實驗室內系統測試

對於新緩衝錯合試劑將應用於鎘銅還原法測定感潮帶樣本中硝酸鹽的含量 時，需先確立計算方式，才能將吸光值換算為真實的濃度值，同時必須針對各鹽 度的水樣進行標準添加測試，以確保此方法能準確量測河口樣水中的硝酸鹽，並 且需要得知硝酸鹽自動分析儀搭配此種試劑時，其適用的濃度範圍為何，才不至 於錯估濃度。

4.2.1 數據計算的方法 ( 1 ) 還原率的修正

使用傳統試劑 2% w/v 氯化銨溶液時，還原率隨鹽度變化趨勢不穩定，導致進 行鹽度修正時，需要配製多鹽度的標準品，過程複雜又耗時，但使用新的緩衝錯 合試劑後( 成分為 4% w/v NH4Cl + 0.5% w/v EDTA, pH=7.5 )，雖還原率在不同條 鎘管中仍會改變，但其隨著鹽度的增加卻是近似線性變化，因此可以藉由還原率 的線性函數進行校正。

首先需將亞硝酸鹽與硝酸鹽標準品配製淡水與海水中，再以標準品的還原率 對鹽度做圖，如圖4.1，以海、淡水還原率為端點，連接成一直線，此線段的公式

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Y = aX + b，即可視為還原率為鹽度的函數：

E( S ) = a‧S + E( DDW std ) ………. ( I ) 其中 E( S )為依照樣本鹽度修正後的還原率。

a 為鎘銅管還原率隨鹽度變化的斜率。

S 代表樣本的鹽度。

E( DDW std )為分析過程中，監測所得二次蒸餾水標準品的還原率。

又公式( I )中的斜率會因鎘銅管而異，因此每當鎘管重新安裝上流動注入分析儀 後，就需要測試當次還原率隨鹽度變化的斜率，計算方式為：

a = ( E( SW std ) – E( DDW std ) ) / ΔS ……….. ( II ) 其中 E( SW std )為使用配製於乾淨海水中的標準品所得到的還原率。

ΔS 為兩標準品之鹽度差異。

將公式( I )、( II )結合，即可得到當次的經過鹽度修正的還原率，再以校正後的還 原率代入硝酸鹽的濃度計算公式，即可得到較準確的數值。

( 2 ) 硝酸鹽濃度的計算

鎘銅還原法的原理是將樣本中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，再使用磺胺奈乙二 胺呈色法進行測定，因此得到的吸光值包含了樣本中原有的亞硝酸鹽以及由硝酸 鹽還原的亞硝酸鹽，其可表示為如下之公式：

Abs total = Abs NO2- + Abs NO3- ……… ( I )

其中Abs total為偵測器上所顯示的吸光值。

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Abs NO2-表示樣本中含有的亞硝酸鹽所產生的吸光值。

Abs NO3-代表樣本中的硝酸鹽經過鎘管被還原成亞硝酸鹽的吸光值。

於實驗前，配製不同濃度的標準品，與其吸光值做圖，得到一斜率為k ( Abs / μM ) 的檢量線，可作為將樣本的吸光值換算成濃度之憑藉。

Abs = k x [ conc. ] ………..… ( II )

將公式( II )代入公式( I )，即可轉換為：

Abs total = k NO2- [ NO2- ] + k NO3- [ NO3- ] ……… ( III ) 其中k NO2

-為利用10 μM 的亞硝酸鹽標準品求得的斜率。

k NO3-係以10 μM 的硝酸鹽標準品得到的斜率。

[ NO2- ]為樣本中亞硝酸鹽的濃度( μM )。

[ NO3- ]是樣本中硝酸鹽的含量( μM )。

將公式( III )同除以 k NO2-後變更為，

Abs total / k NO2- = [ NO2- ] + E( S ) [ NO3- ] ……… ( IV ) 其中E( S )為經過鹽度修正後的還原率。

將公式( IV )移項調整後，即可得到，

[ NO3- ] = { ( Abs total / k NO2- ) - [ NO2- ] } / E( S ) ……….... ( V )

