實驗方法

第二章、實驗方法

2-1 大腸桿菌融合蛋白質的表現及萃取

配置 1×LB (tryptone 10g, NaCl 10g, Yeast 5g)加水至 925ml，並用 NaOH 滴定溶液直到 pH7.5 後滅菌。再加入已滅過菌的 10% Glucose 75ml，

總體積為 1000ml。(整個流程皆用此配方養 E. coli)。將具有蛋白質表 現質體 pET28a-yCTD 轉型送到 Rosrtta(DE3)LysS 勝任細胞中，將菌 液培養在含有抗生素 Kanamycin 50 μg/ml 與含有抗生素

Chloramphenicol 34 μg/ml 的 1×LB 40ml，隔夜震盪培養在 37℃，

230 rpm。取欲培養體積 1/50 的菌液，加到培養基中，等到 OD 0.6 入 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride) 0.5 M (10 ml 菌液加入 50μl PMSF) ，最後將退冰後的菌液，利用超音波破菌機破菌(power level between 7-8) ，待菌液不再黏稠後，放入超高速離心機以 15000 rpm,

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4℃,離心 1 小時，再將離心後之上清液取出，重複以 15000 rpm 再次 離心。離心後取上清液以0.22μm 之過濾膜來去除雜質。

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2-2-1 管柱層析純化(histrap)

在冷房下，將 1 ml 的 GE histrap 管柱接在 P-1 pump 上，設定流速 為 1 ml/min,先用 ddH²O 清洗管柱 15 CV(column volume) ，再洗 10 CV Equilibration buffer (50 mM Tris-HCl , 100 mM NaCl, 5 mM

Imidazole, 10% glycerol, 2 mM PMSF, 2 mM β-Me, 0.2% Triton-X100)

。接著將粗蛋白以流速 1 ml/min 的方式流入管柱中。約一小時後，將 管柱接在 AKTA prime(GE Healthcare)上，並設定流速 0.5 ml/min 。 先用 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7.5 流洗 15 CV。再用 200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 50 mM imidazole , pH 7.5 流洗 15 CV。再用 200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 75 mM imidazole , pH 7.5, 流洗 15 CV。

再用 200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole , pH 7.5, 流洗 15 CV。目標蛋白在流洗約 55 CV 後開始出現。當目標蛋白流洗差不 多後將梯度拉到 500 mM imidazole 做清洗，最後再拉至無 imidazole 流洗約 15 CV。

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2-2-2 管柱層析純化(Superdex 75)

膠體過濾類產品可依據膠球孔徑大小區分為兩種用途，一種是孔徑較 大的膠體，適合進行傳統膠體過濾實驗使用。在膠體過濾實驗中，樣 品液中的生物分子會依照分子大小在不同時間點而流出管柱，其中小 分子由於會滯留於膠球中較久，因此會使較大的分子更快流出管柱，

利用此原理即可將一成份複雜的樣品液依照分子大小的不同而進行 純化與分離。因此將保存在 20 % 酒精中的 Superdex 75 接在 FPLC (GE Healthcare) 上，先用 ddH²O 清洗 1.5 CV，再以 buffer (20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl , 1 mM EDTA , 5 mM β-Me , pH7.5) 換洗 1.5 CV，將 Histrap 純化下的 protein 濃縮體積至 1ml 後，注入管柱中，

以流速 0.3 ml/min 之流速分離蛋白質。

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2-3 濃縮

離心過濾系統是利用膜上的孔徑大小將特定大小的 protein 與溶液分 離的方法，而在此實驗是利用 Centrifugal Filter Units (MILLPORE) 10 k 濃縮，先以 ddH

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O 清洗 membrane 兩次，每次 5000 ×g， 5min。再 以 buffer 置換 ddH

₂

O，以 5000 ×g， 5min 離心一次。將 sample 放入 離心管中，每次以 4000 ×g 離心 10 min，約 2-4 次後，致使 protein 體 積濃縮約至 1 ml 為止。再以 BSA 為標準品，以 1X 稀釋、2 X 稀釋、

4 X 稀釋、8 X 稀釋、16 X 稀釋的 BSA，利用 OD ⁵⁹⁵吸收值做檢量線。

再以內差法將 OD ⁵⁹⁵所測得之 protein 吸收值算出其 protein 相對應之 濃度。

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2-4 正十二烷硫酸鈉-聚丙醯胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)

