第一節：實驗材料 A. 儀器
Rotary vacumn evaporator N-11(EYELA, Tokyo, Japan) 冷浸/熱浸槽
自 由 基 分 析 儀 Chemiluminescence CLD-110 (Chemiluminescence, TOHOKU, Kawasaki, Japan)
均質機 Polytron PT3100(POLYTRON,Luzernerstrasse) 水浴槽 Water bath(TKS, Taipei, Taiwan)
離心機 (Beckman)
酸鹼值測定計 (C831; Consort, UK) 乾浴槽 (Model 110001; Boekel) 微量天平 (GR-200; A&D, Japan) 去離子水製造機 (Minipore, USA) 超高速離心機（himac CS 120GX）
Shaker bath (BT-350; YIH DER, Taiwan)
超音波震盪器 Sonicater (MISONIX, Farmingdale, NY , USA) ELISA reader（ANTHOS-2020,Salzbrug,Austria）
SDS-PAGE 電泳槽套組 (Amersham, UK) 蛋白質轉漬電泳套組 (Bio-Rad, USA)
水浴槽 Water bath (TKS, Taipei, Taiwan ) 影像分析儀器（AlphaImagerTM 2200, USA）
自 由 基 分 析 儀 Chemiluminescence CLD-100 （ TOHOKU, Kawasaki, Japan）
B 材料
PVDF 轉漬膜 (Minipore, USA) 蓋玻片 (Kimble, USA)
載玻片 (Marriefeld, Germany) 離心管 (季勗, Taiwan)
X-film ( Kodak,USA)
C 試劑
Acrylamide/Bis (生工, Taichung, Taiwan) APS (Ammonium persulfate; USB)
Bradford reagent (BIO-RAD, Hercules, California, USA)
BSA（Bovine serum albumin）（SIGMA, ST.Louis, MO, USA）
ECL kit (Amersham, UK)
Ethanol (景明化工, Taichung, Taiwan ) Glycine (AppliChem, Germany)
Glyerol (Scharlau, Spain)
Hydrochloric acid (Merck, USA)
Methanol (景明化工, Taichung, Taiwan)
Paraformaldehyde (景明化工, Taichung, Taiwan) Protein assay-Dye reagent concentrate (Bio-Rad, USA) Protein maker (Amersham, UK)
SDS (Sodium dodecyl sulfate; USB) Sodium chloride (Scharlau, Spain) Sodium hydroxide (SHOWA, Japan) Sodium pyruvate (GIBCO, USA)
TBA (2-Thiobarbituric acid; Sigma, USA) TCA (Trichloroacetic acid; Sigma, USA)
Tris (Tris(hydroxymethly)-aminomethane; Pharmacia, Sweden) Triton X-100 (USB)
Trysin-EDTA (GIBCO, USA) Tween 20 (Pharmacia, Sweden) 脫脂奶粉(安佳, New Zealand) 顯影劑(Kodak, USA)
定影劑(Kodak, USA)
一級抗體：
