第三章 材料與方法
第二節 實驗方法
一、 紅麴菌次級代謝產物 MS 與 AF 對 Aβ 毒性之影響 (一) MS 與 AF 抑制 Aβ 對神經細胞毒殺之體外評估試驗 1. PC-12 神經纖維母細胞株之培養
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PC-12 神 經 纖 維 母 細 胞 購 自 食 品 工 業 發 展 研 究 所 生 物 資 源 保 存 中 心 (Hsinchu, Taiwan) 以 RPMI 1640 medium (含 5% fetal bovine serum、10% inactive horse serum、2 mM glutamine、50 U/mL penicillin 與 50 mg/mL streptomycin)，
培養於 37℃、5% CO2 之環境下，兩天換一次medium，每星期繼代兩次。
2. MS 與 AF 抑制 Aβ40 毒性之試驗 - MTT assay
MTT 為一種 tetrazolium salt，全名是3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl] 2,5-diphenyl -tetrazolium bromide ， 是 一 種 黃 色 的 染 劑 ， 它 可 被 活 細 胞 吸 收 並 被 粒 線 體 (mitochondria) 中的 succinate tetrazolium reductase (一種 succinate dehydrogenase) 還原成藍色的 formazan，常用來檢測細胞的增殖。將5 × 104 個 PC-12 細胞置 buffer (1% Triton X-100、20 mM Tris，pH 7.5；100 mM NaCl、40 mM NaF、0.2%
SDS、0.5% deoxycholate、1 mM EDTA、1 mM EGTA 及 1 mM Na3VO4) 處理細 胞，並以超音波震盪 30 sec，於 4 ℃ 反應 30 min，離心後 (12,000 x g, 15min) 取上層 lysate，保存於 -20℃ (Lee et al. 2007; Lee et al. 2008)。
- 31 - dodecyl Sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。此電泳法利用分子 量不同來分離出蛋白質。電泳膠片 (gel) 密度較大，蛋白通過孔徑較小，使分子
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表二、高油脂動物飼料配方
Table 2.The formulations of hight fat diet.
Ingredients Content(%)
Chew diet＃5001 74
Butter powder 25.8
Cholesterol 0.2
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表三、MS 與 AF 改善 Aβ40 腦部輸注之阿茲海默症大鼠記憶學習能力試驗之 動物分組
Table 3. Animal grouping for the study on the effect of MS and AF on ameliorating the impairment of memory and learning ability in intracerebroventricular Aβ-infused rat
Groups Brain infusion sample
Samples ( dosage
mg/kg rat) High fat diet Vehicle vehicle solution water ＋
Aβ Aβ40 water ＋
Don Aβ40 donepezil(2.85) ＋
MS 1X Aβ40 monascin(1.0225) ＋
MS 3X Aβ40 monascin(3.0675) ＋
AF 1X Aβ40 ankaflavin(0.1475) ＋
AF 3X Aβ40 ankaflavin(0.4425) ＋
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2. 餵食劑量之計算
以 FDA 所提供之體表面積換算公式計算：
(1) 以體表面積方式換算
a. 人體表面積以身高 170 cm，體重 65 kg 為基準，代入 Boyd’s 公式，BSA (m2)
= 0.003207 × Height (cm) 0.3 × Weight(grams)(0.07285-(0.0188×LOG (grams)))
，求出人體表 面積約為 1.762 m2。
b. 大鼠體表面積則依 FDA 提供之公式換算
(http://www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm)，以體重 0.40 kg 為基準，BSA (m2) = 8.99 × Weight (kg)(0.6899))/100，求出大鼠表面積約為 0.0477 m2。則可由人 品檢驗局 (Food and Drug Administration, FDA) 的核准使用於治療輕度至中度的 阿滋海默氏症。
由微小滲透壓幫浦 (Mini-Osmotic Pump, Model 2004, Alzet Corporation, Palo Alto, CA, USA.)，輸注速率 0.28 μL/hr，內容量 234 μL，軟管 (長約 4-5 cm，內 容量約80 μL)、輸注針頭 (brain Infusion Kit II，3-5 mm，Alzet©) 所構成，其結 構如圖七所示，配合動物腦部立體定位儀對大鼠腦部進行定位，進而將藥品輸入 至大鼠腦部以誘發擬似阿茲海默症之大鼠。
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圖七、ALZET 腦部輸注幫浦
Fig.7. Mini-osmotic pump and brain infusion kit
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圖八、MS 及 AF 改善阿茲海默症大鼠之記憶學習試驗日程表
Fig.8. The experiment schedule of learning and memory task of MS and AF for Alzheimer’s disease rats
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圖九、腦部輸注 Aβ40 之手術流程
Fig.9. The surgery process of intracerebroventricular infusion of Aβ40
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圖十、水迷宮裝置與分區域示意圖 Fig.10. Instrument of water maze task
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實驗完成後犧牲老鼠，並取出腦部組織，按 Groswisky 方法 (Yamaguchi et al. 2006) 分成 cortex、hippocampus 區域。分別加入 25 mM PBS (pH=7.4)
1964)，以 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMP) 為標準品，先以二次蒸餾水將 TMP 稀釋為 1 mM，再以 1 N H2SO4 溶液將其濃度分別稀釋為 0，20，
40，60，80，100 μM，各取 100 μL，分析方法與樣品相同。取 100 μL 的組 織萃取液加入 600 μL 的 5% trichloroacetic acid 及 200 μL 60 mmol/L 的 TBA，於 80oC 反應 90 min 後，冷卻於室溫，再離心 (12,000 x g，15 min ， 4oC) ， 取 上 清 液 以 供 MDA 濃 度 之 分 析 。 利 用 樣 品 若 含 丙 二 醛 (malondialdehyde, MDA) 與 thiobarbituric acid (TBA) 溶液在酸性環境下，加 熱一段時間後會生成粉紅色物質，並在波長 540 nm 下測定吸光度，以推算
- 42 - kDa)、apo E (36 kDa)、NF-κB (65 kDa)、COX-2 (50-55 kDa)、iNOS (131 kDa)、
TNF-α (17 kDa)、IL-1β (31 kDa)、IL-6 (21-28 kDa )】 方法流程與前述細胞相同◦
(5) 組織免疫染色 (immunohistochemistry stain)
大鼠犧牲後取腦組織並快速浸泡於 10% 的福馬林中，進行石蠟包埋與切片 hematoxylin 進行 counter stain。完成後於光學顯微鏡下觀察。
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二、 生物統計分析方法
所有試驗皆進行三重複，實驗結果均以平均值 ± 標準偏差 (mean ± SD) 表 示。利用 SPSS 系統之單因子變方分析 (One-way ANOVA) 進行統計處理，再 以 Duncan’s Multiple Range Test 作組間的差異性比較，p<0.05 表示具有顯著性 差異。
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