實驗動物腦神經細胞凋亡情況

實驗動物經麻醉後，經剖腹後抽取下腔動脈血液犧牲，

分別取下肝臟及頸椎以上截斷取下腦部。

腦組織利用 TUNNEL 方法檢驗。先把全腦沉入多聚甲醛 固定過夜（24 小時），再用石蠟處理。在低度室溫下（21 ~ 23

℃）進行縱向切片。承載玻片有先用多聚賴氨酸泡浸及風 乾，切片經過脫蠟處理。在低度室溫下（21 ~ 23℃）進行縱 向切片，經處理後，封片進行顯微鏡觀察。

(詳見附錄圖表 圖三 不同組別凋亡細胞出現情況).

凋亡細胞呈現深咖啡色色澤且有核質凝聚染色質濃密表 現，有部分細胞可見細胞核部分分解及崩裂現象。在腦部各 部位有不同程度之細胞凋亡表現。其中較明顯集中於腦海馬 迴體部分 Hippocampus ，及大腦皮質區，在基底核 basal ganglion 區域只有少數凋亡細胞並不具有統計學上意義。

而海馬迴區域之凋亡細胞以 CA2 及 CA3 位置為最多。數 量統計，以膽道結紮兩週知凋亡細胞量最多，結紮三週之數 量比結紮一週多，對照有凋亡細胞但數量不多且不明顯。

(詳見附錄圖表圖二)

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大腦皮質出現凋亡細胞數量明顯比海馬迴區域更為小 量。數量以結紮兩週動物及結紮三週者為多，結紮一週僅有 小量檢測，對照組則有零星凋亡細胞存在。

(詳見附錄圖表 圖一)

第五章 討論

慢性肝病變是台灣人口主要死亡原因之一。因為肝臟為 人體內主要排毒器官，不論是外源毒素或內源毒素，必須經 過肝臟代謝才能排出體外，所以一旦肝臟病變而不能代謝排 出人體必定造成毒素儲存，醫學研究常歸類為肝腦病變的形 成原因。臨床上不同程度的人體毒化會影響睡眠清醒循環，

進而改變人類的智力，行為個性思考能力，嚴重的更會影響 神經肌肉的協調而致昏迷或死亡。^11,12,14

血清高血氨素往往是為導致肝腦病變的主要人體內毒 素，不論急性期或慢性期毒性均會有不同程度或方式改變腦 細胞的功能。例如急性期的高血氨素，會導致腦細胞呈現水 腫狀況，一旦持續到嚴重腦疝甚致會引起死亡，相同的慢性 血氨中毒，會令腦神經細胞退化，呈現出病理學上亞默氏退 化(Alzheimer II) II 型細胞，外型像一個發脹水腫，色澤呈灰 暗色氣球。^10,13,19 據研究中指出高血氨素影響在於改變腦細 胞製作蛋白基因的程序，導致酶 glutamine syntheter 或腦纖維 蛋白或酶 benzodiazepine receptor 製作蛋白均失去原有功 能，進而降低腦細胞排毒或是作為腦訊息傳送的功能又或排 洩血氨素能力。^21,22

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細胞凋亡變化其實是與外在環境有密切關係，典型細胞 凋亡與細胞壞死之區別在於前者有遲發性細胞外型縐縮現 象，在腦細胞的凋亡則常發現有胞內酵素或蛋白活性改變。

更且高血氨素會影響腦細胞膜上的接受器功能，Buianska et al⁴¹ 更指出高血氨引起腦細胞凋亡必須有三個訊號分子出 現，No, protein kinase C 及 NF kappa B. 即如阻止 NO Synthase 作用會減小細胞凋亡的數量。^4,8,10

細胞凋亡的檢驗方式. 要證明細胞處於凋亡狀況必先 證明其胞核分子處於分離情況，TUNEL 方法是利用 deaxy muclotidy traneferase (TdT)之 3-OH 鍵與胞核之 DNA 結合，

結果染色在顯微鏡下呈現深淙色細胞或有胞核崩解現象，而 證明凋亡情況，比較其它實驗方式，TUNEL 優點在於可利 用內部直接觀察及記錄其分佈位置，故此我們引用此項實驗

方式。^23,24

根據上述實驗結果，證明肝腦病變的動物在腦部引起遲 發病變位置，包括有海馬迴大腦皮質等，腦基底核及其它部 位並無明顯凋亡細胞，而數量最多是位於海馬週 CA2,CA3 部位。

根據凋亡細胞出現數量以海馬迴較大腦皮質為多，可能

原因為局部組織對血氨素的通透性不同，此外肝腦病變動物 之血腦屏障亦含隨肝臟變化而增加對 Ammonia 之通透性。

Lock Wood et al 利用正子圖掃瞄(PET scanning)分析出肝硬 化病體比較正常動物腦部對血氨素之通透性增高。^25,1

本實驗中之對照組別並無明顯之凋亡細胞聚落，出現數 量最多者為膽道結紮第二週 8.9 %，第三週之數量反而下降 7.9%。第一週為 3.2 %，可見凋亡情況會隨時間延長而增加，

第三週之凋亡細胞下降情況可能為巨核細胞對退化細胞之 清除作用產生。 Lee et al 曾經在腦缺血實驗中證實退化細 胞被清除之情況。²⁶ Magnus et al 亦證明 microglia 清除退化 細胞有利於腦部防止發炎情況及退化情形之惡化。²⁷

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第六章 結論

這項實驗目的透過膽結紮引起肝硬化而續發腦病變傷 害之探討，隨著時間之增加，高血氨素之影響，我們發現實 驗動物腦細胞出現明顯凋亡情形，進而影響實驗動物之活動 力及反射動作之能力，臨床上肝腦病變慢性期中治療對象常 出現精神、智力、退化及注意力集中困難情況，也許可以解 釋病史雖經治療或血氨素控制仍然陸續出現精神症狀之原 因，分子生物學上及早發現可能是開創肝腦病變慢性期之治 療契機。

附錄圖表

表一 實驗動物生化數值結果

Table 1 labertory examination:

Group GOT (U/L) GPT(U/L) Ammonia Gr 1 127.6+35.1 152.3+34.9 48.7+5.8 Gr 2 154.1+39.1^∗ 415.6+283.5 104.4+18.7^∗∗

Gr 3 142.8+75.5^∗ 545.5+198.5^∗∗ 120.2+32.3^∗∗

Gr 4 163.8+64.9^∗ 788.2+372.2^∗∗ 128.5+41.3^∗∗

數值以 +標準差表示出，P< 0.05^∗、P< 0.001^∗∗