聚合酶連鎖反應是將去氧核醣核酸快速複製的技術。利用高溫去打開(denature) 去 氧核醣核酸的雙股，再以適當溫度將使擁有專一性的兩端引子(primer) 與單股的去氧核 醣核酸黏合，接下來以72℃讓去氧核醣核酸聚合酶 (DNA polymerase) 去製造新的去氧 核醣核酸互補股。此方法可在短時間內得到大量所需的去氧核醣核酸。(Dr Kary B. Mullis, La Jolla, California, U.S.A., The polymerase chain reaction (PCR) method. 1993 Nobel Prize)
5-2 DNA 定序:
以 pET30a-cyclin I 質體為模板，加入四種不同螢光標定的核甘酸的類似物 ddATP，
ddTTP，ddCTP 與 ddGTP 作為原料進行聚合酶鏈鎖反應。因為這些核甘酸類似物沒有 3'-hydroxyl group，因此 DNA 的複製不會繼續進行，並會停留在接上 ddNTP 的位置，並
終止DNA 的複製，造成各種長短不一的 DNA 片段。再以毛細管電泳技術將這些長短
不一的DNA 片段分離，最後透過雷射光激發，並利用 CCD 偵測每一片段不同螢光的組 合來判讀DNA 序列。
5-3 蛋白質表現:
將所需的基因接合在 pET30a 載體上，送入大腸桿菌 BL21(DE3)中，以 IPTG 誘導 16 小時，即可獲得大量所需蛋白質的內涵體。IPTG 為乳糖 (lactose) 的相似物，可以誘 導乳糖操作組 (lac operon) 活化，表現下游的基因。在大腸桿菌 BL21(DE3)中，活化乳 糖操作組，可以產生大量的T7 聚合酶 (T7 polymerase) ，而 T7 聚合酶可以活化 pET30a 載體上的T7 促進子 ( T7 promoter) ，使得我們所需要的蛋白質大量表現。IPTG 雖然與 乳糖結構相似，但卻不會被β-乳糖水解酶 (β-galactosidase) 分解，更可持續穩定的保持 蛋白質的大量產生。(Studier, F. W. and Dunn, J. J. (1982) Cold Spring Harbor symposium - quantitative biology, NY, USA)
5-4 蛋白質結構: 真核細胞所擁有的蛋白質後修飾作用 (post-translation modification) 或是因為誘導物所 使得蛋白質快速且大量的表現，而容易形成內涵體 (inclusion body) 。內涵體為大量未 正確摺疊的蛋白質所聚集而成，而我們將此內涵體藉由變性 (denature) 然後再重新摺疊
二硫代酥糖醇 (dithiothreitol，DTT) ， β-氫硫基乙醇 ( β-Mercaptoethanol，β-Me) 皆 屬於還原劑。主要的作用是破壞雙硫鍵。
我們在進行摺疊實驗時，所使用的化學藥劑與原理如下:
(1) 尿素 (Urea) :
避免蛋白質由高濃度的尿素中直接置換成無尿素的環境，因為劇烈的環境變化，容 易使得蛋白質形成聚集。
(2) Tris:
Tris buffer 可以穩定透析緩衝液的 pH 值。
(3) 二硫代酥糖醇 (dithiothreitol， DTT):
少量的二硫代酥糖醇可當作抗氧化劑。
(4) 甘露醇 (Mannitol):
甘露醇含有大量的氫氧基，可以保護蛋白質的側鏈分子，避免在高度氧化、還原的 環境下被修飾。但是甘露醇會影響金屬離子與金屬蛋白質的鍵結能力。
(5) 蛋白酵素抑制劑 (Pefabloc):
蛋白酵素抑制劑可以與蛋白質分解酶 (protease) 產生不可逆的共價鍵結而抑制其 活性，保護蛋白質不會在摺疊過程中被降解。
階段性熱平衡透析法中間物能量示意圖
5-7 螢光儀(Fluoresce):
當分子吸收可見光或紫外光時，位於基態 (ground state) 能階的電子會被激發至激 發態 (excited state)，在激發態的電子隨即以不同的能量方式(光或熱)衰退回基態。若衰 退時以放出光的形式衰退回基態則會產生所謂的螢光 (fluorescence) 。蛋白質中的芳香 族胺基酸因為擁有苯環，所以可以吸收特定波長的激發光，並將此吸收的能量以較低能 量的光或是熱的形式散發。當芳香族胺基酸處於親水性環境時，因為電子容易與外在環 境交互作用而損失能量，使得釋放出的能量變低，此時能量就會以較長波長的螢光 (紅