先配置 Separating gel solution (4.97 ml dH²O, 3.39 ml 40%

acrylamide solution, 2.72 ml Separating Gel buffer, 35.8 μl 10% APS, 11.4 μl TEMED) ，倒入玻璃間槽內，加入 95%酒精以隔絕空氣，約 40 分鐘後，將酒精倒棄，並配置 Stacking gel solution (3.55 ml dH²O, 0.63 ml 40% acrylamide solution, 1.4 ml Separating Gel buffer,31.6μl 10% APS, 8.15μl TEMED) ，倒入玻璃間槽 separating gel 之上，插入 孔梳，待 40 分鐘膠體凝固。將凝固的膠體置於電泳槽中，於上下電 泳槽各加入電泳緩衝溶液 1×SDS running buffer(Tris base 3 g, glycine 14.39 g,10% SDS 10ml,加水至 1L),並將蛋白質樣品加入適量的 6X loading dye 【12% SDS, 0.06% servablue G, 60%glycerol, 300 mM Tris(pH 6.8), 15% β-Me, 加水到 100 ml 】，以 95℃乾浴槽煮沸 5 分 鐘，使蛋白質變性，之後再注入到 stacking gel 的凹槽中，於室溫以 25 mA 電泳跑約 1.5 小時，直到 dye 移動到膠體底部為止。將跑完電 泳的膠體浸泡在 Coomassie blue 染液(coomassie blue R250 0.4g , methanol 100 ml, acetic acid 24 ml, 加水到 200 ml)染 15 分鐘後，將染 色後的膠體取出，浸泡在退染劑 destaining solution (methanol 400 ml,

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acetic acid 70 ml 加水至 1L)中，直到膠體背景完全退去為止

【Laemmli，1970】。

2-5 膠體電泳位移分析 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)

先配置 6 % native polyacrylamide gel solution (6.665 ml dH²O, 1.695 ml 40% acrylamide solution , 2.72 ml 2X TBE pH10 , 71.6μl 10% APS , 22.8μl TEMED)混合均勻後，倒入預做的玻璃間隔中,插入孔梳,約 40 分鐘後待 gel 凝固。凝固後的 gel 放置於電泳槽中，於上下電泳槽中 加入電泳緩衝液 (0.5X TBE , pH10)。將蛋白質與約 40 mer dsDNA 或 ssDNA 混合，並在 16℃下作用 1hr，再注入 well 內，於 4℃下以 90 V 的電壓下約 75 min。再以 5μg/ml EtBr 與 coomassie blue 染色 觀察之【Hendrickson , 1985】。

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2-6 西方墨點法 (Western blotting)

將 SDS-page 電泳膠體取下後，浸置於 transfer buffer(25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 10% methanol)中 15 min。剪裁與膠體相同大小之 Immobilon-P Transfer membrane (帶手套剪裁，以避免手上的蛋白質汙 染 Immobilon-P Transfer membrane) 及四張相同大小的濾紙(Whatman 3M)，並將 Immobilon-P Transfer membrane 浸置於 100% methanol (15-30s)，浸潤後再置換至 diH2O 中漂洗 2-4 min，再將 Immobilon-P Transfer membrane 及濾紙同時浸置於 transfer buffer 中 15 min。以 support grid(負極面)為最下面，依序放上海綿、兩張濾紙、SDS-page、

Immobilon-P Transfer membrane、兩張濾紙、海綿，再將另一 support grid 合起，以 cassette 夾好，需注意各層間皆不可有氣泡。將此 cassette 放入電泳轉印槽中(靠近膠體端之電極為負，靠近 Immobilon-P

Transfer membrane 端為正極，於 4℃冷房中以 250 mA 通電 96 分鐘，

使 SDS-page 上的蛋白質轉印至 Immobilon-P Transfer membrane 上。

轉印完成後，將 Immobilon-P Transfer membrane 浸於 5 % non-fat dry milk 的 1× PBST(1×PBS contain 0.05% TWEEN 20)溶液中，輕輕搖晃 60 min，再以適量的 1× PBST 清洗 3 次，每次 10 分鐘。再將

Immobilon-P Transfer membrane 浸泡於含有 primary antibody 的 PBS

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的溶液中在室溫下搖晃 2 小時，再以 100 ml 1×PBST 將膜清洗 3 次，

每次 10 分鐘。再加入 secondary antibody 於 PBST 溶液中均勻搖晃一 小時，再以 100 ml 1×PBST 將膜清洗乾淨，每次 10 分鐘。再以 30 ml PBS 清洗膜 2 次，每次 5 分鐘【Burnette , 1981】。最後加入呈色劑呈 色。混合後顏色逐漸出現，待適當深度後，再加入去離子水終止反應 繼續進行。取出 Immobilon-P Transfer membrane 以 UVP EpiChemi³ Darkroom 之照膠硬體拍照。