(a).abti-SOD-1(Santa Cruz, California, USA) (b) anti-P-selectin(Santa Cruz, California, USA) (c) anti-VCAM (Santa Cruz, California, USA) (d) anti-Raf-1 (Santa Cruz, California, USA) (e) anti-MEK-1 (Santa Cruz, California, USA) (f) anti-p-Erk(Santa Cruz, California, USA) (g) anti-p-Erk(Santa Cruz, California, USA) (h) anti-p-Erk(Santa Cruz, California, USA) (i) anti-Bcl2(Santa Cruz, California, USA) (j) anti-Bax(Santa Cruz, California, USA) (k) anti-Bad(Santa Cruz, California, USA) (l) anti-FasL(BD Biosciences, USA)
(m) anti-Cap8(Santa Cruz, California, USA) (n) anti-Cap3(Santa Cruz, California ,USA) (o). anti-bata actin (abcam, USA)
(p) anti-eNOS(R& D, USA)
(q) anti-XRCC1(BD Biosciences, USA)
二級抗體
anti-mouse IgG (horseradish peroxidase conjugated; Santa Cruz, California, USA)
anti-goat IgG (horseradish peroxidase conjugated; Santa Cruz, California, USA)
膽固醇：(Sigma, ST.Louis, MO, USA)
玉米油或大豆油（台糖, Kaohsiung, Taiwan）
厚朴生藥(
Magnolia officinalis,
欣隆, Taichung, Taiwan)厚朴標準品：Magnolol standard 建弘; Honokiol standard 建弘, Taipei, Taiwan)
99.98％ Methanol(TEDIA, Fairfield, Ohio, USA) 實驗兔飼料（福壽，Shalu, Taichung, Taiwan）
Lucigemin（SIGMA, ST.Louis, MO, USA）
TBHP(t-Butyl hydroperoxide) （SIGMA, ST.Louis, MO, USA）
MDA 標 準 品 (Malonaldehyde Bis) （ SIGMA, ST.Louis, MO, USA ） CuSO4(USB, Ohio, USA)
DTNB(2,2,-Dinitro-5,5,-dithiodibenzoic acid, Merck Darstadt, Germany) OAA（Oxalacetic acid, Merck Darstadt, Germany）
Sudan IV（SIGMA, ST.Louis, MO, USA）
第二節.實驗方法 1.動物飼養
本實驗動物購自台灣省家畜衛生試驗所之純種紐西蘭大白兔(New Zealand white rabbit)，兔子約 4-6 週大，體重約 1.5〜2 公斤。飼養於中 國醫藥大學實驗動物中心，入室之後，先予秤重並標記，並給一週熟 悉環境。並隨機分組，飼養於各 12 小時光照與黑暗環境，室溫維持 在 25±3。C，每天餵食 150 g 飼料，飲水則不限制。將兔子隨機分成 6 組，一共 3 批，共計 18 隻（n=3）。分組方式如下：
第一組：餵食 normal diet（Normal diet：N 組）
第二組：餵食 normal diet+運動訓練組（Normal diet+exercise：NE 組）
第三組：餵食 0.5%/高膽固醇及 10%/高脂的飼料（high cholesterol diet 組：H 組）
第四組：餵食 0.5%高膽固醇及 10%高脂的飼料+運動訓練組（high cholesterol diet+exercise：HE 組）
第五組：餵食 0.5%高膽固醇及 10%高脂的飼料+1％厚朴粗萃物組（high cholesterol diet+
Magnolia officinalis
extract：HM 組）第六組：餵食 0.5%高膽固醇及 10%高脂的飼料+1％厚朴粗萃物組+運動訓練組（high cholesterol diet+