位移，red shift) 或是熱散出。反之，當芳香族胺基酸的苯環處於疏水性環境時，會因為 與外在環境作用較少，而能保留較高的能量，所散發出的螢光能量也會較高 (藍位移，
blue shift)。
5-8 圓二色旋光光譜儀 (Circular Dichroism，CD):
圓二色旋光光譜儀 (Circular Dichroism) 可用於測量蛋白質的二級結構。胺基酸有 光學活性，因為除了甘胺酸 (glycine) 外，其餘的胺基酸皆具有四個不同的基團 ( 碳 基、胺基、羰基、以及R group)，在空間中會因為不同的排列而形成兩種鏡像異構物 (enantiomer ) 。其中，可將平面偏極光偏轉向左的稱為左旋異構物 (levorotatory isomer，
L-form) ，反之則稱為右旋異構物 (dextrorotatory isomer，D-form) ，而在生物體中的胺 基酸大部分為左旋異構物。在入射光通過蛋白質時，因為蛋白質或是多胜肽鍵在水溶液 中的空間非均向性，會產生一個偏轉角度，則可利用此得到的蛋白質吸收橢圓率 (ellipticity) 來推測蛋白質的二級結構比例。一般橢圓偏極光光譜的波長都操作在far-UV
（260~195nm），在這波長區間可以觀察到蛋白質三個主要的二級結構：α-helix、β-sheet、
random coil。在α-helix結構，於波長208 nm 和222 nm 有兩個負的波峰，而β-sheet 結構 於215 nm 有一個負的波峰，因此在探討蛋白質摺疊的狀態時，通常會選擇這些波長。
在測量圓二色光譜儀時，樣品的濃度對結果有相當大的影響，一般而言，圓二色光 譜儀的光譜需求在0.5-1.0 吸收值範圍內的訊號會有比較好的訊雜比，所以我們一般將 蛋白質的濃度控制在0.2mg/ml。而測量前必需先將蛋白質以 0.2um 的濾膜過濾，可去除
影響CD 測量的灰塵、聚集的蛋白質及其他粒子。
5-9 微溫差掃描熱卡路里計 (Differential Scanning Calorimetry, DSC):
蛋白質摺疊通常是由高構型能階態往低構型能階態進行，大部分自然態的蛋白質，
皆處於構型能量最低態。所以接近自然結構的蛋白質，對熱的穩定性就越高。加熱使蛋 白質變性，可觀察其三級結構的穩定性。加熱會使蛋白質產生變性，也就是形成相變，
蛋白質變性後，其比熱會發生變化。我們利用微溫差掃描熱卡路里計 (Differential Scanning Calorimeter) 觀察蛋白質的比熱變化，即可得到蛋白質對熱的穩定性。
微溫差掃描熱卡路里計可分為熱流式 (Heat flux DSC) 與熱補償式(Compensation Calorimeters) 兩種，熱流式是對樣品端 (sample) 及參考端 (reference) 提供相同的功 率的能量將兩端同時加熱，當樣品達到相變點時，會吸收或釋放出額外的熱量，使得 兩端溫度產生了溫度差，再使用熱電偶 (thermocouple) 將此溫度差轉換成熱量差，由 此計算出樣品的相變點以及比熱變化。而補償式的則是提供不同功率的熱量，去維持
樣品端以及參考端的溫度相同，根據所提供的熱量不同，也可以計算出樣品的相變點 及比熱變化。
本實驗所使用儀器為 CSC 公司所出產的 N-DSC-II，可測量的溫度範圍從-10℃到 130℃，升溫度速率可從 0.125℃/min 到 2℃/min；cell 容量為 0.33ml；靈敏感為 1 μcal。
5-10 Far Western:
與一般的西方點墨法 (western blot) 相似，將樣品以 SDS-PAGE 分離後轉漬到 PVDF
膜上，使用5%的脫脂奶浸泡 PVDF 膜，將未被蛋白質接上的區域覆蓋，避免非專一性
的鍵結。接下來依序以我們的摺疊緩衝液 (Refolding buffer，R1、R2、R3、R4、R5) 浸 泡，進行膜上的蛋白質摺疊，再將感興趣的蛋白質加進緩衝液中進行雜合
(hybridization) ，接下來以一抗、二抗去辨認特殊的蛋白質序列。如果膜上有蛋白質可 與溶液中的蛋白質結合的話，則會在該位置呈像。
5-11 動態光散射儀(Dynamic Light Scattering，DLS) :