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2-7 酵母菌融合蛋白質的表現

將具有融合蛋白的菌落培養在 5 ml selection media (SC-ura,-his/2%

ethanol/2% glycerol) 30℃下 250 rpm 震盪隔夜培養。取 60μl 隔夜菌液 至 30 ml selection media (SC-ura,-his/2% ethanol/2% glycerol)，至使其 OD⁶⁰⁰ 為 0.2-0.3 之間。當菌液生長至 OD⁶⁰⁰ 為 0.4-0.5 時，把培養基 置換成 selection media (SC-ura,-his/4% galactose)，並在 30℃下 250 rpm 震盪隔夜培養 18 小時誘導表現，再以 4000 ×g 離心 3 分鐘收集菌體。

去除上清液後，再用 TE buffer(20 mM Tris-HCl, pH8, 1 mM EDTA)清 洗兩次，儲存菌體至-80℃。

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2-8 酵母菌免疫螢光染色

收集約 0.4g 的菌體至 1.5 ml 的微量離心管中，離心 4000 ×g ,5 min。

用 PBS (137 mM NaCl,4.3 mM Na²HPO⁴ , 2.7 mM KCl , 1.47 mM KH²PO⁴ ,pH 7.3)清洗菌體兩次。離心 4000 ×g , 5 min 去除 PBS，加入 4% formaldehyde in 1×PBS，並在室溫下搖晃 1 小時去固定細胞。接 著用 PBS 在室溫下清洗兩次，每次 5 分鐘。以 4000 ×g , 5 min 去除 PBS，再加入 800μl sorbitor buffer (1.2 M sorbitor , 10 mM CaCl² ,0.1 M Tris-HCl ,pH7.5 , 20μl β-Mercaptoethanol , 50μl 0.5 M DTT)和 200 U lyticase(Sigma)去懸浮菌體，並在 37℃下以 50 rpm 清微搖晃作用 40 分鐘。40 分鐘後以 1500 rpm 離心 4 分鐘去收集 spheroplast ，去除 milk in 1X PBSTB (1X PBS with 0.1% Triton X-100 and 0.2% BSA)在 室溫下作用 30 min。用 1X PBSTB 在室溫下清洗 2 次，每次 5 分鐘，

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再以 1500 rpm 離心去除上清液。接著加入 GST˙Tag^TM Monoclonal Antibody (Merck) diluted 1:10000 in PBSTB，在 37℃下作用 1 小時。

用 1X PBSTB 在室溫下清洗 2 次，每次 5 min，再以 1500 rpm 離心 4 分鐘去除上清液。接著加入 secondary antibody goat anti-mouse IgG fluoresein conjugate (Calbiochem) diluted 1:50 in PBSTB 在 37℃下作 用 30 分鐘。用 1X PBSTB 在室溫下清洗兩次，每次 5 分鐘，再以 1500 rpm 離心 4 分鐘去除上清液。用 15μg/ml DAPI 在室溫下染細胞核 15 分鐘，離心去除上清液。用 1X PBS 在室溫下清洗五次，每次 5 分鐘，

再以 1500 rpm 離心 4 分鐘去除上清液。用約 50-100μl 的 PBS 懸浮 spheroplast。最後取 4.5μl spheroplast 液體到載玻片上，並蓋上蓋玻 片。操作螢光顯微鏡(OLYMPUS BX61)利用 100

x

油鏡做觀察

【Matsuyama et al , 1999】。

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2-9 酵母菌融合蛋白質的萃取

誘導表現完後，菌體以 4000 × g 離心 5 分鐘收集。再以 buffer A(20mM Tris-HCl, pH 8.0,150 mM NaCl)清洗兩次。去除上清液後，再以 buffer A 包含 1 mM EDTA, protein inhibitors cocktail for use with fungal and yeast extracts (Sigma)，以 1:1 回溶菌液後再加入等體積的 glass beads，利用 Vortex 震盪 10 秒後，靜置於含鹽的冰上 20 秒，震盪約 莫 1 小時。接著在 4℃下離心 4000 × g，5 min 以去除未打破之細胞。

取上清液以 15000 × g ，10 min，兩次。之後再離心 407500 × g，60min 並置於冰上以 buffer A 回溶 30min。之後再離心 407500 × g，60min。

將上清液保存跑 SDS-PAGE，此外以 buffer A 含 0.5 % Triton X-100 回溶 pellet 後亦以 SDS-PAGE 分析之【Rappsilber , 1998】。

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在文檔中 酵母菌拓樸異構酶II的C末端區功能探究 (頁 22-35)