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上述的公式( V )中，可以從偵測器判讀得到吸光值，藉由亞硝酸鹽與硝酸鹽的標準 品求出斜率以及還原率，亦可以手動加藥方式或是利用未加裝鎘銅還原管的硝酸 鹽自動分析儀測定亞硝酸鹽的濃度，即可算出硝酸鹽濃度。

4.2.2 標準添加試驗

由於河口環境的水樣基質較複雜，水體中容易含有還原性物質，增加測定的 困難度，因此需要確認新試劑搭配鎘銅還原法測定河口樣本的可行性，欲以標準 添加法評估其應用於感潮帶水樣的準確度如何。

( 1 ) 實驗儀器設備

實驗所需的分光光度計、流動槽、鎘銅還原管、蠕動幫浦、幫浦管、加熱器、

移液管、定量瓶與酸鹼度計等，見參考2.2.1( 1 )。而實驗流程板主要以內徑 0.8 mm 的鐵氟龍管、三通原餅組裝而成，參見圖4.2，將中心管線固定於壓克力板上，由 五條管線為輸入源，包含載流，樣本，緩衝試劑、酸性磺胺試劑與奈乙二胺試劑，

並以轉速為25 rpm 的蠕動幫浦作為整個自動分析的動力，且利用幫浦管的管徑控 制載流、樣本試劑添加比約為25：25：1，當液體推入中心流程板，經由鎘銅管的 還原反應以及在加熱槽40℃的條件下進行呈色反應，最後送入偵測系統進行吸光 值判讀。又樣本迴圈上加裝六向閥，可選擇上樣模式，即樣本被抽進120 cm 長的 管路，再流入廢液桶中；當轉閥變更為注入模式時，載流則進入樣本迴圈，將原 本管路中的樣本攜入至主流程板進行反應，由於載流是以硝酸鹽含量極低的液體 為之，導致樣本在被載流運送的途中，會不斷與其混合稀釋，故存在一稀釋比，

在固定幫浦轉速條件下，本分析儀的稀釋比約為0.5，但稀釋的程度仍會隨幫浦管 比例而有些微變動。在定流速、控溫的環境下，呈色反應的完成度約為92%，還 原率則隨鎘銅管改變。

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( 2 ) 試劑與標準品的配製

關於氯化銨混合乙二胺四乙酸之緩衝錯合試劑、酸性磺胺試劑與奈乙二胺試 劑，10 μM 配製在二次蒸餾水與海水中的亞硝酸鹽、硝酸鹽標準品與浸鍍鎘粒用 的鹽酸溶液與硫酸銅溶液，其配方請參照2.2.1 和 3.3.1 ( 2 )部分。此外，藉由淡水 河福和橋附近的河水與南海表層海水依照0%、25%、50%、75%和 100%的比例混 合，作為含鹽度的樣本。在定量瓶中添加2 ml 的二次蒸餾水或次標準品( 包含 250、500、750 μM 三種濃度 )，最後以各種鹽度的樣水定量至 100 ml，即完成五 種鹽度各四種濃度的自然樣本。

( 3 ) 步驟

確認硝酸鹽分析儀正常運轉，且鎘銅管還原率穩定，利用標準品監測還原率，

從鹽度高的樣本中按照濃度低至高開始測定，完成一組鹽度的樣本後，先量測還 原率，再繼續測定次高鹽度的水樣，如此反複進行試驗。

( 4 ) 數據討論

由於樣本係以河水與海水兩種水體依不同比例混合，因此偵測得到的水樣濃 度結果為線性關係，根據圖4.3 觀察出：添加的濃度與實測吸光值經過修正、換算 得到的濃度值相當接近，回收率皆近於100％，雖然河口水樣的基質較複雜，在同 鹽度的條件下，且一定濃度範圍內，濃度與吸光值之間存在穩定的比例( 吸光係 數，ε )，察看表 4.1，實測的濃度與理論值誤差小於 3 %。