雷射光射入含有懸浮粒子的溶液中時，雷射光因粒子而產生散射光，散射的雷射光 會隨時間改變，再由散射光的變化計算出平均粒徑大小。因為粒子所處的環境並非絕對 零度，本身含有動能而進行布朗運動 (Brownian Motion) ，粒子大小不同會造成不同的 擴散運動，因為粒子隨時在移動而相對位置不斷變化，各個粒子的散射光互相干涉也隨 時在變化，因此散射光強度也隨時間在變化，粒子越小，擴散運動速度越快，粒子越大，
擴散運動越慢，利用雷射光穿透溶液時，粒子會產生散射光，粒子因為大小及位置的不 同，產生的散射光到達檢測器時會有光程差。不同時間粒子位置會改變，散射光也跟者 改變，可利用Stokes-Einstein equation 計算出粒徑大小。
5-11 恆溫滴定微卡洛里計(Isothermal Titration Calorimetry，ITC)
當分子結合或是解離時，會產生吸熱或放熱的現象。恆溫滴定微卡洛里計可測量 為量的熱變化。ITC 主要可以分為下列三類: 1.絕熱式 (adiabatic) 2. 熱傳導式 (heat conduction) 3. 補償式 (compensation) 。絕熱式恆溫滴定微卡洛里計是使用電流平衡熱 量的改變，反應槽 (ampoule)與環境並無淨熱的產生。而熱傳導式則是利用反應槽溫度 變化時，會與外部之恆溫水槽產生熱交換，當熱通過熱電偶 (thermopile)時會產生電流，
即可推算出能量改變。本實驗使用之恆溫滴定微卡洛里計為Thermometric 公司製造，型 號為2277，屬於熱傳導式，恆溫水槽容量為 25L，可控制溫度變化在 0.0001°C 內(24 小 時內)，恆溫水槽的溫度可控制在 5°C - 90°C，靈敏度可到達 10 -6 °C。
第六章 實驗結果 6-1 pET30a-cyclin I 質體建構結果:
將轉殖後含有 pET30a-cyclin I 的 E.coli.(BL21(DE3))以 T7 forword primer 與 cyclin I 250 reverse primer (cyclin I 基因全長為 1134 b.p.，此 primer 為 cyclin I 基因中第 250b.p.
開始的reverse primer) 進行聚合酶連鎖反應，並以 1.5%瓊膠進行電泳，以確定 cyclin I 基因是否成功插入pET30a 中並且方向是否正確。兩個引子之間距離大約為 334b.p.，實 驗結果初步可證明cyclin I 成功插入 pET30a 載體中，並且方向正確。
圖 一 pET30a-cyclin I 質體建構結果。
(a) pET30a-cyclin I 以 T7 forword primer 與 cyclin I 250 reverse primer 進行聚合酶連 鎖反應後結果，分子量大約為334b.p.。(b) pET30a-cyclin I 以 cyclin I forword primer 與cyclin I reverse primer 進行聚合酶連鎖反應結果，分子量大約為 1134b.p.，N 為 negtive control。 (c)質體 pET30a-cyclin I 建構圖。因為 T7 forword primer 與 cyclin I reverse primer 之 Tm 相差太多(分別為 47℃與 69℃)，故分兩步驟確定 pET30a- cyclin I 質體是否建構成功。
(a) (b) (c)
6-2 pET30a-Cyclin I 質體定序結果:
因為cyclin I 基因超過 1000 個鹼基，所以使用 T7 forword primer 與 T7 reverse primer 來分別定序。
圖二 － 1 pET30a-cyclin I 質體以 T7 forword primer 定序結果
圖二 － 2 pET30a-cyclin I 質體以 T7 reverse primer 定序結果
1 ATG AAG TTT CCA GGG CCT TTG GAA AAC CAG AGA TTG TCT TTC CTG TTG GAA AAG GCA ATC
