實驗方法

第一項 手術

動物經腹腔中給予戊巴比妥納（25 mg/kg），肌肉給予混合氯胺酮

（44 mg/kg），肌肉給予阿托品（0.02633 mg/kg），及肌肉給予二甲 苯噻嗪（6.77 mg/kg）來進行麻醉。

於大鼠的右股動脈和靜脈插入聚乙烯管（PE 50）用來監測血壓、

和注射藥物使用。插管後，進行傷口的縫合及消毒避免感染，動物 會轉向俯臥位。將這些大鼠頭部固定於立體定位儀上，以矢狀切開 頭皮，動物受到側向液體撞擊設備建立腦創傷（McIntosh et al., 1987;

Chio et al., 2007）。開顱手術的準備首先頭皮切開後，一個 4.8 毫米

（mm）的圓形開顱手術，使頭蓋骨定位 Lambda 和前囟門（Bregma）

3.0 mm 之間的進行中央溝定位。放上改良的旋緊式（Luer Lock）接 頭（為創傷插管），內徑為 2.6 mm，用氰基丙烯酸甲酯（cyanoacrylate）

接著劑固定，在用鑽孔器進行頭顱兩處的鑽孔，於兩邊鑽孔處各旋 入一個螺絲後用牙科使用的牙粉為丙烯酸甲酯（acrylic）固定。動 物受到側向液壓撞擊損傷（McIntosh et al., 1987; Chio et al., 2007）。

一個溫和的 FPI 2.2 atm 產生的迅速注入液壓衝擊裝置封閉顱腔小體 積的生理鹽水。

液體撞擊設備建立腦創傷事件後，因外力的刺激動物會顯示短 暫呼吸停止和四肢抽搐，大約持續 40 至 70 秒的時間。動物從立體 定位儀器中分離，丙烯酸甲酯去除，切口進行縫合。每隻受傷的 FPI 大鼠組和假受傷的大鼠組立即密切進行評估 FPI 行為後的恢復。

第二項 生理參數監測

在戊巴比妥納麻醉下，大鼠的右股動脈和靜脈插入聚乙烯管（PE 50）用來監測血壓和注射藥物使用。接著將大白鼠頭、耳部位牢固 安置於立體定位儀上，調整門齒桿（incisor bar），頭皮切開後，剝 離頭蓋骨上附著的肌肉與骨膜。探針根據 Paxino& Watson（1982）

之大鼠腦部立體定位圖譜定位左側腦室：A，雙耳 7.7 mm；L，從 中線 2.0 mm 及 H，從上方頭骨 3.5 mm。經由 20 號不銹鋼探針（直 徑 0.90 mm，長度 38 mm）插入為 Statham P23 AC 壓力感測器，測 量顱內壓（ICP）。所有記錄在一個 four-channel 肌電訊號擷取系統。

核心溫度（TCO）是由熱電偶連續監測，而同時平均動脈壓（MAP）

和心率（HR）的連續監測是經由壓力傳感器。用直徑 0.15 mm 的溫 度探測器插入 4.0 mm 腹側的頭骨表面，用數位電子體溫計監測額葉 皮質區腦部的溫度。在 FPI 前移除探針，核心溫度損傷後立即更換 的模擬電子溫度計和溫度測試棒。

第三項 微透析測量大腦海馬回之麩氨酸、甘油、乳酸鹽、焦葡萄酸

（Togashi et al., 1998）。只有在海馬回定位微型透析探針的證實病理 實驗結果。在這一系列的實驗中，由於不正確的微透析探針位置沒 有動物被排除在外。

第四項 人類造血幹細胞（CD34⁺Cells）之準備

人 CD34⁺細胞從臍血中分離，使用 CD34 的內皮先驅細胞分離試 劑盒和 CD34 Multisort 試劑盒且完全根據其上之過程方式收集。在 FPI 生成之後，立即給予人類臍帶血 CD34⁺細胞（95％之純度，定 義為 5×10⁵人類臍帶血淋巴球和單核球，含有>95％的 CD34⁺細胞）

或給予人類臍帶血 CD34^-細胞（定義為 5×10⁵人類臍帶血淋巴球和單 核球，含有<0.2％的 CD34⁺細胞）當作控制組，其給予途徑為經由 尾靜脈靜脈注射。CD34⁺細胞透過磷酸鹽緩衝液（phosphate-buffered saline；PBS）的收集及洗滌，分成 5×10⁵ cells/0.3ml 濃度。另外收 集取出之 CD34⁺ 5×10⁵ cells 與 PBS 溫育一個小時後，取其上澄液做 為另一輸注液（effluent）。