Magnolia officinalis
extract+ exercise：HME 組）2.誘發高血脂動物模式
兔子由第一週開始餵食含 0.5%高膽固醇及 10%高脂的飼料，餵食 8 週，以此方式誘導動物形成粥狀動脈硬化病徵。高膽固醇飼料配置：
先秤取飼料，利用 95%乙醇或是二次水，均勻淋在兔子飼料上，並以 烘箱 60。C 乾燥 4-6 小時，讓 95%乙醇揮發。以小火加熱不含膽固醇 的玉米油，其含量為總飼料量 10%，再加入含總備製飼料量 0.5%膽 固醇，使其完全溶解於玉米油中，最後倒入飼料，快速拌炒均勻冷卻 後，於 4。C 保存備用。
3.動物運動訓練模式
第一週，每隻兔子先於水平式跑步機上放置 10 分鐘，以熟悉環境之 後，跑步 5 分鐘。一週後隨機將兔子分成 6 組，其中運動組訓練方式 為中度運動訓練-耐力型（endurance-type），強度約 60〜70%VO2max，速 度 0.88km/hr（Chen and Li, 1993），一週訓練 5 天，連續 8 週，以每週 增加 10 分鐘，直至第八週增加至 60 分，其中控制組仍每天都放在跑 步機上 10 分鐘，以求控制動物在相同環境之下(Fig：22)。
4.中藥製備
厚 朴 生 藥 20 Kg 切 片 打 碎 成 絲 狀 物 之 後 ， 用 99.98% 甲 醇 (TEDIA,Fairfield,USA)當溶媒，先冷浸 3 天，經抽氣過濾掉其中雜質之 後，其液體再以減壓濃縮機 50。C 620-640 mmHg 穩定無突沸，抽出部 分甲醇之後，再調高至 680 mmHg，除去殘存甲醇及部分水分，殘留 中藥再以 50。C 熱浸 3 天，並重複上述步驟，即可得到膏狀粗粹物，
並凍存於-20。C，粗抽物生產量為 20 Kg 生藥約可得到 4 公斤粗抽物。
粗抽物先烘乾秤重，算出其中含水率約為 10％，再將粗抽物經過 HPLC 管柱層析法與標準品（Magnolol standard、Honokiol standard）比對之後，
確定抽出物確實含有有效成分。
使用儀器：美國 LabAlliance 公司，Model Series III，pump/UV620，UV/VIS Detector。
層析管柱：INERTSIL 5 ods-2 4.6*150mm 移動相：50%Acetonitrile，0.1%H3PO4 in H2O 流速：1.0 ml/min
波長：280 nm
1. 標準品（Magnolol standard、Honokiol standard）：秤取 Magnolol standard 3.7mg、Honokiol standard 1.9mg，加入甲醇 7 ml 溶解後，加水至 10 ml，
過濾備用，並注入量為 20μl。
2. 厚朴冷粹粗粹物：秤取冷粹樣品 0.2443 g，加入甲醇 35 ml 溶解後，
加水至 50 ml，過濾備用。並注入量為 20μl。
3. 厚朴熱粹粗粹物：秤取冷粹樣品 0.1851 g，加入甲醇 35 ml 溶解後，
加水至 50 ml，過濾備用，注入量為 20μl。
給藥方法：利用 95%酒精或是二次水當溶媒，溶解中藥粗粹物，均勻 淋在兔子飼料上，並以烘箱 60。C 乾燥 4-6 小時，讓 95%EtOH 揮發。
以小火加熱不含膽固醇的玉米油，其含量為總飼料量 10%，再加入含 總備製飼料量 0.5%膽固醇，使其完全溶解於玉米油中，關火使油溫 下降約 55。C〜60。，最後倒入已含中藥粗粹物的飼料，快速拌炒均勻 冷卻後，於 4。C 保存備用。
5. 血脂測量
犧牲前兔子先禁食 24 小時，犧牲時由胸主動脈取出約 20cc 血液，冰 上靜置 20 分鐘，待血液凝固之後，於 4。C 離心 15 分鐘後，取出上清 液，凍存於-80。C。測量血液中之總膽固醇、三酸甘油酯、高密度脂 蛋白、低密度脂蛋白、麩氨酸草酸轉胺酵素、丙氨酸丙酮酸轉胺酵素。
6.兔子血管中之超氧自由基含量測量
在動物犧牲取組織之時，先分切成小塊之後，於-80。C 冰箱保存。實 驗時切取約 1 公分血管組織，加入 0.5cc Tris-sucrose buffer ，利用均 質機在低溫之下均質，將均質液於 4。C、4000g 離心 30 分鐘，取出上 清液，避光放置於冰上。之後取出上清液 200 μl 加入 Luminol 100μ l，於 37。C 培養 10 分鐘，放入自由基分析儀內，先測定 100 秒，再 加入 TBHP100 μl 激發組織自由基產生，再測定 1000 秒，即可得知 組織自由基數值，再做蛋白質定量，即可得到『自由基相對值』=自 由基數值/每毫克蛋白質含量。