961 ACT AAA CGC AAA GTA GAG GAA ATG GAA GTG GAT GAC TTC TAT GAT GGA ATC AAA CGG CTC 321 T K R K V E E M E V D D F Y D G I K R L 1021 TAT AAT GAA GAT AAT GTC TCA GAA AAT GTG GGT TCT GTG TGT GGC ACT GAT TTA TCA AGA 341 Y N E D N V S E N V G S V C G T D L S R
1081 CAA GAG GGA CAT GCT TCC CCT TGT CCA CCT TTG CAG CCT GTT TCT GTC ATG TAG 361 Q E G H A S P C P P L Q P V S V M Stop
紅字底線標示部分為 cyclin box 序列 (可能與 CDK 鍵結之區域) 藍字部分為PEST 序列 (可幫助蛋白質降解之序列)
6-3 Cyclin I 與其他 Cyclin 序列比對結果
Cyclin A2 TREAGSALLA LQQTALQEDQ ENINPEKAAP VQQPRTRAAL AVLKSGNPRG LAQQQRPKTR RVAPLKDLPV Cyclin B1 MALRVTRNSK INAENKAKIN MAGAKRVPTA PAATSKPGLR PRTALGDIGN KVSEQLQAKM PMKKEAKPSA Cyclin E2 M SRRSSRLQAK Cyclin D1
Cyclin I
Cyclin A2 NDEHVTVPPW KANSKQPAFT IHVDEAEKEA QKKPAESQKI EREDALAFNS AISLPGPRKP LVPLDYPMDG Cyclin B1 TGKVIDKKLP KPLEKVPMLV PVPVSEPVPE PEPEPEPEPV KEEKLSPEPI LVDTASPSPM ETSGCAPAEE Cyclin E2 QQPQPSQTES PQEAQIIQAK KRKTTQDVKK RREEVTKKHQ YEIRNCWPPV LSGGISPCII IETPHKEIGT Cyclin D1
Cyclin I MKFPG PLENQR-LSF LLEKA-ITREA QMWKVNVRKM PSNQNVSPSQ RDEVIQWLAK Cyclin A2 SFESPHTMDM SIVLEDEKPV SVNEVPDYHE DIHTY-LREME VKCKPKVGYM KKQPDITNSM RAILVDWLVE Cyclin B1 DLCQAFSDVI LAVNDVDAED GADPNLCSEY VKDIYAYLRQL EEEQAVRPKY LLGREVTGNM RAILIDWLVQ Cyclin E SDFSRFTNYR FKNLFINPSP LPDLSWGCSK EVWLN-MLKKE SRYVHDKHFE VLHSDLEPQM RSILLDWLLE Cyclin D1 MEHQLLCCEV ETIRRAYPDA NLLNDRVLRA ML-KAEETCAP SVSYFKCVQK ----EVLPSM RKIVATWMLE
Cyclin I LKYQFNLYPE TFALASSLLD RFLATVKAHP K–YLSCIAIS CFFLAAKTVE EDERIPVLKV LARDSFCGCS Cyclin A2 VGEEYKLQNE TLHLAVNYID RFLSSMSVL- RGKLQLVGTA AMLLASK-FE E-IYPPEVAE FVYITDDTYT Cyclin B1 VQMKFRLLQE TMYMTVSIID RFMQNNCVP- KKMLQLVGVT AMFIASKY-E E-MYPPEIGD FAFVTDNTYT
Cyclin I LKYQFNLYPE TFALASSLLD RFLATVKAHP K–YLSCIAIS CFFLAAKTVE EDERIPVLKV LARDSFCGCS Cyclin A2 VGEEYKLQNE TLHLAVNYID RFLSSMSVL- RGKLQLVGTA AMLLASK-FE E-IYPPEVAE FVYITDDTYT Cyclin B1 VQMKFRLLQE TMYMTVSIID RFMQNNCVP- KKMLQLVGVT AMFIASKY-E E-MYPPEIGD FAFVTDNTYT