第五項 實驗分組

動物經由隨意分配成到以下三個組別之一：

第一組：老鼠進行 FPI 後，經靜脈給予 CD34^- cells（5×10⁵ / 0.3 ml PBS），此為控制組。

第二組：老鼠進行 FPI 後，經靜脈給予，從 HUCBCs 中分離 CD34⁺ cells （5×10⁵ / 0.3 ml PBS），此為治療組。

第三組：假手術（sham group）對照組。

全部的實驗進行方式都是在盲目中採隨機分組方式進行，大鼠的分 組組別只有在行為及組織分析後才揭露。用來做組織學及行為學研究 的大鼠在整個實驗中隨意的提供食物及水。

第六項 實驗過程

實驗一：以隨機進行治療經液壓撞擊損傷模組的大鼠（N=8）術後經 由靜脈注射 CD34⁺細胞（5×10⁵/0.3 毫升 PBS）或 CD34^-細胞

（5×10⁵/0.3 毫升 PBS），於 FPI 後的 120 分鐘進行，在核心 溫度（Tco）、平均動脈壓（MAP）、心跳速率（HR）、顱內 壓（ICP）、顱內灌流壓（CPP）= MAP－ICP 及大腦溫度（Tbror TB）和測量腦部海馬回之麩氨酸、甘油、乳酸鹽/焦葡萄酸

（5×10⁵/0.3 毫升 PBS），於 FPI 後的第 4 天使用終端轉移酶

（terminal deoxynucleotidyltoansferase-mediated αUTP nick end labeling；TUNEL）凋亡陽性細胞和 caspase-3 的凋亡陽 性細胞在受傷的海馬回進行兩者細胞數量進行評估。

實驗五：以隨機進行治療經液壓撞擊損傷模組的大鼠（N=8）術後經 由靜脈注射 CD34⁺細胞（5×10⁵/0.3 毫升 PBS）或 CD34^-細胞

（5×10⁵/0.3 毫升 PBS），於 FPI 後的第 4 天，對血管內皮生 長因子（vascular endothelial growth factor；VEGF）陽性細 胞，神經膠質細胞衍生之神經滋養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor；GDNF）陽性細胞，5-溴脫氧尿嘧啶核 苷（BrdU）陽性的血管內皮細胞的 BrdU/ NeuN 染色雙陽性 細胞和人類細胞核抗體（HNA）陽性細胞在受傷的海馬回 進行評估。

第七項 運動功能的評估

傾斜板（Inclined Plane）主要是用來測量大鼠下肢的抓力支撐的 力量。將大鼠放置於傾斜板上，面積為 20*20cm，啟動傾斜面將與 左邊及右邊的傾斜，垂直一開始角度為 30 度最高角度到 55 度

（Hallam et al., 2004）。傾斜板角度的增加或降低在 50 增量到最大 角度來判定每隻大鼠能支撐的角度。每一天的數據為左邊和右邊的 最大角度的平均值。

第八項 認知功能的評估

在大鼠的空間學習及認知能力測試，採用隱藏在水中平台的一種 實驗，稱為莫氏水迷宮學習（Morris, 1984）。莫氏水迷宮（Morris water maze learning；MWM）是在 1982 年由英國愛丁堡大學的神經科學 家 Dr. Richard G.M. Morris（Morris, 1984）所發展出來的。本實驗亦 採用莫氏水迷宮來測試豐富的環境是否具有影響腦創傷對海馬迴空 間學習及記憶的能力。

莫氏水迷宮器具組成一個大型灰色的圓形水池（直徑 174 cm、高 45 cm）及一個直徑 10 cm 的透明樹脂玻璃平台水面 1 cm 以下。大 鼠進行訓練，當水池充滿水時必須讓動物無法看清水面下平台之位 置。在實驗過程中，該平台維持在一個象限中的固定位置。將動物 面向池壁放入其中一水牆，在四種隨機選擇 90 度分隔的位置。最多 180 秒的時間內找到隱藏平台，由監視器傳至電腦並記錄其影像。

在損傷後 1-7 天，游泳路徑被記錄，延遲找到隱藏平台主要取決於 測量本次測試，以觀察老鼠的游泳能力是否影響尋找平台的時間。

第九項 內皮前驅細胞（Endothelial progenitor cells；EPCs）

收集分離的大鼠股骨骨髓，從附著的軟組織進行了小心清理。骨 髓腔內插入一個注射針頭（23 號）和磷酸鹽緩衝液（PBS）沖洗出 骨髓。經由分離取得骨髓細胞。單核細胞在 PBS 洗滌三次。細胞進 行了分析 CD 133 標記（ab 19898, abcam）用類似 FITC 標記的二級 抗體（ab6717, abcam）和血管內皮生長因子-2（VEGF-2）（ab10972, abcam）標記用類似 PE 標記的第二抗體（ab7004, abcam）。在每一 個實驗，同型匹配的抗體作為對照組。

第十項 腦梗塞評估

所有動物都在 FPI 發生後在第 4 天被犧牲。在給予高劑量的戊巴比 妥鈉麻醉下（100 mg/kg i.p.）動物心臟裡都被快速灌流 100 ml 的生理 食鹽水用 heparin（肝素）unit/ml 隨後 300 ml 10％福爾馬林（Sigma, St.