7 血清 MDA(malondialdehyde)含量測量
動物犧牲後，抽出血液靜置，等待凝血後離心(4。C 13,000 rpm、10 分 鐘)。 取出上清液即為血清(serum)，取血清 25μl 加入 2.5μl 60Mm CuSO4及 22.5μl 二次水，混合均勻後避光放置於 37。C 水浴槽促氧化 4 小時。再加入 0.35ml 20%TCA 及 0.35ml 0.67%TBA 來呈色及沈澱蛋 白質，混合均勻後，避光放置於 67。C 水浴槽促氧化 30 分鐘，使脂質 產生氧化反應，最後再離心(室溫 10000 rpm、3 分鐘)，取出上清液，
以 450 nm 波長測量吸光值。利用不同濃度 MDA 標準品求出線性方程 式，帶入線性方程式，即可求出 MDA 濃度。
8.檸檬酸合成酵素測定（citrate synthase activity）
犧牲兔子後，取下後肢比目魚肌（soleus muscle），以 PBS 清洗乾淨之 後凍存於-80。C。測定時秤取 0.1g 淨重，並加入 5 倍體積 0.1M Tris buffer 及 0.1％ Triton X-100 混合液，在低溫下以均質機將組織磨碎，於 4。 C 離心 15 分鐘後，取出上清液冰存於 4。C。測量時依序加入 DD 水、
DTNB、acetyl Co-A、上清液，混合均勻之後加到石英管並放入光譜儀 中，先測量 10 分鐘，待數值穩定之後，加入 OAA，並記錄其數值，
反應 5 分鐘之後，記錄最後一點數值，再帶入公式換算出絕對數值，
以求得 soleus muscle citrate synthase activity（單位：μ mol/min/g wet weught）
公式：『（反應終點數值-加入 OAA 反應量數值）*20*（6 倍肌肉體積 μl）』/肌肉克數/5
9.Sudan IV 蘇丹四號染色
Sudan IV 是種嗜脂性染料，會與脂肪結合而產生紅色，利用此方法可 以檢測出血管內皮上 plaque 的存在與否，及評估血管壁脂質沈積情 形。兔子犧牲之後，取出胸主動脈血管，先以 PBS 沖洗之後，清除 周圍外膜及多餘脂肪組織，縱向剪開，放入 2％ Sudan IV 溶液內染色 5 分，再放入 100%、90%、80%、70%、60%、50% Methanol 內退染，
再以 PBS 沖洗，最後以攤平固定在玻片上，照相存檔。以 Image pro plus 軟體分析。
公式：（動脈硬化瘢塊面積/血管總面積）*100％
10. HE 蘇木紫-伊紅染色(Hematoxylin / Eosin staining )
可利用此法觀察到 intimal thickness 情形。血管段先以 4％中性副福馬 林（paraformaldehyde）固定隔夜之後，以石蠟脫水包埋固定組織，再 做矢狀切片，血管段依序以 xylene、乙醇（脫水 100﹪→95﹪→85﹪
→75﹪）、二次水清洗，泡入 Hematoxylin 染劑數分、二次水清洗，再 與 eosin 作用數分，重複乙醇（回水 85﹪→95﹪→100﹪→100﹪）、
xylene，最後並以 glycerol gelatin 封片膠及蓋玻片進行封片，以保持顏 色構型完整，再於顯微鏡下觀察，照相存檔。以 Image pro plus 軟體 分析。
公式：(內膜增厚面積 intimal thickness area / 管腔面積 lumen area)*100
％
11.血管蛋白質抽取
取胸主動脈約 1*1 公分，加入 500μl Lysis buffer，利用均質機將血 管均質，用 sonicater 將細胞震破，來回三次，並在 4℃離心（13000 rpm、
10 分鐘），取上清液，進行蛋白質定量或冰存於-20℃。
◎ Lysis buffer 配製方法
組成 最終濃度 最初濃度 體積 / 重量
Tris-Hcl（PH:6.8） 6.25 M 0.5 M 5 ml
SDS 2 % 10 % 8 ml
DTT 50 mM 0.3 M 6.67 ml
