (SDS 8mM)/Ethanol =2:1:1 轉速: 700rpm 流速: 2mL/min 注射時間:0 分鐘注入 靜相滯留量: 85% 樣品注入量: 100µL
(C): (+) - 4 - cholesten - 3 - one (200 mg/L) (A): ∆4- androstene - 3,17 - dione (400 mg/L)
(P): Progesterone (300 mg/L)
離工作，不過進一步改進後的效果則是可期待的。
溶劑系統: n-Hexane/Water (Triton X-100 0.054mM) = 1:1 轉速: 700rpm 流速: 2mL/min 注射時間:0 分鐘注入 靜相滯留量: 84% 樣品注入量: 100µL
(C): (+) - 4 - cholesten - 3 - one (200 mg/L) (A): ∆4- androstene - 3,17- dione (400 mg/L) (P): Progesterone (300 mg/L)
活性劑，臨界微胞濃度約為0.2mM。開始使用之溶劑系統為: n-Hexane/Water (Triton X-100 0.2mM) = 1:1，亦出現渾濁黏稠乳化之現象，因此降低界面活 性劑添加濃度。最後測試出可保持溶劑系統穩定以及紫外光偵測基線平穩 的最高界面活性劑添加濃度為 0.054mM，隨即進行Progesterone、(+) - 4 - cholesten - 3 - one、∆4- androstene - 3,17 - dione三種類固醇混合物的分離。分 離之層析圖如圖23，由實驗結果發現此溶劑系統僅能將∆4- androstene - 3,17 - dione從其他類固醇中分離開來，而類固醇Progesterone與(+) - 4 - cholesten - 3 - one在此溶劑系統中無滯留現象，因此無法有效分離。此分離結果與溶劑 系統: n-Hexane/ Water (SDS0.83mM) = 1:1 的效果類似。
4.4.3 添加界面活性劑 1-丁烷磺酸鈉的分離效果
由之前界面活性劑 SDS 以及 Triton X-100 添加至 n-Hexane/Water 的溶 劑系統中發現添加高濃度會有渾濁濃稠的乳化現象，推斷是因為此種界面 活性劑之長碳鏈端親油能力強，造成有部分的水溶進正己烷相中，因此出 現上層相 (有機相) 乳化的情形。因此，更改為選擇短碳鏈之界面活性劑 (short-chain surfactant): 1-丁烷磺酸鈉來進行實驗。
由於開始實驗時尚未知道界面活性劑 1-丁烷磺酸鈉的臨界微胞濃度，
經測試後選用溶劑系統: n-Hexane/Water (1-丁烷磺酸鈉 25mM) = 2:1，可保 持上、下層相澄清穩定，且在逆流層析儀快速旋轉下保持紫外光偵測基線 平穩，因此可進行分離工作。三種類固醇混合物的分離結果之層析圖如圖 24。實驗後發現，此溶劑系統僅能將∆4- androstene - 3,17 - dione從其他類固 醇中分離開來，而類固醇Progesterone與(+) - 4 - cholesten - 3 - one在此溶劑 系統中無滯留，因此無法有效分離。
0.6 (P): Progesterone (300 mg/L)
4.4.4 添加界面活性劑 1-庚烷磺酸鈉的分離效果
由界面活性劑 1-丁烷磺酸鈉的實驗得知，添加短碳鏈界面活性劑於