Louis, MO）。取出腦組織，福爾馬林固定後，加工和石蠟包埋。冠狀 切面（6 microns thick）被切片和染色，染色過程採用氯化三苯基四唑

（triphenyltetrazolium chloride，或簡稱 TTC、TZ 法）如其他文獻所 描述（Wang et al., 1997）。為期 4 天的存活選擇對應的行為（運動和 認知功能）評估。梗塞範圍由沒有染到 TTC，代表該組織缺乏脫氫酶

（dehydrogenase-deficient tissue），最後用電腦 planimetry（PC 圖像工 具軟體）計算範圍的總和。梗塞體積範圍（volume）為 2 毫米（切片 厚度）×（所有腦片（mm²）梗塞區的面積）計算基準（Wang et al., 1997）。

對於這個皮質病變的體積評估，腦切片的數字化圖像，從每毫米 2.0 mm 至 7.0 mm 後到前囟門被抓獲。研究以蒙蔽損傷後的治療狀況進 行所有影像和梗死體積分析。

第十一項 凋亡細胞之凋亡檢測（TUNEL assay for apoptotic cells）

原位細胞凋亡檢測試劑，被用於評估通過使用末端脫氧核糖核酸 轉移酶（terminal deoxynucleotidyltransferase（TdT）-mediated dUTP nick end-labeling （TUNEL）。其中定量分析有凋亡陽性反應（TUNEL positive）在顯微鏡下計算染色細胞數量。結果的百分比即凋亡率代 表隨機選擇的 10 格標誌細胞的百分比表示。染色的結果是採用影像 數據處理器（American Image-Pro Plus software）進行分析和評估。

第十二項 溴脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine；BrdU）標記 所有動物都在 TBI 發生後在第 4 天被犧牲。5-bromodeoxyuridine

（BrdU）（50 mg/kg）溶解在 PBS 給予每日一次，連續 3 天腹膜內 注射，來評估細胞的增生標記。

第十三項 免疫組織化學染色（Immunohistochemistry, IHC）

4. 抗神經元特殊核蛋白（NeuN, antibody in 1:200 dilution）或抗人細 胞核抗原（HUA）（MAB 1281, Chemicom）

5. 螢光素異硫氰酸鹽（fluorescein isothiocyanate；FITC）標記 goat anti-mouse secondary antibody（Alexa-Fluor ® , 568）為檢測切片 DAPI 染色進行可看的見的核細胞。

caspase-3 活性皮質切片的順序：

1. 培養 cleaved caspase-3（ASP/75）抗體只認活化的 caspase-3 大片

段（17-20 kDa），3％ BSA/PBS/0.1％的 TX-100 在 4℃一個晚上。

2. 沖洗 PBS/0.6％TX-100 和 FITC 標記的 anti-rabbit IgG 培養於 1％

BSA/PBS/0.1％TX-100 為 60 分鐘。

3. 安裝使用螢光保護劑的 Mounting Medium 是專門用來減緩免疫

第十四項 細胞激素的測定（Assay of Cytokines）

在 血 清 中 測 定 細 胞 粘 附 分 子 -1 （ ICAM-1 ） 和 介 白 素 -10

（Interleukin-10；IL-10）與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的濃度採用雙 抗體包夾酵素連結免疫吸附分析法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay；ELISA）或稱酵素免疫分析法試驗。對於 TNF-α 及 IL-10 的 光密度設定在 45 奈米（nm）由平板讀取器來讀取。計算血液樣本 中的 TNF-α 及 IL-10 的濃度計算方式採用標準曲線乘以稀釋係數，

以皮克/毫升（pg/ml）來表示。

第十五項 統計分析（Statistical Analysis）

實驗的圖、表及結果數據分析均以平均值±標準誤（mean± S.E.M）

顯示。重複測量利用雙因子變異分析（Two way analysis of variance

（ANOVA））來比較各組治療時間是否有顯著差異和因治療隨著時間

（ANOVA））來比較各組治療時間是否有顯著差異和因治療隨著時間