4.2.3 檢量線線性範圍探討

根據比爾定律( Beer’s Law )得知吸光值與濃度應成正比，但是此定律只適用一 定範圍的濃度，且隨著不同儀器、鎘銅管、樣本試劑比與試劑種類而改變，本小 節將對氯化銨混合乙二胺四乙酸試劑進行檢量線測試，得知其對於本研究測定用

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的流動注入分析儀適用範圍，由於實驗空白值為0.000 ± 0.000，不適用偵測極限的 計算，因此本小節只討論應用於淡水與海水樣品時，線性範圍的上限濃度值。

( 1 ) 實驗儀器設備

本實驗需要的裝置包含分光光度計、流動槽、鎘銅還原管、蠕動幫浦、幫浦 管、加熱器、移液管、定量瓶與酸鹼度計，詳細內容請參考2.2.1( 1 )。

( 2 ) 試劑與標準品的配製

製作鎘銅還原管所用的鹽酸溶液與硫酸銅溶液，以及酸鹼值為 7.5 的 2% w/v 氯化銨混合0.5% w/v 乙二胺四乙酸緩衝試劑、酸性磺胺試劑與奈乙二胺試劑，配 方請參照2.2.1 和 3.3.1 ( 2 )部分。另外需以二次蒸餾水和海水配製多濃度的硝酸鹽 標準品，包含5、10、20、30、40、50、60、80 和 100 μM 等濃度。步驟如下：先 取10 ml 的 5000 μM 硝酸鹽母液，添加二次蒸餾水稀釋成 500、1000 μM，容量各 為100、50 ml 的次標準品，再稀釋成 50、100 ml 不等的各濃度標準品，並且重複 步驟改以乾淨的南海表層海水代替蒸餾水，可配製出鹽度近33 的標準品。

( 3 ) 步驟

首先啟動蠕動幫浦並確認載流試劑正常運送、管路中無任何氣泡時，再安裝 鎘銅管待其還原率穩定後，便可由5 μM 的淡水標準品開始進行測定，其中每個濃 度之樣本進行三重複的測量，按著濃度由低到高依序上樣，每測定兩個濃度的標 準品之後，插入5 μM 的標準品進行確認，重複步驟直到九種濃度的標準品全數測 定完畢，將樣本更換為海水標準品，記錄濃度與吸光值的關係。

( 4 ) 數據討論

觀察兩組實驗的測試結果：淡水組標準品的濃度與吸光值的數據見表 4.2，海

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水組的檢量線測試參考表4.3。當鎘銅管還原率對於淡水樣品約 90 %、海水樣本約 75 %時，從表 4.2 可以看出淡水的樣本濃度超過 40 μM 後，斜率 k 開始有點下降，

在容許2%的偏差下，量測鹽度低的樣本時，50 μM 的硝酸鹽含量應是本流動注入 分析儀的濃度偵測上限；而海水組的k 值下降較快，由於海水樣本容易使鎘銅管 還原率衰退，因此需要藉由穿插同濃度的標準品一起比較，當測定濃度介於30-40 μM 的標準品之間，以 5 μM 的標準品測定得到斜率約為 0.0149，因此適用海水中 硝酸鹽濃度的上限約為40 μM。在一般河口環境硝酸鹽的測量，因表層海水稀釋 的緣故，鹽度較高的水樣其濃度會較低，故整體來說，將此氯化銨混合乙二胺四 乙酸試劑搭配本流動注入分析儀的組合，其適用的濃度範圍需小於50 μM ( 但線 性範圍仍會隨著鎘銅管還原率變動 )，若濃度太高的樣本需要經過稀釋後再進行測 定，才能獲得準確的濃度值。