DDW － － 20.33 ml
總體積 40ml
12.蛋白質定量
為了確定蛋白質的體積濃度，並使其均一化，蛋白質檢量線製作 : 依照下列表格進行檢量線製作
A.加入試劑
蛋白質濃度(ug/ml) DDW(μl) 0.1mg/ml BSA (μl) Baradford（μl） 總體積（μl）
0 800 0 200 1000
5 750 50 200 1000
10 700 100 200 1000
15 650 150 200 1000
20 600 200 200 1000
25 550 250 200 1000
Sample DDW (ul) Sample Bradford (ul) 總體積（μl）
790 10ul 200 1000
先將 ELISA reader 暖機 30 分鐘。依序加入以上藥劑，分別做出 0〜25 μg/ml 的標準品後，混合均勻避光靜置反應 5 min，每個濃度各取 200 μl 放 96 well plate 中，利用 590 nm 波長測定吸光值。吸光值測定時 每個樣本數需 3 重複。用測定出來的標準品吸光質與蛋白質濃度畫出 檢量線，並求出趨勢線方程式。R2值需達>0.99。使用 Excel 軟體繪製 出蛋白質檢量線，算出趨勢線方程式，帶入測得之吸光值(y)，則可求 出蛋白質濃度(μg/ml)。
13.蛋白質電泳（SDS-PAGE）
依照下列配方先配製下層膠。
下層膠(10%Separation gel) 上層膠(5% Stacking gel)
組成 一片量 兩片量 一片量 兩片量
DDW 4.75 ml 9.5 ml 3.04 ml 6.08 ml 1.5M Tris(PH:8.8) 2.5 ml 5.0 ml － － 0.5M Tris(PH:6.8) － － 1.25 ml 2.5ml 10%SDS 100 μl 200 μl 50μl 100 μl 40%Acrylamide/bis(29:1) 2.5 ml 5.0 ml 610 μl 1.22 ml 10%APS 50 μl 100 μl 50 μl 100μl TEMED 10 μl 20 μl 6 μl 12 μl
先把下層膠注入造膠檯內至海綿處，剩餘的空間以酒精滿去除上面的 氣泡並壓平膠之上緣，等待凝固約 30 分鐘，倒掉酒精之後，加入上 層膠，插入 comb 待凝固約 30 分鐘，將 comb 取出後先用 DDW 清洗 well，將膠檯放入電泳槽內裝滿 Running buffer。
loading sample 備製，先加熱（95℃、5 分鐘）立即放置於冰上冷卻 30 秒以上，將 Marker（6μl）和 sample（18〜24 μl）loading 到 well 內，
開始進行電泳實驗。電流如下：利用 100V 跑電泳約 40 分、120V 跑 30 分、150V 跑 20 分，直至 Marker 色帶均勻延展開來。之後準備進 行蛋白質轉漬至 PVDF 膜，取出轉漬過後的下層膠可放入 0.1 % Commassie blue 進行蛋白質染色。
14.西方墨點法（Western blot）
將跑完的 SDS-PAGE 下層膠取下，進行轉漬。PVDF membrane 則需先 用 Methanol 浸潤 30 秒使膜上孔洞張開以利蛋白質轉漬。轉漬設備組 裝膠體放至轉漬夾順序如下：
正極（＋）
負極（-）
將轉漬夾緊密組裝完畢，放入 Transfer box ，內部注滿 Transfer buffer 白底網夾
海綿 Filter paper
PVDF membrane 膠體(gel) Filter paper
海綿 黑底網夾
蓋上蓋子，放置冰桶中，以維持 4℃低溫環境。電流設定 100 valtage、
1 小時。將轉漬後的 PVDF membrane 放入 5 % fat-free milk 室溫 bloclking 1 小時，0.1 % PBST 清洗 10 分鐘，共 3 次。把 membrane 放 入含有一級抗體的封口袋內，4℃冰箱反應隔夜。取出 membrane 放
1 小時。將轉漬後的 PVDF membrane 放入 5 % fat-free milk 室溫 bloclking 1 小時，0.1 % PBST 清洗 10 分鐘，共 3 次。把 membrane 放 入含有一級抗體的封口袋內，4℃冰箱反應隔夜。取出 membrane 放